全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 16 期 2015 年 8 月

• 2449 •
• 药材与资源 •
接骨草 HMGR 基因 cDNA 克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析
姚元枝，黎晓英，郭文博，刘 宇，魏 麟*
怀化学院 生物与食品工程学院 民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室 湘西药用植物与民族植物学湖南省高
校重点实验室，湖南 怀化 418008
摘 要：目的 克隆接骨草 Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）基因并分析其差异表达。方法
采用 RT-PCR 方法获得 HMGR 基因 cDNA 序列，并对 HMGR 蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析，并预
测该蛋白功能；利用实时荧光定量 PCR 方法检测 HMGR 基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果 克
隆获得的 HMGR 基因 cDNA 全长为 1 626 bp，编码 593 个氨基酸。生物信息学预测 HMGR 蛋白含 2 个跨膜区，不含信号肽。
HMGR 基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高，其他器官表达相对较低。结论 首次从接骨草中克隆了 HMGR 基因，
为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。
关键词：接骨草；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶；实时荧光定量 PCR；cDNA 序列；萜类化合物
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)16 - 2449 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.16.019
Molecular cloning, differential expression, and bioinformatics analysis of HMGR
gene in Sambucus chinensis
YAO Yuan-zhi, LI Xiao-ying, GUO Wen-bo, LIU Yu, WEI Lin
Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Key Laboratory of Xiangxi
Medicinal Plant and Ethnobotany of Hunan Higher Education, College of Biological and Food Engineering, Huaihua University,
Huaihua 418008, China
Abstract: Objective To clone the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A redutase (HMGR) gene from Sambucus chinensis and
analyze the differential expression. Methods The sequence of HMGR was cloned from S. chinensis by using RT-PCR strategy. The
physical and chemical properties, secondary structure, and tertiary structure of the HMGR protein were forecasted and analyzed, and its
structure and function were predicted. And the different expression of HMGR gene in the rhizome, stems, leaves, and flowers was
analyzed by fluorescent quantitative PCR. Results The cDNA contains a 1 782 bp open reading frame and encodes a predicted protein
of 593 amino acids. Two transmembrane regions and no signal peptide were present in HMGR. Relative real-time PCR analysis
indicated that HMGR showed the higher transcript abundance in the flowers and aerial stems, and the lower levels in the rhizomes and
leaves. Conclusion This study clones and expression analyzes HMGR gene from S. chinensis for the first time. The results will
provide a foundation for exploring the mechanism of terpenoid biosynthesis in S. chinensis.
Key words: Sambucus chinensis Lindl.; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A redutase; RT-PCR; cDNA sequence; terpenoids

接骨草 Sambucus chinensis Lindl. 又名陆英、八
棱麻、蒴藋等，属于忍冬科（Caprifoliaceae）接骨
木属 Sambucus L. 多年生草本植物，在我国分布广
泛，资源丰富。接骨草主要用于治疗跌打损伤，是
一种传统中草药，近年研究发现其有抗氧化[1]、抗
病毒[2]和抗肿瘤[3]等功效，尤其是治疗黄疸型和病
毒性肝炎，效果显著且无毒性[4]。研究认为乌索酸
是接骨草治疗肝炎的主要活性成分[5]，齐墩果酸能
有效治疗传染性黄疸肝炎[6]。乌索酸和齐墩果酸均
属萜类化合物。在高等植物中，萜类化合物主要由

收稿日期：2015-03-04
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30870230）；湖南省科技计划项目（2015SK2013，2013FJ6090）；民族药用植物资源研究与利用湖
南省重点实验室开放基金项目（ZDSYSJJ2013-2）
作者简介：姚元枝（1965—），女，硕士，副教授，研究方向为植物资源评价与分子生物学。Tel: (0745)2851037 E-mail: hhyaoyz@163.com
*通信作者 魏 麟，博士，副教授，主要从事分子生物学研究。Tel: (0745)2851037 E-mail: hhweilin@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 16期 2015年 8月

