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收稿日期:2013-04-8; 修订日期:2013-11-18
基金项目:国家自然科学基金 ( No． 81260619 ) ; 广西教育厅高校科研项目 ( No． 201204LX256 ) ; 国家级大学生创新创业训练计划项目( No．
201210601005) ; 广西高校大学生创新创业训练计划项目( No． 599) ; 桂林医学院“项目驱动教学”专项课题( No． 10)
作者简介:余 汇( 1991-) ，男( 汉族) ，江西上饶人，桂林医学院药学院 2009 级临床药学学生，学士学位，主要从事临床药学和药物资源研究工作．
* 通讯作者简介:吴 琼 ( 1969-) ，男( 汉族) ，甘肃陇南人，桂林医学院副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事药用植物资源研究工作．
罗汉果 GAPDH基因的克隆
及其在基因表达分析中的应用
余 汇1，蒋向军2，覃宇燕1，王 骏1，韩艺璇3，吴 琼1*
(1．桂林医学院药学院，广西 桂林 541004; 2．桂林亦元生现代生物技术有限公司，广西 桂林 541004;
3．兰州城市学院，甘肃 兰州 730070)
摘要:目的 克隆罗汉果甘油酸 － 3 －磷酸脱氢酶 ( glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase，GAPDH，EC 1． 2． 1． 12) 基
因，分析其在基因表达定量研究中其作为内部参照基因的可行性。方法 采用同源克隆和 cDNA末端快速克隆技术，以罗
汉果 cDNA为模板扩增 GAPDH 基因的保守区片段。结果 获得了罗汉果 GAPDH 保守区序列 cDNA，命名为 SgGAPDH
( GenBank注册号: KC410810) ，序列长度为 627 bp，编码 209 个氨基酸的多肽。系统发育分析表明，SgGAPDH属于植物甘
油酸 － 3 －磷酸脱氢酶家族。半定量 PCＲ分析表明罗汉果 GAPDH基因在不同组织中表达很稳定。以其作为内部参照基
因，采用实时荧光定量 PCＲ( Ｒeal － time PCＲ) 研究了异戊烯基焦磷酸异构酶( Isopentenyl － diphosphate delta isomerase) 的
组织表达规律。结果显示 SgGAPDH具有良好的扩增效果和重现性。结论 首次克隆了罗汉果 GAPDH基因，明确了该序
列在基因表达分析中的内参照作用，为罗汉果甜苷生物合成基因的研究提供了条件。
关键词:罗汉果; 甘油酸 － 3 －磷酸脱氢酶; 内参基因; 实时荧光定量 PCＲ
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 02． 107
中图分类号:Ｒ2 －031 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 02-0495-04
Cloning and sequence analyses of GAPDH in Siraitia grosvenorii
YU Hui1，JIANG Xiang － jun2，QIN Yu － yan1，WANG Jun1，HAN Yi － xuan3，WU Qiong1*
( 1． Guilin Medical University，College of Pharmacy，Guilin 541004，China; 2． Guilin EraSun Modern Bio － Tech
INC．，Guilin 541004，China; 3． Lanzhou City University，Lanzhou 730070，China)
Abstract: Objective To clone the gene encoding glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase ( GAPDH，EC 1． 2． 1． 12) from
Siraitia grosvenorii，and to evaluate the possibility to use it as endogenous reference genes in quantitative analysis of gene expres-
