全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 307 •
蟾酥抗肿瘤有效成分的活性追踪分离及急性毒性研究
于垂亮，侯惠民*
上海医药工业研究院 药物制剂国家工程研究中心，上海 201203
摘 要：目的 从传统中药蟾酥中寻找抗肿瘤活性强而毒性低的化合物。方法 采用追踪分离的方式，以体外肿瘤细胞生长
抑制强度为活性指标，同时结合小鼠急性毒性实验，对蟾酥的主要化学成分进行初步研究。结果 采用活性追踪分离方式，
从蟾酥中分离得到具有抑制肿瘤细胞生长活性同时对小鼠急性毒性较低的化合物蟾毒它灵，其对人非小细胞肺癌 A549 细胞
具有较好的生长抑制作用，小鼠 iv 给药的 LD50约为蟾毒灵的 4 倍，而且稳定性较好。结论 综合化合物的活性、毒性及稳
定性等因素，初步判断蟾毒它灵较其他同类化合物具有更好的抗肿瘤药物开发前景。
关键词：蟾酥；蟾毒它灵；抗肿瘤；急性毒性；蟾毒灵
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)02 - 0307 - 05
Bioassay-guided separation and acute toxicity evaluation of antitumor ingredient
in Bufonis Venenum
YU Chui-liang HOU Hui-min
National Pharmaceutical Engineering and Research Center, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China
Abstract: Objective To obtain antitumor active compounds with lower toxicity from main ingredients of Chinese materia medica
Bufonis Venenum. Methods Taking inhibition of in vitro tumor cells as active indexes, a bioassay-guided separation and toxicity
evaluation in mice of ingredients in Bufonis Venenum were applied. Results Bufotalin was seperated from Bufonis Venenum with
significant inhibition and lower acute toxicity by active tracking method. The inhibitory effect on the proliferation of A549 was better,
LD50 of bufotalin by iv administration to mice is about four times of bufalin, and bufotalin is stable. Conclusion Integrated the
activity, toxicity, and stability factors of the compounds, bufotalin from Bufonis Venenum will deserve further research than any other
similar compounds in potential antitumor activity.
Key words: Bufonis Venenum; bufotalin; antitumor; acute toxicity; bufalin

蟾酥 Bufonis Venenum 为中华大蟾蜍 Bufo bufo-
gargarizans Cantor 或黑眶蟾蜍 B. melanostictus
Schneider 耳后腺分泌的白色浆液加工干燥而成的
固体[1]，蟾蜍及蟾酥在我国有着悠久的药用历史。
蟾酥性温，味甘、辛，有毒，具有解毒、止痛、抗
肿瘤等多种功效[2]。临床用于治疗恶性肿瘤、白细
胞减少症、周围性面神经麻痹，可用于止痛、麻醉、
抗感染等。蟾酥用于治疗各种癌症，有一定的攻毒
抗癌、消肿止痛作用，可用于肝癌、肠癌、白血病、
皮肤癌等的治疗[3-4]。
近年来，关于蟾酥对肿瘤的治疗作用的报道屡
见不鲜，对蟾蜍及蟾酥抗肿瘤有效成分的研究主要
集中在两方面：一方面是其水溶性成分，主要为吲
哚类生物碱；另一方面主要为脂溶性成分，主要是
蟾蜍毒素及蟾毒配基等[5]。从蟾酥中已分离并鉴定
了数十种化合物，并发现蟾毒灵对肿瘤细胞的生长
抑制活性最强[6]。在本实验室开展的相关研究中发
现，蟾毒灵的活性很强，但是毒性也很大，从蟾酥
中寻找潜在的抗肿瘤候选化合物宜从活性、毒性等
多方面综合考虑。
在天然活性化合物的分离研究中，往往是分离
和活性分两个阶段进行，即在分离得到纯品后再进
行活性测试，存在易丢失活性成分及效率低等诸多
弊端。而采用活性追踪分离的方法，在分离的每一

