全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

·288·
HPLC 柱前酸化法测定柴胡中柴胡皂苷 a 和 d 的条件优化研究
胡 杰 1, 2，刘晓节 1, 2，秦雪梅 2*，马致洁 2，邢 婕 2，张丽增 2，郭小青 2
1. 山西大学化学化工学院 药学系，山西 太原 030006
2. 山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030006
摘 要：目的 优选 HPLC 柱前酸化法测定柴胡中柴胡皂苷 a、d 的酸化条件，通过对相关分析方法的评价，筛选优化的测
定方法。方法 采用单因素及正交试验优选柴胡皂苷 a、d 前处理的酸化条件和最佳提取条件，并对相关分析方法进行比较。
结果 优选柴胡皂苷 a、d 的前处理酸化条件为：8%盐酸，30 ℃反应 18 h，反应结束用 8% KOH 溶液调 pH 至中性；样品
最佳提取条件为：取药材粉末 0.5 g，加 8%氨甲醇溶液 25 mL，超声提取 3 次，每次 45 min；与相关文献方法比较表明本方
法灵敏度高、分离度好、色谱图杂质峰较小、目标峰面积较大。结论 本实验建立的定量测定方法优于相关文献报道的其他
方法，可作为柴胡质量控制的方法。
关键词：柴胡；HPLC 柱前酸化法；柴胡皂苷 a；柴胡皂苷 d；正交试验
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)02 - 0288 - 05
Optimization of pre-column acidification conditions for HPLC determination
of saikosaponins a and d
HU Jie1, 2, LIU Xiao-jie1, 2, QIN Xue-mei2, MA Zhi-jie2, XING Jie2, ZHANG Li-zeng2, GUO Xiao-qing2
1. Department of Pharmacy, School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
2. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine of Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Key words: Bupleuri Radix; pre-column acidification of HPLC; saikosaponin a; saikosaponin d; orthogonal test

柴胡为伞形科柴胡属植物北柴胡 Bupleurum
chinense DC.和狭叶柴胡 B. scozonerifolium Willd.
的干燥根，具解表和里、疏肝解郁、升举阳气之功
效[1]。柴胡皂苷为其主要有效成分之一，其中以柴
胡皂苷 a、d（saikosaponins a and d，简称 SSa、SSd）
的药理活性较强，具抗炎、保肝、降低血中胆固醇
等作用[2]。虽有较多文献报道 HPLC 法测定 SSa、
SSd 的量[3-5]，但因其分子中只含一个双键，处于紫
外末端吸收，采用 HPLC-UV 法检测波长大多在 210
nm 下，杂质峰干扰严重，检测灵敏度低，方法不
稳定；而 HPLC-ELSD 法检测限高且仪器费用昂贵，
不宜普及；另有报道[6]SSa、SSd 在酸性条件下易水
解开环成共轭体系，一定温度下可定向转化为柴胡
皂苷 b1、b2（saikosaponin b1 and b2，简称 SSb1、SSb2），
检测波长红移至 254 nm，紫外吸收增强，检测灵敏
度提高，而 SSb1、SSb2 并不存在于柴胡植物体内，
因此可通过测定酸化后 SSb1、SSb2 的量来反映柴胡
药材中 SSa、SSd 的量，但目前该方法样品提取条
件及酸化条件不一致[7-10]，尤其酸化条件在酸的浓
度、酸化反应时间及酸化反应温度等方面都存在很
大差异，对测定结果影响较大。因此，SSa、SSd
的定量测定方法至今尚不完善，历版《中国药典》
均未收载定量测定项。本实验拟采用单因素与正交
试验优选柴胡中 SSa、SSd 的前处理酸化条件和最
佳提取条件，并与文献分析方法进行比较评价，旨
在得出稳定、可靠的 SSa、SSd 定量测定方法，为
柴胡的质量控制提供科学依据。
1 仪器与材料
Waters 高效液相色谱仪（1525 泵，2487 检测
器），Breeze 色谱工作站；电子分析天平；数控超
声仪（KQ5200E 型）；恒温金属浴（CHB-100）。
SSa、SSd 对照品（购于中国药品生物制品检定

收稿日期：2011-07-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31070295）；山西省教育厅创新人才支持计划
作者简介：胡 杰（1983—），男，山西运城人，硕士，主要从事中药质量标准研究。Tel: (0351)7011202 E-mail: 200822905004@mail.sxu.cn
*通讯作者 秦雪梅 Tel: (0351)7011202 E-mail: qinxm@sxu.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