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甲羟戊酸（MVA）途径合成，MVA 为萜类合成的
前体。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A还原酶（HMGR）
是MVA途径中的首个重要限速酶，催化 3-羟基-3-
甲基戊二酰辅酶 A不可逆的形成 MVA，是萜类物
质代谢中的关键调控位点[7]。目前，已在大戟[8]、
茅苍术[9]、桑[10]、球药隔重楼[11]、建泽泻[12]、秦
艽[13]、南京椴[14]、刺五加[15]、雷公藤[16]、人参[17-18]
等药用植物中成功分离、克隆得到 HMGR 基因，
然而接骨草 HMGR基因未见相关报道。
本研究拟克隆接骨草 HMGR基因 cDNA序列，
利用生物信息学对其推导的氨基酸序列进行分析，
检测该基因在不同组织器官中的表达特异性。为进
一步研究该基因的分子调控机制并阐明其在接骨草
萜类合成途径中的重要作用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品于 2014年 6月 5日采自怀化学院植物种植
园，经怀化学院伍贤进教授鉴定为接骨草 Sambucus
chinensis Lindl. 的根状茎、地上茎、叶片、花，洗
净后，乙醇擦拭，经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水
及蒸馏水冲洗后，放入液氮中保存，带回实验室，
于−80 ℃冰箱保存备用。
RNA 提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒、高保真
DNA聚合酶 Prime STARHS DNA Polymerase、克隆载
体 pMD 18-T Vector、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化
试剂盒、菌种JM109、DNA相对分子质量标记，T4 DNA
连接酶、荧光定量试剂盒 SYBR Prime ScriptTM RT-PCR
Kit及电泳类试剂等，均购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 接骨草根状茎、地上茎、叶片
及花 RNA 提取方法按照 Trizol 试剂说明书进行，
提取后进行电泳检测，测定纯度及浓度；并于
−80 ℃保存备用。
1.2.2 cDNA 链合成 根据试剂盒说明书进行，反
转录产物合成后置于−20 ℃保存备用。
1.2.3 引物设计 通过分析接骨草高通量转录组数
据，发现一个被注释为 HMGR 的转录本，同已报
道的其他植物[长春花（M96068）、马铃薯（L01400）、
龙虎草（EF062569）、蒲公英（HQ857601）]HMGR
基因的核苷酸序列进行比对，应用 Oligo 6 软件设
计引物。上游引物 HMGR-F：5’-ATGGACGTCCGA-
CGGCGATCA-3’；下游引物 HMGR-R：5’-TTAAG-
AGGCAGCTTTGGTGAT-3’，由生工生物工程（上
海）股份有限公司合成。
1.2.4 PCR 扩增 反应体系和反应条件参照文献报
道[19]，其中退火温度为 58 ℃。
1.2.5 扩增片段的克隆测序、序列分析及 HMGR
生物信息学分析 对 PCR产物进行回收，连接载体
pMD 18-T Vector，并转化感受态细胞 JM109，蓝白
筛选后，过夜培养白色菌落，提取质粒并鉴定，然后
送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用
DNAStar 软件包分析与处理序列，在 NCBI 网站上
Blast 比对及 BioEdit 软件分析，并用 Mega6 软件[20]
进行 UPMAG 聚类分析。采用 ExPASy Proteomics
Server提供的在线工具对接骨草HMGR基因编码蛋
白的理化性质及结构与功能进行预测[21-23]。
1.2.6 相对荧光定量 PCR 表达分析 利用实时荧
光定量 PCR的方法检测 HMGR基因在接骨草根状
茎、地上茎、叶、花中的相对表达量，采用美国
ABI7500实时 PCR检测系统，上游引物 qHMGR-F
序列为：5’-CTCTTCTTCTCCGTGGTT-3’，下游引
物 qHMGR-R序列为：5’-GTAGATAAGGGTATGG-
GTTC-3’。实时 PCR 检测的反应体系如下：5 μL
2×SYBR® Premix Ex TaqTM，正反向引物均为 0.3 μL，
cDNA模板 2 μL；加 ddH2O至 10 μL，反应程序：95 ℃ 、
5 min，95 ℃ 、20 s，58 ℃ 、20 s，72 ℃ 、30 s，40个
循环，实时 PCR反应以接骨草 18 S rDNA为内参，18
S rDNA序列设计引物18S-F：5’-CGGAAGGTCTGGG-
TAATC-3’和18S-R：5’-ACGTAATCAACGCAAGCT-3’，
产物大小为 147 bp，每个反应重复 3次。
2 结果与分析
2.1 接骨草 HMGR基因克隆
以总 RNA 反转录所得到的第一链 cDNA 为模
板，用引物 HMGR-F和 HMGR-R进行 PCR扩增。
电泳检测发现在 1 782 bp处有一条亮带，见图 1。

M-Marker 1-PCR产物
M-Marker 1-PCR products
图 1 接骨草 HMGR的 PCR扩增
Fig. 1 PCR amplification of HMGR of S. chinensis

