全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 5 期 2011 年 5 月

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我国仙茅属植物遗传关系的 RAPD 分析
李隆云，陈大霞，钟国跃，李泉森
重庆市中药研究院中药种植研究所, 重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心, 重庆 400065
摘 要：目的 从分子水平研究我国仙茅属（Curculigo Gaertn.）植物的遗传关系。方法 对我国仙茅属植物 7 个国产种 30
个单株进行 RAPD 分析。运用 Popgene Version1.31 软件计算相关参数，采用 UPGMA 聚类法进行聚类分析。结果 11 个 RAPD
引物共扩增出 157 条带，其中有 145 条呈多态性。我国仙茅属植物的遗传多样性极为丰富，在物种水平上，多态位点百分率
（PPB）为 92.36%，平均每个位点的有效等位基因数（Ne）为 1.493 7, Nei’s 基因多样性指数（H）为 0.300 1，Shannon’s 多
样性信息指数 Hsp 为 0.457 7。在种内水平上，PPB＝5.09%，Ne＝1.036 6，H＝0.020 4，种内 Shannon’s 多样性信息指数（Hpop）
为 0.029 8。Nei’s 基因多样性指数计算的种间遗传分化系数（Gst＝0.931 3）与 Shannon’s 分化系数（0.934 9）基本一致，均
说明大部分遗传变异存在于种间。种间基因流（Nm）为 0.036 9，说明种间基因流动较少，遗传分化程度较高。两种间的 Nei’s
遗传一致度（I ）的范围为 0.520 8～0.823 7。根据 Nei’s 遗传距离进行 UPGMA 聚类，基于 RAPD 分子标记的聚类结果与传
统分类一致。结论 我国仙茅属植物的遗传多样性十分丰富，且种间的遗传差异大于种内的遗传差异。
关键词：仙茅属；随机扩增多态性 DNA；遗传多样性；聚类分析；多态性条带
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)05 - 0980 - 05
Analysis on genetic relationship of plants in Curculigo Gaertn. from China by RAPD
LI Long-yun, CHEN Da-xia, ZHONG Guo-yue, LI Quan-sen
Chongqing Engineering Research Center for Fine Variety Breeding Techniques of Chinese Materia Medica, Institute of Chinese
Materia Medica Planting, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China
Abstract: Objective The genetic relationship of plants in Curculigo Gaertn. was analyzed in molecular level. Methods Thirty
individuls of seven species in Curculigo Gaertn. were employed to be analyzed by the approach of random amplified polymorphic
DNA (RAPD).The parameters were calculated by Popgene Version 1.31 and the relationship was constructed based on UPGMA
method. Results Eleven primers screened out from 40 primers were used for RAPD amplification. A total of 157 bands were
generated, of which 145 bands were polymorphism bands. The result showed that there was a high genetic diversity among the seven
species in Curculigo Gaertn. At species level: percentage of polymorphic loci PPB was 92.36%, effective number of alleles Ne was
1.493 7, Nei’s gene diversity H was 0.300 1, and Shannon’s information index Hsp was 0.457 7; Within species levels: PPB was 5.09%,
Ne was 1.036 6, Nei’s gene diversity H was 0.020 4, and Shannon’s information index Hpop was 0.029 8. The Nei’s coefficient of
genetic differentiation was 0.931 3, which was consistent with the Shannon’s coefficient of genetic differentiation (0.934 9). Most of
the genetic variation existed among populations. The gene flow was 0.036 9, which indicated that it was less among the populations
and the degree of genetic differentiation was higher. Neis genetic identity (I) was changed from 0.520 8 to 0.823 7. By clustering
analysis, the classified result of RAPD marker was almost same with the traditional modal character. Conclusion The genetic
diversity of the seven species in Curculigo Gaertn. is high. The genetic difference among populations is higher than that within the
species.
Key words: Curculigo Gaertn.; random amplified polymorphic DNA (RAPD); genetic diversity; clustering analysis; polymorphic bands