sion．Methods Glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase from Siraitia grosvenorii has been cloned by homologous cloning
and rapid － amplification of cDNA ends ( ＲACE) ． Ｒesults A core sequence，named SgGAPDH，was obtained with a length of
627bp ( GenBank Ｒegistration No． KC410810) ． Phylogenetic analysis showed SgGAPDH belongs to plant glycerate － 3 － phos-
phate dehydrogenase family． Semi － quantitative ＲT － PCＲ showed that GAPDH gene expression in different tissues is very stable．
With SgGAPDH as an internal reference gene，the tissue expression pattern of isopentenyl － diphosphate delta isomerase was stud-
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ied using real － time quantitative PCＲ ( Ｒeal － time PCＲ) ． Conclusion Ｒesults show that SgGAPDH has good amplification effect
and reproducibility，which laid foundation for the study of the biosynthesis for mogrosides．
Key words: Siraitia grosvenorii; Glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase; Internal control gene; Ｒeal － time flu-
orescence quantitative PCＲ
基因表达定量研究是了解植物代谢机制和分子功能的重要
手段和基础。相比传统的 Northern杂交(Northern blotting)、半定
量 ＲT － PCＲ、基因芯片(microarray)等方法，实时定量 PCＲ(real
－ time PCＲ)准确、快速、可靠、灵敏度高，因而得到了广泛的应
用。然而，由于受初始模板量、ＲNA 完整性、反转录反应效率、
PCＲ反应平行性等诸多因素的影响，实时定量 PCＲ 精确度具有
一定的波动性［1］。为了减小各种因素对定量结果的影响，选择
合适的内部参照基因(endogenous reference genes)显得尤为重要。
内参基因不依组织细胞类型、代谢阶段和实验条件的不同，在各
种组织中以某种水平稳定表达，且在一定的试验条件下可检测，
这对于基因表达结果的精确和标准化具有重要意义［2］。在植物
基因定量表达研究中，内部参照基因通常是一些管家基因，如蛋
白合成与降解、细胞结构、核糖体成分、糖酵解等。甘油醛 － 3 －
磷酸脱氢酶(glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase，GAPDH
或 G3PDH)是糖酵解反应中的一个酶，由 4 个 30 ～ 40kDa的亚基
组成，该酶基因为管家基因(house － keeping genes)，几乎在所有
组织中都稳定表达，被广泛用作 total ＲNA 抽提、蛋白质印迹
(Western Blot)、实时定量 PCＲ等进行标准化处理的工具。
罗汉果(Siraitia grosvenorii (Swingle)C． jeffrey ex Lu et Z． Y．
Zhang)是我国特有的药用植物，具有甜味，被誉为“东方神果”。
它有清热润肺、凉血、润肠通便的功效，特别是用作祛痰剂，在治
疗百日咳、慢性气管炎、感冒、便秘、胃肠小疾等方面疗效显著。
罗汉果的甜味物质为葫芦烷型三萜皂苷成分，甜度约为蔗糖的
250 ～ 300 倍，热量仅为蔗糖的 1 /5，是理想的天然甜味剂。迄今
为止，关于罗汉果活性成分代谢的分子基础研究较少，其甘油酸
－ 3 －磷酸脱氢酶(GAPDH)基因也未见报道。本研究克隆罗汉
果 GAPDH基因序列，并进行生物信息学分析，通过实验研究其