·289·
所），乙腈（色谱纯），磷酸（优级纯），其余试剂均
为分析纯。柴胡药材由山西大学中医药现代研究中
心秦雪梅教授鉴定为柴胡 Bupleurum chinense DC.
的干燥根。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Hypersil ODS-C18 柱（200 mm×4.6
mm，5 μm）；柱温 25 ℃；检测波长 254 nm；流动
相为乙腈-0.05% H3PO4（38∶62）；体积流量 1.0
mL/min。
2.2 溶液的制备
2.2.1 样品溶液的制备 称取柴胡药材粉末 0.5 g，
加 8%氨甲醇溶液 50 mL，超声提取 45 min，滤过，
蒸干，甲醇溶解并定容至 50 mL 量瓶中，摇匀，
备用。
2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取 SSa、SSd
对照品 11.9、15.7 mg，置 100 mL 棕色量瓶中，甲
醇稀释至刻度，摇匀，得 SSa、SSd 分别为 0.119、
0.157 mg/mL 的混合对照品溶液。
2.3 酸化条件的优选
2.3.1 酸化条件单因素考察 根据影响酸化反应的
因素，参考相关文献报道的反应条件[6-10]，分别单
因素考察不同体积分数的盐酸、酸化反应温度和酸
化反应时间对测定结果的影响，以筛选各因素的最
佳范围。
（1）盐酸体积分数的考察 量取“2.2.1”项下
样品溶液 1 mL 置 5 mL 量瓶中共 5 份，分别加 4%、
6%、8%、10%、12%盐酸 1 mL，在 25 ℃下恒温
反应 14 h，反应结束加 8% KOH 溶液调节 pH 至中
性，以甲醇定容，摇匀，过 0.45 μm 微孔滤膜，取
20 μL 进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色
谱峰面积，并计算不同体积分数盐酸酸化反应中
SSa、SSd 的量，测定结果（表 1）表明盐酸为 8%
时测定结果最大，因此选择盐酸体积分数的最佳范
围为 6%～10%。

表 1 盐酸体积分数对酸化反应的影响
Table 1 Influence of hydrochloric acid volume
fraction on acidification reaction
盐酸 SSa / % SSd / % 盐酸 SSa / % SSd / %
4% 0.271 9 0.322 5 10% 0.463 9 0.533 6
6% 0.502 7 0.598 2 12% 0.305 0 0.381 5
8% 0.526 6 0.684 7
（2）酸化反应温度的考察 量取“2.2.1”项下
样品溶液 1 mL 置 5 mL 量瓶中共 5 份，各加 8%盐
酸 1 mL，分别在 20、25、30、35、40 ℃下恒温反
应 14 h，反应结束加 8% KOH 溶液调节 pH 至中性，
以甲醇定容，摇匀，过 0.45 μm 微孔滤膜，取 20 μL
进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面
积，并计算不同酸化反应温度下 SSa、SSd 的量，
测定结果（表 2）表明 30 ℃时测定结果最大，因此
选择酸化反应温度的最佳范围为 25～35 ℃。

表 2 温度对酸化反应的影响
Table 2 Influence of temperature on acidification reaction
温度 SSa / % SSd / % 温度 SSa / % SSd / %
20 ℃ 0.108 5 0.190 4 35 ℃ 0.483 0 0.592 8
25 ℃ 0.514 5 0.621 8 40 ℃ 0.391 1 0.446 3
30 ℃ 0.534 8 0.592 4

（3）酸化反应时间的考察 量取“2.2.1”项下
样品溶液 1 mL 置 5 mL 量瓶中共 12 份，各加 8%盐
酸 1 mL，分别在 30 ℃下恒温反应 4、6、8、10、
12、14、16、18、21、24、27、32 h，反应结束加
8% KOH 溶液调节 pH 至中性，以甲醇定容，摇匀，
过 0.45 μm 微孔滤膜，取 20 μL 进样，按“2.1”项
下色谱条件测定，记录色谱峰面积，并计算不同酸
化反应时间 SSa、SSd 的量，测定结果（表 3）表明
酸化反应 21 h 时测定结果最大，因此选择酸化反应
时间的最佳范围为 18～24 h。

