全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 285 •
HPLC 法测定黄连复方汤中盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、
盐酸巴马汀和甘草酸
纪丽莎，张先福*，喻卫武，陈安良
浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300
摘 要：目的 测定黄连复方汤中盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀和甘草酸 5 种成分。方法 采用高效液相色
谱法。结果 盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀和甘草酸的线性范围分别为：375～1 500 ng、9.091～44.440 ng、
40.130～67.000 ng、130～2 064 ng、2.400～60.000 ng（r＞0.999），平均加样回收率大于 98.0%。结论 该方法准确，重现性
好，能更好地控制黄连复方汤的质量。
关键词：黄连复方汤；盐酸小檗碱；表小檗碱；药根碱；盐酸巴马汀；甘草酸
中图分类号：R284.2；R286.02 文献标志码：B 文章编号：0253 - 2670(2011)02 - 0285 - 03
Determination of berberine hydrochloride, epiberberine, jatrorrhizine, palmatine,
and glyeyrrhizinate in Coptidis Rhizoma Compound Decoction by HPLC
JI Li-sha, ZHANG Xian-fu, YU Wei-wu, CHEN An-liang
Breeding Base, State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300,
China
Key words: Coptidis Rhizoma Compound Decoction; berberine hydrochloride; epiberberine; jatrorrhizine; palmatine; glyeyrrhizinate

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌引起的对
养鸭业危害最严重的传染病。采用抗生素治疗该病
时极易产生耐药性。黄连复方汤由黄连、黄柏和甘
草 3 味中药组成，具有清热燥湿、泻火解毒、缓急
止痛功效，经由饮水途径给药对人工发病鸭保护率
达 90%，对自然发病时临床症状较严重的病鸭治愈
率为 52%；在鸭群自然散发里氏杆菌病期间，提前
给健康鸭用药，可有效控制该病的蔓延[1]。本课题
组拆方研究发现，黄连复方汤煎剂在体外对里氏杆
菌有明显的抑菌作用，但其组成的各单味药在体内
单独给药却并无抗病效果。即使直接注射黄连中主
要有效成分小檗碱也无治疗作用。黄柏和甘草各自
的水煎剂在体外均无抑制里氏杆菌效果，在体内单
独或者两者组合给药也无抗病效果，甚至单独给黄
柏煎剂还引起鸭死亡率升高，提示在抑制和抵抗里
氏杆菌的增殖和攻击方面，这 3 味药物具有协同和
增强作用，缺一不可。为了确立合理的黄连复方汤
质量标准，探索适宜的复方有效成分分析方法，并
为进一步研究抗病分子机制，开发具有自主知识产
权的新兽药奠定基础，根据药典[2]，本实验选择盐
酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀以及甘
草酸作为黄连复方汤的测定指标，建立了定量测定
方法。
1 仪器与试剂
Waters2695高效液相色谱仪（美国Water公司），
微量分析天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；
SK3200LHC 超声波清洗机（上海科导超声仪器有
限公司）；Millipore Simplicity 型超纯水器（美国
Millipore 公司）。
盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀
和甘草酸对照品（批号分别为 06/081015、06/
081015、07/081015、10/071015、02/081015）购于上
海诗丹德生物技术有限公司，质量分数均大于 98%；
乙腈，甲醇（色谱纯，德国默克公司）；水为重蒸水，
氧化铝（分析纯，100～200 目，由上海陆都化学试
剂厂生产），其他试剂均为分析纯。