在基因定量表达中作为内部参照基因的可行性，为深入探索罗汉
果皂苷合成酶的功能与作用机制提供条件。
1 材料
1． 1 材料 罗汉果植株 (Siraitia grosvenorii)采自广西桂林兴安
县漠川乡罗汉果栽培基地。选择健康结果植株采集组织材料，切
小块后放入 ＲNALater试剂中，带回实验室后存放在 － 80°C 冰箱
中备用。
1． 2 试剂 Premix Ex Taq 购自 TaKaＲa 公司。pGEM － T Easy
vector 购自 Promega(USA)公司。TOP10 感受态细胞购自天根生
化科技(北京)公司。ＲNA Later Tissue Collection:ＲNA Stabiliza-
tion Solution购自 ABI 公司。总 ＲNA 提取试剂盒购自 Bioteck 公
司。PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (D6210S)购自
TaKaＲa公司。普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒(DP204 － 02)
购自天根生化科技(北京)公司。ＲNaseH、T4DNA Polymerase 购
自 Promega公司。
2 方法
2． 1 总 ＲNA提取和反转录合成一链 cDNA 分别称取罗汉果不
同组织样品约 0． 1 g，采用适用于多糖类物质的方法提取总
ＲNA，获得的总 ＲNA经紫外分光光度计和电泳检测合格后，－ 80
℃保存。利用 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录
合成一链 cDNA。Oligo dT Primer (50 μmol /L )为引物，起始 to-
tal ＲNA为 1 μg，浓度≥0． 5 g / L，反应体系为 20μl，反应产物 －
20℃保存。
2． 2 罗汉果 GAPDH基因的克隆
2． 2． 1 PCＲ扩增 根据 GenBank 中已报道高等植物甘油醛 － 3
－磷酸脱氢酶保守区域设计引物，sense primer:(5＇－ GCTCACTT-
GAAGGGTGG －3＇) ，antisense primer: (5＇－ CCATTCGTTGTCGTAC-
CA － 3＇)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反
应采用 20 μl 体系，包括 Premix Ex Taq 10 μl，正反向引物 (10
M)各 1． 0 μl，模板 1 μl，补足 ddH2O 至 20 μl。PCＲ 反应条件，
95℃预变性 1 min;94 ℃变性 30 s，51 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1
min，进行 30 个循环后 72℃延伸 10 min。配置 1． 0%琼脂糖凝
胶，取 2 μl扩增产物在凝胶成像仪检测。
2． 2． 2 PCＲ产物回收、克隆和测序 PCＲ产物经 1． 0%琼脂糖凝
胶后，在紫外光下切下目的条带，采用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂
盒纯化回收 DNA，操作按试剂盒说明书进行。纯化回收的 DNA
与 pGEM － T Easy Vector 4 ℃连接过夜，连接反应试剂包括:2 ×
Ligation Buffer 5 μl，pGEM － T Easy 1 μl，DNA 3 μl，T4 DNA Ligase
1 μl。重组质粒转化大肠杆菌 Top － 10 感受态细胞，涂布在含有
IPTG 和 X － gal 的 LB平板上(含 100 μg /ml Ampicilin)筛选阳性
克隆。37 ℃培养 12 ～ 16 h，随机挑取 6 个白色菌落，经 PCＲ扩增
验证为阳性克隆后送样测序。测序由生工生物工程(上海)股份
有限公司完成。
2． 3 序列分析 所获得的序列通过 BLASTX搜索 National Center
for Biotechnology Information(NCBI)蛋白质数据库，并经 Lasergene
7 软件翻译后查找开放阅读框。运用 Clustal W 全局比对和
MEGA4 进行系统进化分析。建树方法采用 neighbor － joining
method (NJ)，计算距离的替代模型 (Substitution Model)采用泊
松校验 (Poisson correction)。在自展分析 (bootstrap)中，重复次