表 3 酸化反应时间对酸化反应的影响
Table 3 Influence of acidizing reaction time
on acidification reaction
时间 SSa / % SSd / % 时间 SSa / % SSd / %
4 h 0.255 3 0.407 2 16 h 0.482 6 0.620 4
6 h 0.270 8 0.421 5 18 h 0.507 3 0.647 2
8 h 0.317 8 0.488 3 21 h 0.512 7 0.697 3
10 h 0.352 7 0.509 2 24 h 0.507 3 0.657 1
12 h 0.400 4 0.553 2 27 h 0.483 6 0.603 3
14 h 0.432 8 0.604 3 32 h 0.432 9 0.562 6

2.3.2 正交试验优选酸化条件 在单因素考察的基
础上，选择反应温度（A）、盐酸体积分数（B）和
反应时间（C）为考察因素，SSa 和 SSd 收率的综
合评分（两者收率之和）为指标优选酸化条件。按
L9(34) 正交试验设计安排试验，因素与水平见表 4。
取“2.2.1”项下样品溶液 1 mL 置 5 mL 量瓶中，
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

·290·
共 9 份，按正交试验设计加 1 mL 相应体积分数的
盐酸，并在相应的温度及时间下进行反应，反应结
束加 8% KOH 溶液调节 pH 至中性，甲醇定容，摇
匀，过 0.45 μm 滤膜，取 20 μL 进样，按“2.1”项
下色谱条件测定，结果见表 4。方差分析见表 5。
直观分析结果表明，影响柴胡皂苷 a、d 酸化反
应因素的顺序为 B＞A＞C，即酸度＞反应温度＞反
应时间，所得最佳酸化反应条件为 A2B2C3。

表 4 正交试验设计及结果
Table 4 Design and results of orthogonal test
试验号 A / ℃ B / % C / h D (误差) SSa / % SSd / % 综合评分
1 25 (1) 6 (1) 18 (1) (1) 0.521 9 0.585 1 1.107 0
2 25 (1) 8 (2) 21 (2) (2) 0.536 8 0.644 1 1.180 9
3 25 (1) 10 (3) 24 (3) (3) 0.388 5 0.468 8 0.857 3
4 30 (2) 6 (1) 21 (2) (3) 0.529 1 0.636 4 1.165 5
5 30 (2) 8 (2) 24 (3) (1) 0.550 0 0.679 1 1.229 1
6 30 (2) 10 (3) 18 (1) (2) 0.391 8 0.478 0 0.869 8
7 35 (3) 6 (1) 24 (3) (2) 0.511 3 0.579 8 1.091 1
8 35 (3) 8 (2) 18 (1) (3) 0.521 4 0.602 8 1.124 2
9 35 (3) 10 (3) 21 (2) (1) 0.375 4 0.420 9 0.796 3
K1 1.048 0 1.121 0 1.034 0 1.044 0
K2 1.088 0 1.178 0 1.048 0 1.047 0
K3 1.004 0 0.841 0 1.059 0 1.049 0
R 0.084 0 0.337 0 0.025 0 0.005 0


表 5 方差分析
Table 5 Analysis of variance
方差来源 离差平方和 自由度 F 值 显著性
A 0.010 66 2 76.47 P＜0.05
B 0.195 19 2 1 323.46 P＜0.01
C 0.000 98 2 5.87
D (误差) 0.000 04 2 1.00
F0.05(2, 2)＝19.00；F0.01(2, 2)＝99.00
由方差分析结果可知，B 因素对柴胡皂苷 a、d
酸化反应的影响具有极显著意义（P＜0.01），A 因
素的影响具有显著意义（P＜0.05），C 因素的影响
无显著意义，各因素的影响大小次序为 B＞A＞C，
方差分析与直观分析结果具有一致性。
2.3.3 酸化反应时间的再优选 通过对正交试验结
果的方差分析，在 18～24 h 酸化反应时间对测定结
果无显著影响，因此有必要重新优选酸化反应时间，
使酸化反应时间尽可能缩短，便于试验操作。通过
对各酸化反应时间数据（表 3）进行显著性检验分
析，结果表明反应 24 h 与反应 16 h 的测定结果存在
显著差异（P＜0.05），而与 18 h 的测定结果无显著
差异。因此，可将酸化反应时间从 24 h 缩短至 18 h，
即最佳酸化反应条件为：8%盐酸，30 ℃反应 18 h。
2.3.4 正交试验的验证 量取上述样品溶液 1 mL
共 3 份进行重复性试验，结果表明在所选条件下测
得 SSa、SSd 收率高，且重现性好，SSa、SSd 的平
均收率分别为 0.56%、0.67%，RSD 值分别为 1.33%、
1.12%。
2.4 方法学考察
按中药质量标准分析方法验证指导原则对上述
方法进行验证。
2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取 0.119 mg/mL
SSa 和 0.157 mg/mL SSd 对照品溶液 10、20、40、
80、100、150、200 μL 置 2 mL 量瓶中，照“2.3.3”
项下方法进行酸化处理，定容，得不同质量浓度的
SSa、SSd（分别转化为 SSb1、SSb2）混合对照品溶
液，各取 20 μL 进行测定，以 SSb1、SSb2 的峰面积
对 SSa、SSd 的进样量进行线性回归，得回归方程：
SSa Y＝1.0×106 X＋4 786.7，r＝0.999 8；SSd Y＝
2.0×106 X＋85 930，r＝0.999 4；结果表明 SSa、SSd
分别在 0.119～2.38、0.157～3.14 μg 线性关系良好。
2.4.2 精密度试验 分别精密量取 0.119 mg/mL
SSa和0.157 mg/mL SSd对照品溶液200 μL，置5 mL
量瓶中，照“2.3.3”项下方法进行酸化处理，定容，
分别取 20 μL 进行测定，连续进样 5 次，测得 SSb1、
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