全世界共有仙茅属（Curculigo Gaertn.）植物 20
余种，中国有 7 种，主产于西南和华南地区[1]。该
属植物被药用的主要有两种，为仙茅和大叶仙茅，
仙茅属的其余种药用很少，因此，基原鉴定是临床
用药安全的保证。关于我国仙茅属植物的分类除了
依据其花等外部形态特点进行鉴定外，还可以依据

收稿日期：2010-11-25
基金项目：国家科技攻关计划项目（2001BA701A32，2004BA604A04）；重庆市科技计划项目（6455）
作者简介：李隆云（1964—），男，四川巴县人，重庆市中药研究院副院长，研究员，博士，长期从事药用植物栽培及分子生物学研究，国家
中医药管理局重点学科中药生药学学科带头人。Tel: (023)89029118 E-mail: lilongyun8@163.com
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核型特征及花粉、种子的显微特征进行鉴定[2-4]。随
着分子生物学的发展，分子标记技术[5-6]已应用到仙
茅属遗传关系的研究中，为仙茅属物种的分类鉴定
提供了更为快捷的方法，但已有的研究未涉及到种
内遗传关系及遗传多样性。本研究以我国仙茅属植
物 7 个种 30 个个体为对象，采用 RAPD 分子标记
技术，分析我国仙茅属植物种间及种内的遗传多样
性及遗传关系，为资源的可持续利用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
仙茅属植物 7 个国产种（表 1）于 2002 年 4 月
至 2003 年 12 月采自四川、重庆、云南、广西、海
南，种植于重庆市中药研究院药用植物标本园。由
重庆中药研究院生药栽培室秦松云副研究员、李泉
森副研究员及成都中医药大学卫莹芳教授进行物种
鉴定。在成熟植株上选择当年萌发的幼嫩叶片，低
温下带回实验室，洗净晾干后，用于基因组 DNA
的提取。
表 1 实验材料
Table 1 List of materials used
序号 材料名称 拉丁学名 组 别 来 源 取样个体编号
1 绒叶仙茅 C. crassifolia 大叶仙茅组 云南文山 1～3
2 中华仙茅 C. sinensis 大叶仙茅组 云南金平 4～7
3 短葶仙茅 C. breviscapa 大叶仙茅组 广西扶绥 8～11
4 疏花仙茅 C. gracilis 大叶仙茅组 重庆南川 12～16
5 大叶仙茅 C. capitulata 大叶仙茅组 重庆南山 17～21
6 光叶仙茅 C .glabrescens 仙茅组 海南保葶 22～25
7 仙茅 C. orchioides 仙茅组 四川宜宾 26～30