数 (Ｒeplication)设定为 1，000 次，bootstrap 值标注在该分支近
旁，bootstrap值小于 50%的没有显示。分析物种序列的检索号如
下:AAA33352 (Ginkgo biloba)，AAA33780 (Pinus sylvestris) ，
AAA89207 (Taxus baccata) ，AAQ57193 (Panax ginseng) ，
AAＲ84410 (Daucus carota) ，ABA29020 (Panax notoginseng) ，
ADN87333 (Eleutherococcus senti) ，NP 001105385 (Zea mays) ，
BAC76899 (Solanum lycopersicum) ，BAD72793 (Pinus thunber-
gii) ，NP173080 (Arabidopsis thaliana) ，XP003547755 (Glycine
max) ，XP003596039 (Medicago truncatula) ，XP002263263 (Vitis
vinifera) ，XP002511235 (Ｒicinus communis)和 SgGAPDH(本研
究)。
2． 4 相对定量 PCＲ 利用罗汉果 GAPDH 保守区段设计引物
sense primer 和 antisense primer 作为相对定是 PCＲ 引物，sense
primer:(5＇－ GCTCACTTGAAGGGTGG －3＇) ，antisense primer:(5＇－
CCATTCGTTGTCGTACCA － 3＇) ，扩增序列长度为 627 bp。PCＲ反
应体系采用 20 μl 体系，包括 Premix Ex Taq 10 μl，正反向引物
(10 μmol /L)各 0． 8 μl，模板 0． 5 μg，补足 ddH2O至 20 μl。PCＲ
反应条件，95 ℃预变性 1 min;94℃变性 30 s，55℃退火 30 min，
72℃延伸 1 min，进行 35 个循环后 72 ℃延伸 5 min。配置 1． 0%
琼脂糖凝胶，取 3 L扩增产物在凝胶成像仪检测。
2． 5 实时定量 PCＲ (Ｒeal － time PCＲ)
2． 5． 1 实时定量 PCＲ的引物设计 采用 Primer Express (Applied
Biosystems)设计成对引物，扩增片段长度在 150bp以内。引物设
计:SgGAPDH_Q_1s:CCCCCTCTCCAATCCTTCA，SgGAPDH_Q_1a:
TGCAACGACAGCAACACAAA，扩增序列长度为 60bp。引物位于
序列 360 － 419 区段，经普通 PCＲ 预扩增检测，引物扩增条带清
晰，无杂带干扰。采用罗汉果皂苷合成途径上游 IPI 基因作为待
检基因，采用 Primer Express (Applied Biosystems)设计定量 PCＲ
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引物，SgIPI_Q_1s:5＇－ TCCCCTCGGTCGTATGCTAT － 3＇，SgIPI_Q_
1a:5＇－ TCATGCTCCCCCCATTTG － 3＇，扩增序列长度为 57bp，经普
通 PCＲ预扩增检测，引物扩增条带清晰。
2． 5． 2 实时定量 PCＲ(Ｒeal － time PCＲ)采用 TaKaＲa 公司 Pri-
meScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，分别以 1 μg 左右根、
茎、叶片、花、果实 total ＲNA反转录合成 1st cDNA 作为模板。采
用 Power SYBＲ Green PCＲ Master Mix (Applied Biosystems)进行
实时定量 PCＲ反应，反应在 ABI Prism 7500 型荧光定量 PCＲ仪
(Applied Biosystems，USA)上进行。反应体系为 20 μl，包括 Power
SYBＲ Green PCＲ Master Mix (2 ×)10 μl、正向和反向引物 2
μl，template cDNA 1 μl，补足 ddH2O 至 20 μl。实时定量 PCＲ 反
应循环条件如下:50°C for 2 min→ 95°C for 10 min→ 40 × (95°C
for 15 s→ 60°C for 1 min)。
2． 5． 3 数据处理 基因相对表达水平通过比较目标基因与管家