收稿日期：2010-06-21
基金项目：国家重大科技专项（2009ZX09103-385）
作者简介：于垂亮（1978—），男，山东青岛人，助理研究员，博士，从事天然药物及药剂研究。Tel: (021)51320211 E-mail: yucl@nperc.com.cn
*通讯作者 侯惠民 院士 Tel: (021)51320211 E-mail: houhm@nperc.com.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 308 •
个阶段对分离所得的各个部分进行活性评估，追踪
其中活性最强的部分，这对于天然活性化合物的分
离来说，是一种较好的方法[7]。本研究主要结合肿
瘤细胞生长抑制活性试验及小鼠急性毒性试验，开
展对蟾酥的提取方法及活性部位的研究，并结合细
胞生长抑制活性及小鼠急性毒性结果筛选具有开发
应用前景的候选化合物，为其深入开发奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
岛津制备型高效液相（LC—8A 型泵，SPD—
M10VAP 检测器，SCL—10VAP 控制器，SIL—10AP
自动进样器，FRC—10A 分步接收器）；Shim-pack
PREP-ODS(L)柱；岛津分析型高效液相，LC-20AT
泵，SPD-20A 紫外检测器，Class-vp 操作系统；
Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；旋转
薄膜蒸发器（上海申顺科技有限公司）；Napco―
6100 全自动 CO2 孵箱（杜邦公司）；DG3022 型酶
标仪（美国 Beckman 公司）；Quattro Premier XE VA
液质联用仪（美国 Waters 公司）；NMR System 500
核磁共振仪（美国 Varian 公司）；FT-IR Spectrometer
Spectrum 100 傅里叶红外光谱（美国 Perkin-Elmer
公司）。
1.2 试剂
RPMI 1640 培养液（美国 Gibcobrl 公司）；小牛
血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；磺酰罗
丹明 B（sulforhodanmine B，SRB）（美国 Sigma 公
司）；蟾酥（批号 AK0605，山东临沂爱康药业有限
公司）；蟾毒灵、蟾毒它灵（Sigma 公司）；Cremophor
EL（德国 BASF 公司），水为灭菌注射用水；其他
试剂均为分析纯或色谱纯。
1.3 细胞
人非小细胞肺癌细胞 A549、人肝癌细胞
BEL-7402、人胃癌细胞 SGC-7901（中国科学院上
海细胞库）。
1.4 动物
昆明种小鼠，中国科学院上海实验动物中心提
供，许可证号：SCXK(2004)-0015，体质量 18～22 g。
2 方法与结果
2.1 肿瘤细胞活性测定
采用 SRB 法[8-9]。取对数生长期肿瘤细胞，用
新鲜的RPMI 1640培养基配制成一定浓度的细胞悬
液，按每孔 200 μL 接种于 96 孔板中，每孔加入 2 μL
不同质量浓度的样品溶液，37 ℃培养 72 h。离心弃
去上清。每孔细胞中加入预冷的 80%三氯醋酸 50
μL，置于 4 ℃固定 1 h，用水冲洗 5 次并空气干燥，
每孔加入含 0.4%SRB 的 1%醋酸溶液 50 μL，并在
室温静置 30 min，用 1%醋酸水清洗 4 次，除去未
结合的游离 SRB 染料。每孔加入 150 μL Tris 溶液
（10 mmol/L，pH 10.5）溶解蛋白结合染料，用酶标
仪测定每孔在 520 nm 处的吸光度（A）值。各样品
设置 3 个复孔，另设 3 个孔作为空白对照。计算抑
制率[10-11]。
抑制率＝（A 空白对照－A 样品）/A 空白对照×100%
2.2 蟾酥不同提取部位体外抗肿瘤活性
将蟾酥粉碎后，过 20 目筛，分别精密称取细粉
3 份，每份 15 g，分别按如下工艺提取：
（1）加 450 mL 去离子水，加热回流 1 h，滤过，
