全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3364·
鳖甲煎丸对肝纤维化大鼠 TGF-β1/samd 信号通路的影响
孙玉凤 1, 2，李 媛 2*，李风华 2，张艺凡 2，张 玉 2，任 荣 2
1. 河北医科大学第二医院 消化内科，河北 石家庄 050000
2. 河北医科大学，河北 石家庄 050011
摘 要：目的 探讨鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机制。方法 SD 大鼠随机分成 6 组：对照组，模型组，秋水仙碱（0.1 mg/kg）
阳性对照组，鳖甲煎丸低、中、高剂量（0.55、1.1、2.2 g/kg）组。除对照组外，其他各组大鼠 sc 40% CCl4橄榄油溶液，每
周 2 次，连续给予 6 周，建立大鼠肝纤维化模型。在造模同时，各给药组每天给予相应药物 10 mL/(kg·d) 1 次，连续给药 11
周。于 11 周末处死大鼠，免疫组化法检测肝组织中 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）
法检测大鼠肝组织中转化生长因子（TGF-β1）及 smad 3 基因的表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠肝组织 α-SMA 蛋白
及 TGF-β1、smad 3 基因的表达显著上调（P＜0.05）。与模型组比较，鳖甲煎丸和秋水仙碱可显著降低大鼠肝组织 α-SMA 蛋
白及 TGF-β1、smad 3 基因的表达，其中以鳖甲煎丸 2.2 g/kg 的效果更显著。结论 鳖甲煎丸抗肝纤维化作用机制可能与其
下调 TGF-β1/smad 3 信号通路、抑制肝星状细胞活化和增殖有关。
关键词：鳖甲煎丸；肝纤维化；转化生长因子-β1；smad 3；α-平滑肌肌动蛋白；肝星状细胞
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)23 - 3364 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.23.019
Effect of Biejiajian Pill on TGF-β1/smad signal pathway in rats with liver fibrosis
SUN Yu-feng1, 2, LI Yuan2, LI Feng-hua2, ZHANG Yi-fan2, ZHANG Yu2, REN Rong2
1. Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China
2. Heibei Medical University, Shijiazhuang 050011, China
Abstract: Objective To observe the anti-fibrotic mechanism of Biejiajian Pill. Methods SD rats were randomly divided into six
groups: control, model, colchicina (0.1 mg/kg, positive), Biejiajian Pill (0.55, 1.1, and 2.2 g/kg) groups. Except for the control group,
the rats in the other groups were sc injected with 40% CCl4 olive oil solution twice a week for consecutive six weeks to establish the
models of liver fibrosis.. At the same time, drugs were ig administrated at a volume of 10 mL/kg in each group, once daily for
consecutive 11 weeks. At the end of the week 11, all rats were sacrificed. The immunohistochemical technique was applied to
analyzing the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in liver tissue, RT-PCR was applied to analyzing the expression of
transforming growth factor-β1 (TGF-β1) protein and smad 3 gene in liver tissue. Results Compared with the control group, the
expression levels of α-SMA, TGF-β1, and smad 3 gene increased significantly (P < 0.05) in the model group. Compared with the model
group, Biejiajian Pill and colchicina decreased the expression of α-SMA, TGF-β1 and smad 3 gene, the efficacy of high-dose Biejiajian
Pill group was more significantly. Conclusion The antifibrotic mechanism of Biejiajian Pill may be through lowing the TGF-β1/smad
3 signaling pathways and inhibiting hepatic stellate cells activation and proliferation.