基因 GAPDH的 Ct值来衡量，采用 2 －△△Ct方法进行计算［3］。
3 结果
3． 1 罗汉果总 ＲNA质量分析与反转录 按照适用于多糖材料的
方法，分别以根、茎、叶、花、果实等组织样品为材料提取罗汉果不
同组织总 ＲNA。吸取 2 μl已经抽提的总 ＲNA进行电泳检测，28
S和 18 S条带明亮，5S条带较明显，总 ＲNA无降解，无蛋白污染
(图 1)。运用紫外分光光度计测定，总 ＲNA 得率在 376 ～ 616
ng /μl之间，A260 /A280值在 1． 8 ～ 2． 0 左右，表明获得的总 ＲNA 具
有较高的质量，纯度和浓度达到了实验的要求。采用 PrimeScript
II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录合成一链 cDNA，Prime-
Script II ＲTase反转录酶可以极大限度地抑制 ＲNA 高级结构与
反转录酶的非特异性结合，对于以结构复杂的 ＲNA 或长链 ＲNA
为模板进行 cDNA合成较为有利。
1． Ｒoot 2． Leaf 3． Stem 4． Fruit 5． Flower
图 1 罗汉果总 ＲNA电泳图
3． 2 罗汉果 GAPDH基因的扩增与克隆 以罗汉果总 ＲNA 反转
录获得的 cDNA 为模板，采用 sense primer 和 antisense primer 作
为引物，进行 PCＲ 扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测获得大小为
650bp的条带(图 2)，大小与预期片段长度相近。对目的条带进
行片段回收，重组连接到 pGEM － T easy Vector 进行亚克隆，经
PCＲ检测插入片段大小正确，表明基因片段已经与载体连接，转
化并摇菌后进行克隆测序。克隆测序后获得与 ＲT － PCＲ长度一
致的序列。
M － DNA Marker DL2000
图 2 罗汉果 GAPDH基因 ＲT － PCＲ结果电泳图
3． 3 罗汉果 GAPDH 基因的生物信息学分析 测序结果表明扩
增的 GAPDH基因片段长度为 627 bp，编码 209 个氨基酸。与
GenBank中蛋白质数据库的比对分析，该片段核苷酸序列与拟南
芥、蒺莉苜蓿、刺五加 GAPDH核苷酸序列的同源性分别为 93%、
91%、83%。初步鉴定为罗汉果 GAPDH 基因核心片段，并命名
为 SgGAPDH。为了进一步了解该序列的结构与功能，构建了基
于 neighbor － joining method (NJ)包括 16 个植物甘油酸 － 3 －磷
酸脱氢酶(GAPDH)系统发育树(图 3)。通过重复次数(Ｒeplica-
tion)为 1，000 次的自展分析(bootstrap)，来自 16 种植物的 GAP-
DH分为两个大的分支，一支仅包括裸子植物长白松(Pinus syl-
vestris)和日本黑松(Pinus thunbergii);另一支包括了其它 14 种
高等植物，其中又可以划分为两个次级分支，罗汉果 SgGAPDH
与拟南芥、蒺莉苜蓿等的甘油酸 － 3 －磷酸脱氢酶系统起源较近。
在这个大的分支中，还包括了人参(Panax ginseng)、三七(Panax
notoginseng)、刺五加(Eleutherococcus senticosus)等药用植物的
GAPDH基因。系统进化分析表明 SgGAPDH 属于植物 GAPDH
基因家族。该序列已提交 GenBank，注册号为 KC410810。通过
数据库检索，在 GenBank 中未查询到罗汉果 GAPDH 基因的序
列，本实验首次扩增和报道了罗汉果 GAPDH基因的 cDNA序列。
图 3 植物甘油酸 － 3 －磷酸脱氢酶(GAPDH)系统发育分析
3． 4 罗汉果 GAPDH基因组织表达半定量分析 为了解 GAPDH
基因在罗汉果不同组织中的表达情况，进行了半定量 PCＲ 扩增
(图 4)。结果表明，罗汉果 GAPDH 基因在 5 种组织中均获得了
清唽单一的条带，无非特异性扩增，引物二聚体很少，扩增序列长
度与预期大小相符，测序结果与目的片段相同。作为看家基因，
GAPDH基因在不同组织中的表达稳定，可以初步选定为罗汉果
基因定量表达的内部参照基因。
1． Ｒoot 2． Leaf 3． Stem 4． Fruit 5． Flower
图 4 罗汉果 GAPDH基因在 5 种不同组织中半定量 PCＲ电泳图
3． 5 定量 PCＲ分析 实时定量 PCＲ(Ｒeal － time PCＲ)中，由于