·291·
SSb2 峰面积的 RSD 分别为 0.97%、1.65%，结果表
明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验 精密称取药材粉末 0.5 g 共 6
份，照“2.2.1”项下方法制备样品溶液，并按“2.3.3”
项条件进行酸化处理，在室温下，分别取 20 μL 于
0、2、4、8、16、24 h 进行测定，测得 SSb1、SSb2
峰面积的 RSD 分别为 1.12%、1.78%，结果表明样
品溶液在 24 h 内稳定性良好。
2.4.4 重现性试验 精密称取药材粉末 0.5 g 共 6
份，照“2.2.1”项下方法制备样品溶液，并按“2.3.3”
项条件进行酸化处理，在室温下，分别取 20 μL 进
行测定，记录 SSb1、SSb2 峰面积，计算得 SSa、SSd
质量分数的 RSD 分别为 1.02%、0.96%，结果表明
重现性良好。
2.4.5 加样回收率试验 精密称取 0.5 g药材粉末 6
份，分别定量加入 SSa、SSd 对照品溶液，照“2.2.1”
项下方法制备样品溶液，并按“2.3.3”项条件进行
酸化处理，在室温下，分别取 20 μL 进行测定，计
算回收率。测得 SSa、SSd 的平均回收率分别为
99.86%、98.73%，RSD 分别为 1.67%、1.28%，表
明样品测定准确度良好，符合要求。
2.5 不同酸化方法比较
取 3 个不同产地的北柴胡样品，按不同酸化方
法[7-10]处理样品溶液，过 0.45 μm 微孔滤膜，取 20 μL
进样，按“2.1”项下色谱条件测定，所得测定结果
见表 6。结果表明，3 个北柴胡样品中用本实验方法
所测定的 SSa、SSd 量均较大，证明本实验方法更
优，可行性更强。

表 6 不同酸化方法测定结果比较
Table 6 Comparison on determination results from different acidification methods
山西太谷 山西陵川 山西万荣 酸化方法
SSa / % SSd / % SSa / % SSd / % SSa / % SSd / %
本实验方法 0.486 5 0.815 6 0.461 9 0.765 6 0.658 4 0.979 3
文献方法一[7] 0.393 5 0.786 5 0.323 2 0.621 5 0.436 1 0.795 6
文献方法二[8] 0.341 2 0.680 6 0.285 3 0.528 5 0.353 9 0.695 2
文献方法三[9] 0.088 9 0.491 7 0.053 7 0.439 8 0.109 5 0.569 7
文献方法四[10] 0.273 1 0.586 4 0.172 9 0.492 7 0.287 3 0.631 2