Key words: Biejiajian Pill; liver fibrosis; transforming growth factor-β1; smad3; α-smooth muscle actin; hepatic stellate cells

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经
阶段，目前临床上缺乏抗纤维化的有效药物,鳖甲煎
丸主要由鳖甲、黄芩、柴胡等组成，具有活血化瘀、
软坚散结、补益虚损、清热祛痰、除湿等功效，用
于治疗肝硬化、慢性肝炎疗效显著[1-2]。本实验鳖甲
煎丸作用于 CCl4 诱导的肝纤维化模型大鼠，观察其
对 TGF-β1/samd 信号通路的影响，探讨其抗纤维化
作用的机制。

收稿日期：2013-05-11
基金项目：河北省自然科学基金资助项目（C2009001143）
作者简介：孙玉凤（1964—），女，河北南皮人，主任医师，博士，主要从事消化系统疾病的中西医结合临床及基础研究。
Tel: (0311)66002301 E-mail: sunyf789@yahoo.com
*通信作者 李 媛 E-mail: luny2008@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3365·
1 材料
1.1 药品与试剂
鳖甲煎丸，50 g/瓶，批号 101201，武汉中联药
业集团股份有限公司；秋水仙碱片，0.5 mg/片，批
号 101015，西双版纳药业有限责任公司；兔抗 α-平
滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体，北京博奥森公
司；免疫组化染色试剂盒，北京中杉金桥公司；PCR
引物由上海捷瑞生物工程有限公司鉴定并合成；反转
录及 PT-PCR 扩增试剂盒，TaKaRa 宝生物公司。
1.2 动物
清洁级 SD 大鼠，雄性，体质量（370±40）g，
由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号为
1104167。
2 方法
2.1 模型制备
大鼠随机分为对照组（8 只），模型组（9 只），
秋水仙碱（0.1 mg/kg）阳性对照组（9 只），鳖甲煎丸
（0.55、1.1、2.2 mg/kg）组（各 9 只）。除对照组外，
其他各组大鼠背部 sc 40% CCl4橄榄油溶液，首次 5
mL/kg，以后每次 3 mL/kg，每周 2 次，连续 6 周。
2.2 给药及样本采集
秋水仙碱和鳖甲煎丸用蒸馏水配制成混悬液。
各给药组大鼠均于造模当日起每天 ig 相应药物 1
次，给药体积 10 mL/kg，连续给药 11 周；对照组
和模型组大鼠 ig 同体积蒸馏水。
2.3 样本采集
给药第 11 周末，大鼠禁食 12 h，4%水合氯醛
腹腔麻醉，取大鼠肝脏，留取肝左叶，置于 4%多
聚甲醛溶液中固定，用于免疫组化分析。将肝右叶
迅速置于液氮中，速冻后取出，冻存于−80 ℃冰箱
内保存，用于制备组织匀浆、提取 RNA 标本等。
2.4 检测指标
2.4.1 大鼠一般状况观察 实验期间观察大鼠精神
状态、体质量、饮食和饮水量、毛色、活动灵敏度
等状况。
2.4.2 免疫组化法检测肝组织中 α-SMA 表达 取
“2.3”项下肝组织，石蜡切片，常规脱蜡至水，用
柠檬酸盐缓冲液对组织抗原进行相应的修复，滴加
3% H2O2，室温孵育 10 min 以灭活内源性过氧化物
酶。孵育后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗浸泡 3 次，
每次 3 min；滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育
15 min，倾去多余液体，不洗；滴加以适当比例稀
释的一抗，37 ℃孵育 2～3 h 或于 4 ℃冰箱过夜，
PBS 冲洗浸泡 3 次，每次 3 min；滴加生物素化山
羊抗大鼠免疫球蛋白 G（IgG），室温 20 min，PBS
冲洗浸泡 3 次，每次 3 min；滴加辣根酶标记链霉
卵白素，PBS 冲洗浸泡 3 次，每次 3 min；DAB 显
色，自来水充分冲洗，根据需要可进行复染、脱水、
透明；封片，染色。
2.4.3 RT-PCR 检测肝组织中转化生长因子（TGF-
β1）和 smad 3 基因的表达 按 Triozl 试剂盒操作说
明提取大鼠肝组织总 RNA，紫外分光光度计检测总
RNA 的纯度及浓度，A260/A280在 1.8～2.0 者可用于
反 转 录 。 引 物 序 列 ： TGF-β1 正 向 引 物
5’-TGGACCGCAACAACGCAATCTATGACAAAA-
CC-3’，反向引物 5’-TGGAGCTGAAGCAGTAGTT-