1.2 基因组 DNA 的提取
将仙茅属植物的 7 个种，共 30 个个体采用
CTAB 法提取基因组 DNA，用 Smart SpeeTM3000
型分光光度计（Bio-Rad 公司）测定其质量浓度和
质量分数。将每个个体的基因组 DNA 质量浓度稀
释为 40 ng/μL。
1.3 RAPD-PCR 扩增与产物检测
RAPD 引物购买于北京赛百盛基因有限公司，
dNTP 和 Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司。RAPD
反应体系参照文献方法进行[7]，即 25 μL 体系中
内含 1×PCR buffer、2 mmol/L Mg2+、200 μmol/L
dNTP、20 ng 引物、40 ng 模板、1 U Taq 酶。
PCR 扩增在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice
Model No.TP600 扩增仪（宝生物工程有限公司）上
进行。扩增程序为 94 ℃预变性 5 min，40 循环：
94 ℃变性 30 s，39 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1.5
min，循环结束后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。取 5
μL PCR 扩增产物与 2 μL 6×加样缓冲液混匀，在
1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，电压不超过 5 V/cm。
当溴酚蓝指示剂距离琼脂糖凝胶前沿 2～3 cm 时停
止电泳，用 0.5 μg/mL EB 染色 15～30 min 后，在
Gel Doc 2000 凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）上检测、
照相、记录。
1.4 数据的采集、统计
根据各分子标记的迁移率统计所有的二元数
据，按条带有或无赋值，有带（显性）记为“1”，
无带（隐性）记为“0”，强带和弱带的赋值均为 1，
以此作为数据记录的标准。对于多态性位点，在重
复实验中能稳定出现的差异带用于数据分析。
单个个体分析采用 Treeconw 软件，版本为 1.3。
采用非加权配对组算术平均法（unweighted pair
group method using arithmetic average, UPGMA）建
立系统聚类分支树状图。同时运用 Popgene
Version1.31 软件计算 7 个种总基因多样性（the
whole genetic diversity，Ht）、种内基因多样性（gene
diversity within population，Hsp）、种间基因多样性
（genetic diversity among populations，Dst）、遗传分
化系数（genetic differentiation，Gst）、基因流（the gene
flow，Nm）、Nei’s 基因多样性指数（Nei’s gene
diversity，H），Shannon’s 多样性信息指数（Shannon
information index，Ho），Nei’s 遗传一致度（Neis
genetic identity，I）和遗传距离（genetic distance，D）。
2 结果与分析
2.1 RAPD 遗传多态性分析
本研究从 20 个 RAPD 引物中筛选出谱带清晰
并呈现多态性的 11 个引物，对供试材料进行
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RAPD-PCR 扩增，图 1 为引物 SBSH02 的扩增图谱。
11 个引物扩增的总带数及多态性条带数见表 2。
RAPD 反应扩增片段大部分集中在 200～2 000
bp。11 个引物共扩增出 157 条可区分的 DNA 条带，
每个引物检测到的位点在 3～22，平均每个引物可
扩增出 14.3 条带。这 157 条 DNA 扩增条中，有 145
条带呈多态性，占所观察到的总扩增带的 92.36%，
每个引物可扩增出 2～21 条多态性带，平均每个引
物产生13.5条多态性带。以上RAPD数据分析表明，
仙茅属 7 个种的多态性极为丰富。

图 1 引物 SBSH02 的扩增结果
Fig. 1 Amplification of primer SBSH02
表 2 11 个引物的序列及扩增结果
Table 2 Sequence and amplification of 11 primers
引物名 序 列 总带数 多态性带数 引物名 序 列 总带数 多态性带数
SBSH02 TCGGACGTGA 14 13 SBSJ06 TCGTTCCGCA 14 14
SBSH04 GGAAGTCGCC 14 12 SBSJ07 CCTCTCGACA 12 12
SBSH07 CTGCATCGTG 15 15 SBSJ13 CCACACTACC 22 21
SBSH11 CTTCCGCAGT 3 2 SBSJ14 CACCCGGATG 18 17
SBSJ04 CCGAACACGG 18 16 SBSJ17 ACGCCAGTTC 21 18
SBSJ05 CTCCATGGGG 6 5 总计 157 145

2.2 遗传多样性分析
Popgene 软件分析表明，仙茅属植物 7 个种种
间的遗传多样性非常丰富，种内遗传多样性极低，
结果见表 3。在物种水平上，多态位点百分比（PPB）
为 92.36%、平均每个位点的有效等位基因数（Ne）
为 1.493 7、H 为 0.300 1 和 Hsp 为 0.457 7，结果表
明仙茅属植物 7 个国产种种间的遗传多样性非常丰
富。在种内水平上，Ne为 1.005 5～1.063 9，平均为
1.036 6；Nei’s 基因多样性指数反映了基因的多样性
和基因的分化程度，用 H 估算的种内遗传多样性偏
低，变化幅度在 0.003 8～0.034 6，平均为 0.020 4；用
Shannon’s 多样性信息指数（Hpop）估算种内遗传多
样性，变化幅度在 0.006 1～0.050 0，平均为 0.029 8。
以上 3 个指数估算的种内平均遗传多样性的高低顺
序与 PPB（1.27%～8.28%，平均值为 5.09%）变化
规律基本一致：光叶仙茅＞仙茅＞中华仙茅＞疏花
仙茅＞短葶仙茅＞大叶仙茅＞绒叶仙茅。
2.3 仙茅属植物 7 个种的遗传变异
用 Popgene 计算出的遗传变异分析结果表明：
种间存在着一定的遗传分化。在假设遗传平衡条件
下计算出 7 个种 Ht为 0.297 5，Hs为 0.020 4，种间的
基因多样性（Dst＝Ht－Hs）为 0.277 1， Gst为 0.931 3，
表明有 93.13%的遗传变异存在于种间，6.87%的遗
传变异存在于种内，以上数据表明种间具有极高的
遗传多样性，远大于种内的遗传多样性。基因流
[Nm＝0.5（1－Gst）/Gst]为 0.036 9，表明种间基因交
流处于极低等水平，交流极少。根据 Shannon’s 多
样性信息指数的分析结果（物种水平上Hsp＝0.457 7，
种内水平上 Hpop＝0.029 8），计算出 Shannon’s 种间
分化系数（Hsp－Hpop）/Hsp 为 0.934 9，即有 93.49%
的遗传变异分布在种间，6.51%的遗传变异分布在
种内。
以上 2 种方法的分析结果基本一致，仅存在微
小的差异。两者共同表明仙茅属植物种间的遗传分