M 1
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp

250 bp

100 bp
1 780 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 16 期 2015 年 8 月

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对扩增产物进行测序，其结果经 Blast 确定为
接骨草 HMGR 基因序列，经 ORF Finder 预测，该
序列含有一个完整的开放阅读框，推测编码 593 个
氨基酸，见图 2。
2.2 接骨草 HMGR 基因编码蛋白特性分析
2.2.1 理化性质与细胞定位 接骨草 HMGR 基
因预测编码 593 个氨基酸，利用 ExPASy 在线软
件对其蛋白的理化性质进行预测分析。推测其分
子式为 C2508H4047N681O764S26，相对分子质量为
56 798.3，等电点（pI）为 5.97。该蛋白的不稳
定系数（instability index）为 36.89，属于稳定蛋
白质。脂肪系数（aliphatic index）为 98.09，亲
水性系数（grand average of hydropathicity）为
0.143，该蛋白不含信号肽，但含 2 个跨膜区，第
1 个跨膜区是第 32～54 位，第 2 个跨膜区是第
489～511 位（图 3）。
2.2.2 接骨草 HMGR 的二级结构及三级结构预测
预测 HMGR 蛋白的二级结构如图 4 所示，该蛋白的
二级结构中 α-螺旋占 46.21%、β-折叠占 6.65%、无规
则 卷 曲 占 32.72% 、 延 伸 链 占 14.42% 。 由
SWISS-MODEL预测HMGR的三级结构如图5所示。
2.3 接骨草 HMGR 氨基酸序列的同源性及亲缘关
系分析
推导氨基酸序列比较结果表明，接骨草 HMGR
与橡胶树（BAF98282）、长春花（AAA33108）、
马铃薯（AAA93498）、龙虎草（ABK56831）、蒲
公英（AEA92686）、球药隔重楼（AGC13078）、
罗汉果（AEM42971）、青钱柳（ABX82838）和红
豆杉（AAQ82685）HMGR 蛋白质分子的相似度分
别为 75.3%、74.9%、74.0%、72.2%、71.8%、70.6%、
69.6%、69.5%和 62.1%，不同物种 HMGR 氨基酸序
列同源性在 62.1%～75.3%。UPMAG 聚类分析表
明，接骨草与长春花和马铃薯亲缘关系最近，与红
豆杉亲缘关系最远，见图 6。

划框部分为 HMGR 结合基序；划实线部分为 NADPH 结合基序
HMGR binding motif segment marked with frame, NADPH binding motif segment marked with full line
图 2 接骨草 HMGR 基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleic acid sequence and supposed amino acid sequence of HMGR gene fragment of S. chinensis
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图 3 接骨草 HMGR 跨膜预测
Fig. 3 Prediction of transmembrane regions of HMGR protein


蓝色-α-螺旋 红色-β-折叠 绿色-延伸链 紫色-无规则卷曲
blue-α-helix red-β-turn green-extended strand purple-random
coil
图 4 HMGR 蛋白二级结构预测图
Fig. 4 Secondary structure prediction of HMGR protein

图 5 HMGR 蛋白三级结构预测图
Fig. 5 Tertiary structure prediction of HMGR protein

图 6 接骨草与其他植物 HMGR 的 UPGMA 进化树
Fig. 6 UPGMA dendrogram of HMGR of S. chinensis and
other plants
2.4 接骨草 HMGR 基因的表达分析
利用实时荧光定量 PCR 检测 HMGR 基因在根
状茎、地上茎、叶、花等器官中的表达特异性，结
果表明该基因主要在花和地上茎中表达，在叶中的
表达量较低，根状茎的表达量最低（图 7）。