通过方法学验证及相关分析方法比较，最终确
定样品测定方法为：称取柴胡药材粉末 0.5 g，加 8%
氨甲醇 25 mL，超声提取 3 次，每次 45 min，合并
提取液，滤过，蒸干，甲醇溶解并定容至 25 mL；
取此溶液 1 mL 置 5 mL 量瓶中，加 8%盐酸 1 mL，
30 ℃恒温反应 18 h，反应结束用 8% KOH 溶液调
节 pH 至中性，甲醇定容，摇匀，照“2.1”项下色
谱条件，进样量 20 μL 进行测定并记录色谱图，所
得色谱图见图 1。
3 讨论
本实验对 HPLC 法测定 SSa、SSd 的前处理酸
化条件及提取条件进行优化，结果表明所选取的方
法杂质峰较小，目标峰较大，分离度好，灵敏度高，
为 SSa、SSd 的定量测定提供科学依据。
SSa、SSd 易受高温、光线、酚类或酸性成分的
影响而发生变化，本研究通过加速试验，对其稳定
性进行考察。结果表明，SSa、SSd 受温度和酸度的
影响较大，受光线影响较小，在中性和碱性条件下
其稳定性无显著性差异，对照品用甲醇溶解后，在



1-SSb2 2-SSb1
图 1 SSa、SSd 对照品 (A) 和柴胡药材 (B) 经酸化处理
后的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of SSa and SSd reference
substances (A) and Bupleuri Radix (B)
after acidification reaction

低温避光的条件下稳定性良好。
采用单因素试验，分别比较了提取方法（超声、
回流、温浸）、提取溶剂（甲醇，2% KOH 甲醇溶液，
5%吡啶甲醇溶液，3%、5%、8%、10%氨甲醇溶液）、
提取时间（30、45、60、75 min）、提取次数（1、2、
3、4 次）对测定结果的影响，结果表明药材经 8%
氨甲醇溶液超声提取 3 次，每次 45 min，提取效果
1 2 1
2
0 10 20 0 10 20
t / min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

·292·
最佳。
酸化反应时，本研究通过比较相同浓度的盐酸-
水、盐酸-甲醇、盐酸-50%甲醇溶液对测定结果的影
响，结果表明 3 种结果并无显著差异。因此，本实
验选择盐酸-水溶液进行酸化反应。
酸性条件下，SSa、SSd 在一定温度范围内可转
化为 SSb1、SSb2，但关于酸化的温度界限并未见报
道，本研究通过对酸化反应的温度进行考察，结果
表明 SSa、SSd 在低于 20 ℃时，酸化反应非常缓慢；
当反应温度超过 40 ℃时，SSa 除生成 SSb1外，还
生成另一种副产物，而 SSd 只生成单一产物 SSb2；
当反应温度达到 80 ℃时，SSa、SSd 完全水解为柴
胡皂苷元。因此，酸化反应的温度应该在 20～40 ℃
进行选择，但关于 SSa 酸化反应在 40～80 ℃生成
副产物的指认，还需进一步研究。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 肖培根 . 新编中药志 [S]. 北京 : 化学工业出版社 ,
2006.
[3] 潘瑞乐, 陈迪华, 陈建民, 等. RP-HPLC 法测定中柴 1
号及其他产地柴胡中柴胡皂苷 a、d 的含量 [J]. 中南药
学, 2004, 2(4): 198-200.
[4] 王光忠, 李秋怡, 李焱文, 等. 高效液相色谱-蒸发光散
射检测法测定柴胡药材中柴胡皂苷 a 及柴胡皂苷 d 的
含量 [J]. 时珍国医国药, 2006, 17(9): 1721-1722.
[5] 陈 妍. HPLC-ELSD 法测定柴胡中柴胡皂苷 a、d 的含
量 [J]. 天津药学, 2002, 14(3): 73-75.
[6] 原田正敏, 姜顺善. 日本常用生药的定量方法: 柴胡
[J]. 国外医药: 植物药分册, 1992, 7(2): 68-69.
[7] Li X Q, Gao Q T, Chen X H, et al. High performance
liquid chromatographic assay of saikosaponins from
Radix Bupleuri in China [J]. Biol Pharm Bull, 2005,
28(9): 1736-1742.
[8] 王兰霞, 杨玲霞, 张伯崇. 甘肃省庆阳地区栽培柴胡质
量的考察 [J]. 中国中药杂志, 1994, 19(10): 596-597.
[9] 孔伶俐, 崔青娟, 史德盛, 等. HPLC 法测定柴胡中柴
胡皂苷 a 的含量 [J]. 中草药, 2004, 35(6): 643-644.
[10] 李媛媛, 秦雪梅, 王玉庆, 等. 柱前衍生化法评价不同
品种和产地柴胡药材和饮片的质量 [J]. 中国中药杂
志, 2008, 33(3): 237-240.