19 329 bp
7 743 bp
4 254 bp
3 472 bp
2 690 bp
1 882 bp
1 489 bp

421 bp

74 bp
M 22 23 24 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 26 27 28 29 30
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表 3 仙茅属植物 7 个种的遗传多样性分析
Table 3 Genetic diversity of seven species in Curculigo Gaertn. from China
种 n K PPB/% Na Ne H Ho
1 3 2 1.27 1.012 7 (0.112 5) 1.005 5 (0.048 1) 0.003 8 (0.033 7) 0.006 1 (0.053 6)
2 4 10 6.37 1.063 7 (0.245 0) 1.042 2 (0.180 6) 0.023 9 (0.097 0) 0.035 4 (0.140 4)
3 4 6 3.82 1.038 2 (0.192 3) 1.036 4 (0.184 2) 0.018 6 (0.093 6) 0.025 9 (0.130 6)
4 5 7 4.46 1.044 6 (0.207 1) 1.033 1 (0.158 4) 0.018 7 (0.087 8) 0.027 1 (0.126 8)
5 5 5 3.18 1.031 8 (0.176 2) 1.021 0 (0.131 7) 0.011 7 (0.069 6) 0.017 2 (0.100 0)
6 4 13 8.28 1.082 8 (0.276 5) 1.063 9 (0.228 3) 0.034 6 (0.119 8) 0.050 0 (0.170 5)
7 5 13 8.28 1.082 8 (0.276 5) 1.053 8 (0.189 3) 0.031 8 (0.108 6) 0.047 1 (0.159 4)
平均 8 5.09 1.050 9 (0.212 3) 1.036 6 (0.160 1) 0.020 4 (0.087 2) 0.029 8 (0.125 9)
物种水平 30 145 92.36 1.923 6 (0.266 5) 1.493 7 (0.309 3) 0.300 1 (0.150 7) 0.457 7 (0.199 3)
n-样本数量，K-多态位点数，PPB-多态位点百分数，Na-观察到的等位基因数，Ne-有效等位基因数，H-Nei’s 基因多样性指数，Ho-Shannon’s 多样
性信息指数。括号内数据为标准误差
N-sample size, K-No.of polymorphic loci, PPB-percentage of polymorphic loci, Na-Observed number of alleles, Ne-effective number of alleles, H-Nei’s gene
diversity, Ho-Shannon’s information index
化明显，遗传变异主要存在于种间。
2.4 种间遗传距离和遗传一致度
遗传一致度和遗传距离分别是从相同和相反
2 个方面度量种间遗传关系的指标，遗传距离反
映种间亲缘关系的远近。用 Popgene 计算出了仙
茅属植物 7 个种间的 Nei’s 遗传一致度和遗传距
离。从表 4 可以看出，两种间的 I 在 0.520 8～
0.823 7。疏花仙茅和大叶仙茅之间的遗传距离最
小（0.194 0），疏花仙茅与仙茅之间的遗传距离较
大（0.652 3）。
表 4 仙茅属植物 7 个种种间的遗传一致度和遗传距离
Table 4 Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)
among seven species in Curculigo Gaertn. from China
种 1 2 3 4 5 6 7