荧光信号的产生和检测与 PCＲ 扩增过程密切相关，被测产物的
数量与起始模板拷贝数直接相关，通过测量每次循环产生的荧光
信号强度，并参照内参基因的标准曲线来定量，具有特异性强，可
信度高的特点，是基因定量表达的金标准。罗汉果甜苷属于类异
戊二烯化合物，是由基本的 C5 单元 －异戊烯基焦磷酸(isopente-
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nyl diphosphate，IPP)与其活性异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dime-
thylallyl pyrophosphate，DMAPP)缩合后经一系列催化反应而形
成。其中，IPP和 DMAPP 两个活性异构体的转化由异戊烯基焦
磷酸异构酶(Isopentenyl － diphosphate delta isomerase，IPI，EC:5．
3． 3． 2)催化［4］。IPI 是异戊二烯衍生物合成途径中的核心酶。
为了探讨罗汉果甜苷合成中 IPI 基因的空间表达模式，我们以
GAPDH为内部参照基因，采用实时荧光定量 PCＲ技术研究 SgIPI
在转录水平上的基因表达量。PCＲ作预扩增检测定量 PCＲ内参
基因和目的基因引物效率与特异性，扩增子大小分别为 60bp 和
57bp，特异性符合要求，与设计一致。以罗汉果根、叶、茎、果实和
花为材料，提取 1 － st cDNA 为模板进行了实时定量 PCＲ 扩增。
数据取四次重复的平均值，标准偏差用误差条显示在柱图上。结
果表明，各种组织样品熔解曲线在 76． 91℃有一个单一的峰
(图 5)，各组织样品扩增到 GAPDH 基因，具有良好的特异性。
以此为内参，获得了 SgIPI的组织表达情况。SgIPI在叶片中高丰
度表达，其次在花和果实中表达量也很高，在根和茎中表达丰度
较低(图 6)。
图 5 5 种组织样品 GAPDH基因扩增熔解曲线
图 6 罗汉果 IPI基因在不同组织中定量表达结果
4 讨论
植物次生代谢途径关键酶基因的特异性表达是调控次生代
谢产物合成的重要因素。时间进程和空间分隔是代谢产物积累
的重要特点，植物组织发育时序和特定组织细胞的区域化分隔对
中间代谢物流向和终产物积累起着决定作用。由于研究技术的
限制，人们目前对基因表达的微观时空了解还很有限。特定部位
基因表达的精确化和定量化，对于研究次生代谢的网络和调控机
制具有重要意义。在植物基因表达定量研究中要取得稳定、准
确、标准化的结果，内源参照基因的获得是先决条件。
甘油醛 － 3 －磷酸脱氢酶(GAPDH)是植物细胞基本代谢的
一个关键酶，参与糖酵解中甘油醛 － 3 －磷酸的氧化和磷酸化，生
成 1，3 －二磷酸甘油酸，产生糖酵解过程中的第 1 个 ATP，被认
为是植物体的看家基因(house － keeping genes)［5］。GAPDH基因
在生物体不同组织细胞、同一组织细胞的不同生理阶段下表达稳
定，故而在定量 PCＲ分析中常被选作内部参照基因，在高等植物
和其它物种得到了广泛的应用［6 ～ 9］。在药用植物中应用还较少，
仅在西洋参、三七、刺五加、银杏、金线兰等有所报道［10 ～ 14］。
果实是罗汉果的传统药用部位，也是罗汉果甜苷的累积部
位。虽然在各个部位中 SgIPI均有表达，但在果实中表达量明显
高于根和茎中的表达量，这与罗汉果甜苷在果实中的含量累积相
一致，暗示了 SgIPI的表达对不同部位中罗汉果甜苷合成的直接
影响。作为萜类和植物甾醇合成的前体，IPI 调节主要代谢和次
生代谢的碳流。结果还显示叶片不仅光合作用主要部位，也是促
进碳流进入甾醇和三萜途径的主要调节部位。但是在多数植物
体内存在两种 IPI来维持不同亚细胞部位 IPP和 DMAPP的适当
水平［15］。因此，下一步还需要在获取 SgIPI多个拷贝的基础上进
一步研究其在罗汉果甜苷的合成中的功能差异，以全面了解次生
代谢网络和调节。
综上所述，本文首次克隆了罗汉果 GAPDH 基因，在生物信
息学分析的基础上，研究了它作为定量表达内部参照基因的可行
性，并分析了罗汉果 SgIPI 基因的组织表达特性，发现了罗汉果
甜苷生物合成途径中期基因的特异性表达规律，为罗汉果种质培
育和遗传改良、利用植物基因工程技术改善中药材品质提供了依
据。
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 2 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 2