GGTATCCAGGGCT-3’，扩增片段为 525 bp；smad 3
正 向 引 物 5’-TGACAGTGCTATTTTCGTCCAG-
TCT-3’，反向引物 5’-CGATCCCTTTACTCCCA-
GTGTCT-3’，扩增片段为 375 bp；GAPHD（内参）
正向引物 5’-CCTTCATTGAC- CTCAACTAC-3’，反
向引物 5’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’，扩增
片段为 594 bp。PCR 反应体系为 20 μL 10×PCR 缓
冲液 2 M1、dNTPs 各 2 μL、Oligo dT Primer 各 0.5
μL、cDNA 模板 2 μL、Taq Polymerase 0.2 μL、Mg2＋ 1.5
μL。PCR 反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃变性 30 s，
60 ℃（TGF-β1 和 smad 3）或 59 ℃（GAPDH）退
火 50 s，72 ℃延伸 90 s，扩增 30 个循环，最后 72 ℃
延伸 10 min。扩增产物在 1%琼脂糖凝胶（含 GV
核酸染料）内电泳，采用 Quantity One 凝胶图像分
析软件对目的电泳带进行分析，以相应内参条带为
参照，结果以两者积分吸光度的比值来表示。
2.5 统计学处理
采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，所
有计量资料符合正态分布者，采用 ±x s 表示。多个
样本均数比较应采用完全随机设计的单因素方差分
析，多个样本均数两两比较采用 SNK-q 检验。
3 结果
3.1 对大鼠一般状况的影响
对照组大鼠体质量自然增加，反应灵敏，皮
毛密集而有光泽。模型组大鼠一般状况差，皮毛
发潮湿成缕，体形消瘦，反应迟钝，烦躁易激惹。
鳖甲煎丸组大鼠的一般状况好于模型组。由于
CCl4 注射部位感染或者 ig 损伤等原因，模型组大
鼠死亡 2 只，秋水仙碱组、鳖甲煎丸各剂量组大
鼠各死亡 1 只。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3366·
3.2 对肝纤维化大鼠 α-SMA 表达的影响
对照组 α-SMA 只表达于小动脉及小静脉，在
胆管无表达。模型组 α-SMA 表达明显上调；阳性
染色程度增加，主要见于汇管区及纤维间隔，呈长
椭圆形或梭形。秋水仙碱组、鳖甲煎丸各剂量组阳
性染色程度较模型组明显减轻（P＜0.05），其中鳖
甲煎丸 2.2 mg/kg 组阳性染色程度显著低于其他给
药组（P＜0.05）。结果见表 1。
3.3 对肝纤维化大鼠TGF-β1及smad 3基因表达的影响
与对照组比较，模型组大鼠肝组织中 TGF-β1 及
smad 3 基因表达明显上调（P＜0.05）。与模型组比较，
鳖甲煎丸各组及秋水仙碱组大鼠肝组织中 TGF-β1、
smad 3 基因不同程度地降低（P＜0.05），其中鳖甲煎
丸 2.2 mg/kg 的效果最显著。结果见表 2 和图 1。
表 1 鳖甲煎丸对肝纤维化大鼠肝组织 α-SMA 表达的影响
( ±x s )
Table 1 Effect of Biejiajian Pill on α-SMA expression
in liver tissue of rats with liver fibrosis ( ±x s )
组 别 剂量 / (mg·kg−1) 动物 / 只 α-SMA
对照 — 8 0.155 0±0.025 0
模型 — 7 0.748 0±0.027 8*
秋水仙碱 0.10 8 0.470 0±0.043 9▲#
鳖甲煎丸 0.55 8 0.558 0±0.036 3▲#
1.10 8 0.478 0±0.056 0▲#
2.20 8 0.335 0±0.027 5▲
与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：▲P＜0.05；
与鳖甲煎丸高剂量组比较：#P＜0.05，下表同
*P < 0.05 vs control group; ▲P < 0.05 vs model group
#P < 0.05 vs high dose Biejiajian Pill group; same as below
表 2 鳖甲煎丸对肝纤维化大鼠 TGF-β1及 smad 3 基因表达的影响 ( ±x s )
Table 2 Effect of Biejiajian Pill on expression of TGF-β1 and smad 3 mRNA in liver tissue of rats with liver fibrosis ( ±x s )
组 别 剂量 / (mg·kg−1) 动物 / 只 TGF-β1 smad 3