1 − 0.740 4 0.722 5 0.710 7 0.704 6 0.602 8 0.628 0
2 0.305 2 − 0.781 5 0.751 6 0.761 1 0.638 5 0.536 3
3 0.325 0 0.264 9 − 0.739 3 0.725 4 0.671 4 0.598 1
4 0.341 4 0.300 7 0.302 0 − 0.823 7 0.610 5 0.520 8
5 0.350 2 0.284 0 0.321 1 0.194 0 − 0.607 9 0.532 6
6 0.506 2 0.465 6 0.398 4 0.493 5 0.497 7 − 0.661 3
7 0.465 3 0.635 6 0.514 0 0.652 3 0.630 0 0.413 5 −
.
2.5 仙茅属植物 7 个种聚类分析
用 Treeconw 软件计算供试材料间的遗传相似
系数，按 UPGMA 法进行聚类分析，建立聚类分支
树状图（图 2）。RAPD 标记可以将仙茅属植物 7 个
种完全区别开，个体均聚在同一种内，且仙茅属的
2 个组聚类非常明显：仙茅组中的仙茅与光叶仙茅
聚为一类，大叶仙茅组中的 5 个种聚为一类。其中，
在大叶仙茅组中，疏花仙茅与大叶仙茅、短葶仙茅
与中华仙茅分别聚为一类，二者再与单独聚为一支
的绒叶仙茅聚在一起。以上聚类结果与传统形态学
分类结果极为相似。
3 讨论
我国仙茅属植物 7 个种的植物学性状表现出极
高的形态多样性，从植株高矮到花序、花子房顶端
喙、叶片质地等都表现出很大变异。李隆云等[8]采用
新型标记 SRAP 研究仙茅属植物 7 个国产种的遗传
关系，多态性比率为 98.6%，从分子水平揭示 7 个
国产种之间存在着极大的遗传差异。本研究采用
RAPD 标记同样证实种间具有丰富的遗传变异，且
大部分的遗传变异产生于种间，种内的遗传分化处
于极低水平。种内遗传多样性极低可能与取样的个
体数量有一定关系，以仙茅最为丰富。
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图 2 仙茅属 7 个种 UPGMA 聚类图
Fig. 2 Dendrogram of seven species in Curculigo Gaertn. from China by UPGMA
本研究中RAPD标记聚类结果及已有分子生物
学研究结果均证实[8]，仙茅组的仙茅和光叶仙茅的
亲源关系最近，无论采用何种分析方法，二者均聚
为一类，大叶仙茅组的 5 个种则聚为另一类，这与
传统分类的相似度极高。大叶仙茅组的 5 个种之间
采用不同的分类方法，其聚类先后结果略有差异。
这可能与仙茅属植物植株形态的多样性和物种分
布有关。从植株外部形态看，表现最为突出的是植
株的高矮，仙茅组的 2 个种植物均较为矮小，而大
叶仙茅组中的 5 个种，除疏花仙茅植株相对小一些
外，其余均为高大植株。从物种自然分布看，绒叶
仙茅与中华仙茅分布区重叠，疏花仙茅、短葶仙茅、
绒叶仙茅均在大叶仙茅分布区的一定地区范围分
布，显示仙茅属这 5 个物种间的遗传关系的复杂性。
从研究结果可以看出，基于 RAPD 分子标记的
聚类分析结果与仙茅属经典分类具有很好的相似
度，说明 RAPD 分子标记技术的可靠性和重现性，
可作为仙茅属物种资源的分类和遗传亲缘关系研
究的有效方法之一，能对仙茅属植物物种资源作出
客观、真实的结论。同时也从分子水平上证实，传
统经典分类中将仙茅属植物划分为仙茅组和大叶
仙茅组是有科学依据的。
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14
15
12
13
16
19
18
21
17
20
8
10
9
11
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4
6
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2
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疏花仙茅
大叶仙茅
短葶仙茅
中华仙茅
绒叶仙茅
光叶仙茅
仙茅