滤渣再加去离子水 450 mL，加热回流 1 h，滤过，
合并滤液，减压浓缩至干，固形物得率 56.39%，编
号 CS-1。
（2）加入 95%乙醇 150 mL，加热回流 1 h，滤
过，滤渣再加 95%乙醇 150 mL，加热回流 1 h，滤
过，合并滤液，减压浓缩至干，固形物得率 43.46%，
编号 CS-2。
（3）加入 95%乙醇 150 mL，同（2）操作；滤
渣再加去离子水 450 mL，同（1）操作，合并乙醇
提取液和水提取液，减压浓缩至干，固形物得率
76.11%，编号 CS-3。
上述 3 份提取物分别用水、50%甲醇、甲醇进
行溶解试验，结果表明 CS-1 能溶于水，CS-2 溶于
甲醇，CS-3 溶于 50%甲醇。对 3 种提取物进行 HPLC
分析，结果表明 CS-1 中主要为大极性成分，另含
少量蟾毒灵等小极性成分；CS-2 既包含有 CS-1 的
大极性成分，同时含有大量小极性成分。3 种样品
分别用可溶溶剂配制样品溶液，考察各样品对 A549
细胞活性的影响，结果见图 1。3 种提取方法获得的
样品对 A549 细胞活性均有较好的抑制作用，CS-2
活性最强。
2.3 CS-2 样品的初步分离与体外抗肿瘤活性及急
性毒性考察
2.3.1 CS-2 样品的初步分离 将蟾酥药材用粉碎
机粉碎成细小颗粒，称取 300 g 置 5 L 圆底烧瓶中，
加入 3 L 95%乙醇，水浴加热回流 1 h，提取液滤过；
滤渣再加 3 L 95%乙醇同上操作，共提取 3 次，合
并滤液，40 ℃水浴旋转浓缩至约 50 mL，转移至
1 000 mL 梨形瓶中，再加入 400 mL 纯水、500 mL
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图 1 蟾酥不同提取部位对 A549 细胞生长的抑制作用
（ 3=± n , sx ）
Fig. 1 Inhibition of different extract fractions from
Bufonis Venenum on proliferation of A549 cells
( 3=± n , sx )
氯仿，盖塞振摇并超声 2 h，放置过夜分层，分取氯
仿层；剩余水层再加入氯仿同上操作，共萃取 3 次。
合并氯仿层减压浓缩至干，即得，固形物得率
30.8%。将萃取后的水层浓缩，固形物得率 13.21%，
编号为 CS-2-1。将氯仿萃取层经制备液相以 75%甲
醇为流动相分离为两段，其中脂蟾毒配基、华蟾酥
毒基和蟾毒灵 3 个化合物收集为一个流份，编号为
CS-2-3，固形物得率 17.12%。其余主要峰合并收集
为 CS-2-2，固形物得率 13.5%。
2.3.2 CS-2 不同分离部位的肿瘤细胞生长抑制活
性 经初步试验，CS-2-1 可溶于水，CS-2-2、CS-2-3
可溶于甲醇，因此分别用可溶溶剂将样品配成溶液
进行 A549 人肺癌细胞株抗肿瘤活性测试，见图 2。
结果表明 CS-2-2、CS-2-3 对 A549 细胞活性具有很
好的抑制作用，为进一步考察其活性，用人肝癌细
胞株BEL-7402和人胃癌细胞株SGC-7901进行活性
测试，结果见图 3。
结果表明，CS-2-2、CS-2-3 对于不同的实体瘤
细胞均具有较好的细胞生长抑制活性，在 100
ng/mL 时对细胞生长的抑制率均大于 90%；在 300
ng/mL时CS-2-2 对 2种肿瘤细胞的抑制率均在 50%
以上，除对 SGC-7901 细胞的抑制率为 44.6%外，
CS-2-3（300 ng/mL）对其他两种细胞的抑制率也在
50%以上；在 100 ng/mL 时 CS-2-2、CS-2-3 对 A549
和 BEL-7402 细胞的抑制率均达到 40%以上。
2.3.3 CS-2 不同部位小鼠急性毒性试验 CS-2-2、
CS-2-3 溶于适量表面活性剂 Cremophor EL 及乙醇，
以生理盐水配成 1 mg/mL 溶液，0.2 μm 微孔滤膜滤
过，控制 Cremophor EL 及乙醇在最终溶液中的量
不超过 10 mg/mL。