对照 — 8 0.165 0±0.002 0 0.158 0±0.005 2
模型 — 7 0.416 0±0.002 1* 0.610 0±0.008 3*
秋水仙碱 0.10 8 0.247 0±0.002 8▲# 0.356 0±0.003 4▲#
鳖甲煎丸 0.55 8 0.267 0±0.003 8▲# 0.489 0±0.004 5▲#
1.10 8 0.244 0±0.002 9▲# 0.351 0±0.005 5▲#
2.20 8 0.185 0±0.002 8▲ 0.248 0±0.004 1▲


图 1 鳖甲煎丸对肝纤维化大鼠 TGF-β1与 smad 3 基因
表达的影响
Fig. 1 Effect of Biejiajian Pill on expression of TGF-β1 and
smad 3 mRNA in liver tissue of rats with liver fibrosis
4 讨论
TGF-β1 是一类具有多种生物活性的细胞因子，
是导致肝纤维化形成的最强催化剂，在人星状细胞
（HSC）激活的“早期启动阶段”和“激活持久化阶
段”，TGF-β1 都起到重要作用，是肝损伤后全面诱
发肝纤维化形成的一个关键细胞因子[3]。TGF-β1 受
体的胞内激酶底物是 smad 蛋白，它将 TGF-β1 与受
体作用的信号由胞浆传导至胞核，从而介导 TGF-β1
在细胞内的信号转导[4]。TGF-β1/smad 信号传导通路
是肝纤维化主要的信息传导途径[5-6]。肝纤维化时，
TGF-β1 与细胞膜表面的 II 型受体（TβR II）识别并
结合形成异源二聚体，TβR II 的胞内段 Ser/ Thr 激
酶即被活化，进而与 TβR I 组成受体异聚体复合物，
该复合物与 R-smad 结合（smad 2 和 smad 3），从而
激活 smad 2 和 smad 3 羧基末端的 SSXS 序列，这
是 TGF-β1 信号传导很关键的一步 [7]。然后再与
co-smad（smad 4）结合形成异源寡聚体而转位入胞
核，调节目的基因转录。由此可见，TGF-β1 能够刺



TGF-β1
smad 3
GAPDH
Marker 对照 模型 秋水仙碱 0.55 1.10 2.20
鳖甲煎丸 / (mg·kg−1)
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
100 bp
250 bp
500 bp
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
700 bp
1 000 bp
2 000 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3367·
激 HSC 活化与增殖，smad 3 可将 TGF-β1 信号由胞
浆传递至胞核内调控目的基因表达，促进肝纤维化
发生发展。
在肝纤维化发生发展过程中，HSC 的活化与增
殖是中心环节，TGF-β1 能够激活 HSC 转化为肌成
纤维细胞，表达 α-SMA，并合成大量细胞外基质
（ECM）沉积于肝脏，最终导致纤维化的发生[8-9]。
因此，α-SMA 是 HSC 活化的标志性蛋白，与肝纤
维化程度、HSC 增殖呈正相关，α-SMA 的表达量可
直接反映活化的肝星状细胞的数量[10]。
肝纤维化属于中医的癥瘕、胁痛、积聚等病证
范畴，中医认为肝纤维化演变过程可以归结为“由
实到虚、由轻到重、由表及里、由气入血、由聚至
积”，病机为“虚实夹杂”，正虚以脾肾亏虚为主，
邪实以气滞血瘀为主。临床上中医治疗肝纤维化方
法主要是活血化瘀、软坚散结、舒肝解郁、益气健
脾、清热利湿、滋养肾阴、柔润肝体。鳖甲煎丸收
载于《伤寒杂病论》，其治疗肝硬化、慢性肝炎疗效
确切。本实验 sc 40% CCl4 橄榄油，诱导大鼠肝纤
维化模型，造模同时给予化瘀通络中药鳖甲煎丸，
结果模型组大鼠肝组织 α-SMA 蛋白、TGF-β1 及
smad 3 基因的表达显著高于对照组；而给予鳖甲煎
丸治疗后，大鼠肝纤维化结构得到改善，肝组织
α-SMA 蛋白、TGF-β1 与 smad 3 基因的表达明显下
调，尤以其高剂量疗效最好。鳖甲煎丸抗纤维化机
制可能与调控 TGF-β/smad 信号转导通路，抑制 HSC
活化与增殖有关。近年来，中药防治肝纤维化的作
用日益受到重视，且已显现良好的应用前景[11-14]。
中药抗肝纤维化的作用机制为多靶点、多环节、多
途径，并涉及多种细胞因子及信号分子网络。鳖甲
煎丸能够调控 TGF-β1/smad 3 信号转导通路，然而
其抗纤维化机制是否还涉及其他信号通路或细胞因
子生物学活性，有待于进一步研究。
参考文献
[1] 周红燕, 胡敏涛, 蒋红梅. 鳖甲煎丸对肝纤维化的影响
[J]. 中华医学写作杂志, 2002, 9(3): 198.