图 7 接骨草不同组织中 HMGR 基因的相对表达量
Fig. 7 Relative quantity of HMGR expression in different organs
of S. chinensis
3 讨论
植物萜类化合物具有重要的商业价值，被广
泛用于工业、医药卫生等领域[24]。萜类化合物是
绝大部分中药材的重要药用成分，HMGR 在萜类
化合物合成途径中发挥重要作用。许多学者对其
生物学功能进行了研究，Enfissi 等 [25]将拟南芥
hmgr-1 基因转入番茄，发现甾醇量提高 2.4 倍；
Schaller 等[26]将橡胶树 hmg1 基因转入烟草，发现
HMGR 的活性增加了 4～8 倍，且甾醇量增加 6
倍；武莹等[16]证明雷公藤 HMGR 基因的表达可能
调控着萜类物质的合成代谢；Alam 等 [27]克隆
HMGR 基因，在黄花蒿中过表达并分析其活性对
青蒿素量的影响，结果发现青蒿素含量的增加与
HMGR 的活性相关；Wang 等[28]在拟南芥中过表
达印度芥菜 HMGS 基因，发现拟南芥 HMGR、
SMT2、DWF1、CYP710A1 和 BR6OX2 等基因表
达上调，同时甾醇量明显增加。在药用植物中，
HMGR 作为萜类化合物合成途径中的关键酶，其
活性高低与量的多少决定着许多有效药用活性成
分产量的多少。如何利用 HMGR 的表达提高有效
药用活性成分在植株中的量，将成为提高中药材
品质的有效手段。
本研究利用 RT-PCR 技术首次克隆了接骨草
HMGR 基因的全长 cDNA 序列，其完整开放阅读框
为 1 782 bp，编码 593 个氨基酸。对推导的氨基酸
序列的结构和功能进行生物信息学分析，发现其氨
预
测
值

0 100 200 300 400 500
transmembrane inside outside
长春花（AAA33108）
马铃薯（AAA93498）
接骨草
罗汉果（AEM42971）
龙虎草（ABK56831）
橡胶树（BAF98282）
球药隔重楼（AGC13078）
蒲公英（AEA92686）
青钱柳（ABX82838）
红豆杉（AAQ82685）
1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0
H
M
G
R
相
对
表
达
量