图 2 CS-2 不同分离部位体外对 A-549 细胞生长的抑制
作用（ 3=± n , sx ）
Fig. 2 In vitro inhibition of CS-2 different extract fractions
on proliferation of A549 cells ( 3=± n , sx )

图 3 CS-2 不同分离部位体外对 BEL-7402 和 SGC-7901
细胞生长的抑制作用（ 3=± n , sx ）
Fig. 3 In vitro inhibition of CS-2 different extract fractions
on proliferation of BEL-7402 and SGC-7901 cells
( 3=± n , sx )
分别以不同剂量将上述溶液尾 iv 给予小鼠，寻
找最大耐受剂量。CS-2-2 以 5 mg/kg 给药，10 只小
鼠（雌雄各半）给药后 10～20 min 出现扭体、呼吸
困难等毒性反应，约 1 h 后完全恢复正常，连续观
察两周均正常存活。在此剂量下每天给药 1 次，连
续 1 周，每次给药均见上述毒性反应，但均存活且
状态正常。
CS-2-3 以 2 mg/kg 给药，10 只小鼠（雌雄各半）
给药后 10～20 min 出现扭体、呼吸困难、四肢痉挛
等毒性反应，在给药 1 h 内死亡 4 只，其余在 2～3 h
完全恢复正常，连续观察两周均正常存活。降低
CS-2-3 剂量至 1.5 mg/kg，每天给药 1 次，连续 1
周，每次给药均出现扭体、呼吸困难等毒性反应，
但均存活且状态正常。
上述初步试验结果表明 CS-2-2、CS-2-3 小鼠体
内毒性存在较大差异，CS-2-2 的小鼠尾 iv 给药毒性
明显小于 CS-2-3，两者体外肿瘤细胞生长抑制活性
相当，因此选择 CS-2-2 进行深入研究。
0 0.1 0.2 0.3
抑
制
率
/%

100
80
60
40
20
0
ρ/(μg·mL−1)

CS-2-2 BEL-7402
CS-2-3 BEL-7402
CS-2-2 SGC-7901
CS-2-3 SGC-7901

ρ/(μg·mL−1)
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
100
80
60
40
20
0
抑
制
率
/%

CS-2-1
CS-2-2
CS-2-3

CS-1
CS-2
CS-3
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
抑
制
率
/%

100
80
60
40
20
0
ρ/(μg·mL−1)
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2.4 CS-2-2 样品的分离制备、抗肿瘤活性试验及急
性毒性试验
2.4.1 CS-2-2 样品的分离制备 以不同比例甲醇-
水为流动相进行分离条件摸索，结果表明以甲醇-
水（56︰44）为流动相，CS-2-2 各峰可实现较好分
离，按出峰先后分别收集，流份分别减压浓缩至干。
HPLC 分析结果表明编号 CS-2-2-2、CS-2-2-3、
CS-2-2-6、CS-2-2-7 流份均为单一化合物，质量分
数在 95%以上。其中 CS-2-2-7 在甲醇中可以析出针
状结晶。以上 4 个化合物在甲醇中均可溶解。
2.4.2 各化合物对 A549 细胞的生长抑制活性 将
CS-2-2-2、CS-2-2-3、CS-2-2-6、CS-2-2-7 分别用甲
醇配成适当质量浓度，进行 A549 细胞活性测试，
见图 4。结果表明从 CS-2-2 中分离得到的 4 个化合
物在 0.02、0.1 μg/mL 时均能较好抑制 A549 肿瘤细
胞的生长。