[2] 赵治友, 姚真敏, 钟庆平, 等. 中药鳖甲煎丸抗肝纤维
化作用的临床研究 [J]. 中国中西医结合肝病杂志 ,
2001, 11(3): 136-138.
[3] Gressner A M, Weiskirchen R. Modern pathogenesis,
concepts ofliver fibrosis suggest satellites cells and
TGF-beta as major playersand therap eutic targets [J]. J
Cell Mol Med, 2006, 8(10): 76-99.
[4] Derynck R, Zhang Y E. Smad-dependent and Smad-
independent pathways in TGF-beta family signaling [J].
Nature, 2003, 425(6958): 577-584.
[5] Breitkopf K, Godoy P, Ciuclan L, et al. TGF-beta/Smad
signaling in the injured liver [J]. Z Gastroenterol, 2006,
44(1): 57-66.
[6] 沈 波, 杨大明, 孟宪镛. 肝纤维化中肝星状细胞内主
要信号转导通路 [J]. 国际内科学杂志, 2007, 34(8):
456-459.
[7] Kremer M, Perry A W, Milton R J, et al. Pivotal role of
Smad 3 in a mouse model of T cell mediated hepatitis [J].
Hepatology, 2008, 47(1): 113-126.
[8] Oyaizu T, Shikata N, Senzaki H, et al. Studies on the
mechanismof dimethylnitrosamine-induced acute liver
injury in mice [J]. Exp Toxicol Pathol, 1997, 49(5):
375-380.
[9] Kusters S, Tiegs, G, Alexopoulou L, et al. In vivo
evidence for a functional role of both tumor necrosis
factor (TNF) receptors and transmembrand TNF in
experimental hepatitis [J]. Eur J Immunol, 1997, 27(11):
2870-2875.
[10] Carpino G, Morini S, Ginanni S C, et al. Alpha-SMA
expression in he-patic stellate cells and quantitative
analysis of hepatic fibrosis in cirrhosis and in recurrent
chronic hepatitis after liver transplantation [J]. Dig Liver
Dis [J]. 2005, 35: 349-356.
[11] Zou Y H, Yang Y, Li J, et al. Potential therapeutic effects
of a traditional Chinese formulation, BJ-JN, on liver
fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats [J]. J
Ethnopharmacol, 2008, 120(3): 452-457.
[12] 倪春艳, 郑仕中, 陆 茵, 等. 以瘦素为靶点中药单体
成分防治肝纤维化研究策略及进展 [J]. 中草药, 2011,
42(9): 1837-1841.
[13] Yuan L P, Chen F H, Ling L, et al. Protective effects of
total flavonoids of Bidens bipinnata L. against carbon
tetrachloride-induced liver fibrosis in rats [J]. J Pharm
Pharmacol, 2008, 60(10): 1393-14.
[14] 刘兆凤, 胡金芳, 马 洁, 等. 丹参滴丸对 CCl4诱导的
大鼠肝纤维化的影响及其作用机制 [J]. 中草药, 2012,
43(10): 1991-1996.