根状茎 花 地上茎 叶
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500
0.15 0.10 0.05 0
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基酸序列长短与其他植物相近，HMGR 蛋白特有的
４个保守的活性位点，2 个 HMGR-CoA 结合位点
（EMPVGYVQIP 与 TTEGCLVA）（图 2 中划框部
分）和 2 个 NADP（H）结合位点（DAMGMNM 与
GTVGGGT）[29]（图 2 中划实线部分），提示接骨
草 HMGR 蛋白质功能与其他植物的功能相类似。
不同植物中 HMGR 蛋白质行使相似的功能，说明
不同植物的 HMGR 分子结构可能十分相似，从接
骨草 HMGR 氨基酸序列与其他植物的 HMGR 同源
性比较得到的结果，发现该蛋白在不同物种进化过
程中具有一定的保守性，也提示 HMGR 蛋白质在
不同植物生命活动过程中所发挥的作用基本相似。
本研究结果，将为进一步构建接骨草 HMGR
基因过表达载体和遗传转化体系，为实现重要药用
活性成分在植株中高效表达，为开展接骨草及类似
以萜类化合物为主要药用活性成分植物药的药材品
质改善奠定基础。
参考文献
[1] 吴丽霞, 吴铁松, 郑 敏. 陆英煎剂对小鼠镇痛作用的
实验研究 [J]. 今日药学, 2012, 22(8): 481-483.
[2] 王文静, 王 军, 饶高雄. 接骨草的两种提取物对小鼠的
抗炎镇痛作用 [J]. 华西药学杂志, 2011, 26(3): 247-249.
[3] 农朝赞, 黄华艺. 黄酮类化合物抗肿瘤作用的研究应
用 [J]. 中国药房, 2004, 15(9): 568-569.
[4] 王明时, 李景荣, 徐丽仙, 等. 陆英抗肝炎活性成分的
化学研究 [J]. 南京药学院学报, 1985, 16(3): 15.
[5] 黄电波, 黄清松. 陆英与乌索酸对大鼠全血黏度和红细
胞沉降率的影响 [J]. 实用临床医学, 2012, 13(6): 10-12.
[6] 曾琳玲, 杨 威, 王茜莎, 等. 陆英颗粒对 CCl4致小鼠
急性肝损伤保护作用研究 [J]. 中国实用医药, 2007,
2(22): 12-14.
[7] Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the
isoprenoid biosynthetic pathway in plants [J]. Plant Mol
Biol, 1995, 46(1): 521-547.
[8] 曹小迎, 蒋继宏, 刘 群, 等. 大戟甲羟戊酸途径关键酶
基因 hmgr [J]. 武汉植物学研究, 2007, 25(2): 123-126.
[9] 刘 群, 曹小迎, 蒋继宏, 等. 茅苍术 HMGR 基因保守区
片段的克隆与分析 [J]. 中草药, 2007, 38(10): 1551-1554.
[10] 雷 桅, 汤绍虎, 周启贵, 等. 桑萜类生物合成酶 HMGR
的生物信息学分析 [J]. 蚕业科学, 2008, 34(3): 393-399.
[11] 江雪梅, 刘学端, 尹华群, 等. 球药隔重楼HMGR功能
基因保守区序列的克隆与分析 [J]. 中草药 , 2011,
42(6): 1190-1193.
[12] 谷 巍, 席蓓莉, 吴启南, 等. 建泽泻HMGR 基因保守区片
段克隆与组织分布研究 [J]. 中药材, 2011, 34(9): 1335-1339.
[13] 郑 鹏, 化文平, 王喆之. 秦艽HMGR基因家族的克隆及
序列分析 [J]. 陕西师范大学学报, 2012, 40(6): 67-72.
[14] 郑竹君, 曹小迎, 刘 群, 等. 南京椴HMGR基因的克
隆和功能验证 [J]. 植物研究, 2012, 32(2): 198-203.
[15] 邢朝斌, 吴 鹏, 龙月红. 刺五加 HMGR 基因的克隆
与 表 达 分 析 [J]. 江 苏 农 业 学 报 , 2012, 28(6):
1258-1262.
[16] 武 莹, 李 威, 祝传书, 等. 雷公藤 HMGR 基因克
隆、序列分析及诱导表达 [J]. 西北农林科技大学学报,
2012, 40(11): 103-111.
[17] 郜玉钢, 杨 鹤, 于 英, 等. 人参 HMGR 基因的克隆与
序列分析 [J]. 吉林农业大学学报, 2010, 32(5): 500-504.
[18] 罗红梅, 宋经元, 李雪莹, 等. 人参皂苷合成生物学关
键元件 HMGR 基因克隆与表达分析 [J]. 药学学报,
2013, 48(2): 219-227.
[19] 付 明, 魏 麟, 余 娟, 等. 显齿蛇葡萄查耳酮合成
酶基因 cDNA 克隆及蛋白质序列分析 [J]. 中草药,
2013, 44(1): 85-89.
[20] Koichiro T, Glen S, Daniel P, et al. MEGA6:Molecular
evolutionary genetics analysis Version 6.0 [J]. Mol Biol
Evol, 2013, 30(12): 2725-2729.
[21] Arnold K, Bordoli L, Kopp J, et al. The SWISS-MODEL
workspace: A web-based environment for protein structure
homology modeling [J]. Bioinformatics, 2006, 22(2): 195-201.
[22] Schwede T, Kopp J, Guex N, et al. SWISS-MODEL:an
automated protein homology-modeling server [J]. Nucl
Acids Res, 2003, 31(13): 3381-3385.
[23] Guex N, Peitsch M C. SWISS-MODEL and the
Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein
modeling [J]. Electrophoresis, 1997, 18(15): 2714-2723.
[24] 占爱瑶, 由香玲, 詹亚光. 植物萜类化合物的生物合成
及应用 [J]. 生物技术通讯, 2010, 21(1): 131-135.
[25] Enfissi E M A, Fraser P D, Lois L M, et al. Metabolic
engineering of the mevalonate and non-mevalonate
isopentenyl diphosphate-forming pathways for the produ
ction of health-promoting isoprenoids in tomato [J]. Plant
Biotechnol J, 2005, 3(1): 17-27.
[26] Schaller H, Grausem B, Benveniste P, et al. Expression of the
Hevea brasiliensis (H.B.K.) Mull. arg. 3-hydroxy-3-methyl
glutaryl-coenzyme A reductase 1 in tobacco results in sterol
overproduction [J]. Plant Physiol, 1995, 109(3): 761-770.
[27] Alam P, Abdin M Z. Over-expression of HMG-CoA
reductase and amorpha-4,11-diene synthase genes in
Artemisia annua L. and its influence on artemisinin
content [J]. Plant Cell Rep, 2011, 30(10): 1919-1928.
[28] Wang H, Nagegowda D A, Reetika R, et al.
Overexpression of Brassica juncea wild-type and mutant
HMG-CoA synthase 1 in arabidopsis up-regulates genes
in sterol biosynthesis and enhances sterol production and
stress tolerance [J]. Plant Biotechnol J, 2012, 10(1):
31-42.
[29] Caelles C, Ferrer A, Balcells L, et al. Isolation and
structural characterization of a cDNA encoding Arabidopsis
thaliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme Areductase
[J]. Plant Mol Biol, 1989, 13(6): 627-638.