图 4 CS-2-2 中各化合物对人肺癌 A-549 细胞生长的抑制
作用（ 3=± n , sx ）
Fig. 4 Inhibition of different compounds from CS-2-2
on proliferation of A549 cells ( 3=± n , sx )
2.4.3 CS-2-2 中各化合物的小鼠体内急性毒性试
验 CS-2-2-2、CS-2-2-3、CS-2-2-6、CS-2-2-7 及蟾
毒灵溶于适量表面活性剂 Cremophor EL 及乙醇，
以生理盐水配成 1 mg/mL 溶液，0.22 μm 微孔滤膜
滤过，控制 Cremophor EL 及乙醇在最终溶液中的
量不超过 10 mg/mL。
取 200 只小鼠，体质量 18～22 g，雌雄各半，
分成 20 组，每组 10 只。根据预试验结果，每个化
合物设定 5 个剂量，尾 iv 给药后观察 2 周，利用
Bliss 计算软件计算化合物的半数致死剂量（LD50）。
结果见表 1。各化合物给药后，随剂量增加，小鼠
即时产生活动减少、行动迟缓、呼吸急促、行走蹒
跚等表现，死亡最快可在给药后 2～3 min，0.5 h 内
为死亡高峰。存活动物在 4 h 内完全恢复正常，给
药第 2 天及之后很少出现动物死亡。
表 1 CS-2-2 中各化合物小鼠尾 iv 给药的急性毒性
Table 1 Acute toxicity of compounds from CS-2-2
by iv administration to tail of mice
化合物 LD50/(mg·kg−1) 95%置信区间/(mg·kg−1)
蟾毒灵 2.256 1.924～ 2.495
CS-2-2-2 7.858 6.959～ 8.540
CS-2-2-3 9.221 8.159～10.35
CS-2-2-6 8.684 7.718～ 9.582
CS-2-2-7 11.494 11.061～12.009

2.4.4 化合物CS-2-2-6的结构确证 综合活性试验
结果和急性毒性试验结果，化合物CS-2-2-6活性强、
毒性低，故对其进行结构鉴定。
化合物 CS-2-2-6：白色粉末，ESI-MS m/z: 445，
提示相对分子质量为 444，结合 1H-NMR、13C-NMR
确定其分子式为 C26H36O6。IR 显示 1 700 cm−1 附近
有吸收峰，提示存在羰基，3 500 cm−1 提示存在羟
基。1H-NMR δ: 8.06 (1H, br d, H-31), 7.26 (1H, br s,
H-27), 6.19 (1H, d, H-30), 5.52 (1H, t,H-16), 4.14
(1H, br s, H-2), 2.88 (1H, d, H-15), 1.87 (3H, s, H-34),
0.94 (3H, s, H-22), 0.76 (3H, s,H-20)。13C-NMR:
170.32 (C-33), 162.30 (C-29), 151.09 (C-27), 149.56
(C-31), 117.18 (C-18), 113.11 (C-30), 84.46 (C-11),
73.79 (C-16), 66.83 (C-2), 57.25 (C-15), 49.56 (C-12),
42.33 (C-9), 40.88 (C-13), 40.51 (C-17), 36.01 (C-4),
35.65 (C-10), 35.45 (C-5), 33.47 (C-3), 29.70 (C-6),
27.99 (C-1), 26.53 (C-7), 23.86 (C-22), 21.25 (C-8),
21.19 (C-14), 21.10 (C-34), 16.63 (C-20)。由 1H-NMR
上 δH 8.06, 7.26, 6.19 这 3 个烯氢信号，δC 162.3 的
内酯羰基碳信号，δC 131.1、149.6、117.2、151.1 这
4 个不饱和碳信号，可知化合物中有 α-吡喃酮结构。
由 HMBC 知 C27、C31与 H15 有相关信号，C15 与 H27、
H31 有相关信号，C18与 H16有相关信号，提示 α-吡
喃酮结构连接在 15 位。结合质谱数据及 13C-NMR
给出的碳个数 26 个，不饱和度为 9，提示化合物为
蟾毒配基类化合物。δH 0.94，0.76 分别为 22、20 号
甲基氢信号，由 HMBC 知 H22 与 C4、C6、C10 有相
关信号，提示 22 号甲基连接在 C5 上，H20 与 C11、
C13、C15 有相关信号，提示 20 号甲基连接在 C12。δC
170.3 的羰基碳信号以及 δH 1.87 的甲基氢信号提示
分子中有乙酰氧基取代基，δC 73.8 提示 C16 连氧。
ρ/(μg·mL−1)
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
100
80
60
40
20
0
抑
制
率
/%


CS-2-2-2
CS-2-2-3
CS-2-2-6
CS-2-2-7
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 311 •
由 DEPT 知 δC 66.4 为连羟基碳原子，δC 84.5 为连羟
基季碳信号，提示该化合物2位和11位被羟基取代，
由以上数据推测该化合物为蟾毒它灵，与已知文献
报道的蟾毒它灵数据基本一致[12]，故鉴定该化合物
为蟾毒它灵。
3 讨论
本研究主要以对肿瘤细胞生长抑制作用为活性
指标，通过活性追踪方式寻找并分离蟾酥中活性化
合物。由于蟾酥中所含化合物具有较大的毒性，因
此需从中筛选活性好、毒性低的化合物进行研究开
发。经实验发现 CS-2-2 系列化合物均具有较好的肿
瘤细胞生长抑制活性，与文献报道的蟾毒灵活性相
当[13]，且小鼠单次尾 iv 给药的毒性比蟾毒灵低，因
此具有更大的开发优势和前景。
本研究测得蟾毒灵的 LD50 为 2.256 mg/kg，与
文献报道[14-15]基本相当。而将蟾毒它灵溶解在 50%
丙二醇的灭菌水溶液中，经小鼠尾 iv 给药，测得蟾
毒它灵的 LD50 为 4.13（3.77～4.52）mg/kg[14]，与
本研究结果差异较大，可能是所使用的溶剂不同而
导致毒性差异。
在研究中发现，化合物 CS-2-2-2、CS-2-2-3 在
制备过程中存在不同程度的不稳定现象，具体影响
因素有待进一步研究确证和规避。本研究意在寻找
和发现新的药物候选物，因此在体外细胞生长抑制
测试的基础上，还需要考察其在动物体内的状况，
由于这类化合物具有较大的毒性，考察其急性毒性
大小的差异具有重大价值。本研究综合考虑了化合
物的肿瘤细胞生长抑制活性、小鼠单次尾 iv 给药的
急性毒性及稳定性等方面因素，初步判断化合物蟾
毒它灵较其他同类化合物活性强、毒性低，更值得
深入研究。
对蟾酥的抗癌成分的研究众多，蟾毒它灵也很
早就被发现，有关蟾毒它灵对部分肿瘤细胞的生长
抑制作用也有报道，但是以往的研究多数认为蟾毒
灵更值得开发，通过本课题组的相关研究发现蟾毒
它灵更值得关注。在蟾毒它灵的动物体内分布及体
内外抗肿瘤药效评价[16]中均显示了较理想结果。
本研究结合肿瘤细胞生长抑制活性测试方法追
踪分离活性化合物，这种模式与传统的天然产物研
究先分离化合物再进行活性筛选的模式相比，减少
了盲目性，提高了命中率，可以快速、准确地获得
抗肿瘤活性化合物。同时细胞水平的活性测试方法
快速、准确、灵敏、用量少、操作简便，因此结合
细胞活性测试的活性追踪分离活性化合物的方法是
寻找相关活性化合物行之有效的好方法。
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