收稿日期：2010-06-17
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y3090613）；浙江省教育厅重点项目（Z200906965）；浙江林学院科研发展基金资助项目（2351000746）
作者简介：纪丽莎（1984—），女，河北人，硕士，从事中兽医药理毒理学研究。E-mail: jls59@yahoo.cn
*通讯作者 张先福 E-mail: zhangxianfu@yahoo.cn
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药材经浙江农林大学中药学科胡润淮教授鉴
定，分别为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.
的干燥根茎（批号 20090327）、关黄柏 Phellodendron
amurense Rupr.干燥树皮（批号 091010）和豆科植
物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.（批号 091010）
均购于杭州中医院。药材用去离子水漂洗（洗去浮
尘与污物），于恒温干燥箱中 60 ℃干燥，粉碎，过
40 目筛，干燥条件至恒重，备用。黄连复方汤按照
处方规定自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 盐酸小檗碱[3] Welch XB C18 色谱柱（150
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶
液（40∶60，含十二烷基磺酸钠 0.1 g/100 mL），体
积流量 1.0 mL/min，检测波长 365 nm，柱温 25 ℃。
2.1.2 表小檗碱[4]和药根碱[5] Sunfire C18 色谱
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.05
mol/L 磷酸二氢钾溶液（磷酸调 pH 3.0）（25∶
75），体积流量 1.0 mL/min，检测波长 265 nm，
柱温 25 ℃。
2.1.3 盐酸巴马汀[6] Welch XB C18 色谱柱（250
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.5%三乙胺
溶液（28∶72，磷酸调节至 pH 2.9），体积流量 1.0
mL/min，检测波长 348 nm，柱温 25 ℃。
2.1.4 甘草酸 [7] Welch XB C18 色谱柱（ 250
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-冰醋酸
（70∶30∶1），体积流量 1.0 mL/min，检测波长 250
nm，柱温 25 ℃。
2.2 供式品溶液的制备
将适量黄连复方汤超声提取 60 min，补足质量，
离心，吸取上清液 4 mL 加到氧化铝柱（8 g，100～
200 目，105 ℃活化 1 h）上，用甲醇 100 mL 洗脱，
收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至 2 mL
量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜
滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱
和盐酸巴马汀的对照品适量，用乙腈溶解稀释，分
别配成 1.50、1.51、1.80、1.29 mg/mL 的储备液，
即得。精密称取甘草酸的对照品适量，用甲醇溶解
稀释，配成 1.20 mg/mL 储备液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按照处方组成，取除甘草外其余药材粉末按照
供试品溶液的制备项下方法操作，即得。因为黄连
和黄柏药材含有盐酸小檗碱、表小檗碱、盐酸巴马
汀和药根碱，所以未设计生物碱的阴性试验。
2.5 线性关系考察
依次精密吸取盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、
盐酸巴马汀和甘草酸对照品溶液 2、4、6、8、10 μL，
按上述色谱条件进样测定。以进样质量为横坐标，
峰面积为纵坐标进行线性回归，得 5 种成分的回归
方程、相关系数及线性范围，见表 1。
表 1 标准曲线的回归方程
Table 1 Regression equation of standard curve
成分 回归方程 r 线性范围/ng
盐酸小檗碱 Y＝38 955 791.048 X＋8 047 995.500 0.999 3 375～1 500
表小檗碱 Y＝120 116 636.295 X＋1 370 320.606 0.999 0 9.091～44.440
药根碱 Y＝4 500 027 836.865 X－1 311 503.051 0.999 0 40.130～67.000
盐酸巴马汀 Y＝32 496 134.867 X＋319 637.333 0.999 0 130～2 064
甘草酸 Y＝6 755 880.952 X＋15 570.000 0.999 1 2.400～60.000

2.6 精密度试验
精密吸取盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、盐
酸巴马汀以及甘草酸对照品溶液，按上述色谱条件
重复进样 5 次，每次 5 μL，测定组分的峰面积，计
算得各成分峰面积的 RSD 分别为 1.15%、0.78%、
1.2%、1.69%、2.13%。
2.7 重现性试验
取批号 20081229 样品 3 份，制备供试品溶液，
每次进样 5 μL，测定 3 次，取平均值。结果盐酸小
檗碱、表小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀以及甘草酸
质量浓度的 RSD 分别为 0.37%、0.78%、0.46%、
0.99%、1.2%。
2.8 稳定性试验
取批号 20081229 样品，制备供试品溶液，分
别在 1、2、4、6、8、24 h 取样测定，结果甘草酸
在 6 h 内质量浓度稳定，盐酸小檗碱，表小檗碱，
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药根碱，盐酸巴马汀在 24 h 内质量浓度无明显变
化，其 RSD 分别为 0.93%、0.81%、0.64%、0.77%、
0.71%。
2.9 加样回收率试验
取批号 20081229 样品适量，分别加入盐酸小檗
碱对照品 1.5 mg，表小檗碱对照品 1.6 mg，药根碱
对照品 1.0 mg，盐酸巴马汀对照品 0.35 mg 和甘草
酸对照品 1.38 mg，制备供试品溶液，进样测定，
重复 5 次。结果盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、
盐酸巴马汀、甘草酸的平均回收率分别为 100.9%、
98.74%、98.96%、99.38%、98.5%，RSD 分别为
1.05%、1.19%、0.95%、1.22%、1.15%。
2.10 测定结果
制备了 3 批黄连复方汤，在以上色谱条件下测
定 5 种有效成分的峰面积，将峰面积值代入回归方
程，计算质量浓度，结果见表 2。
表 2 黄连复方汤中盐酸小檗碱、表小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀和甘草酸的测定（n＝3）
Table 2 Determination of berberine hydrochloride, epiberberine, jatrorrhizine, palmatine, and glyeyrrhizinate
in Coptidis Rhizome Compound Decoction (n＝3)
质量浓度/(mg·mL−1) 批号
盐酸小檗碱 表小檗碱 药根碱 盐酸巴马汀 甘草酸
20081229 5.7100 0.299 7 0.108 7 0.2540 0.009 9
20090101 5.7000 0.299 4 0.109 1 0.2510 0.010 2
20090102 5.7200 0.299 9 0.108 3 0.2550 0.009 8

3 讨论
参照文献报道[7]中甘草酸的分离，选择流动相
为甲醇-醋酸铵、甲醇-磷酸体系，但在此流动相条
件下甘草酸的色谱图峰形较差，且难于达到基线分
离。在此基础上改用甲醇-水系统，结果所得色谱图
以甲醇-水-冰醋酸（70∶30∶1）洗脱为最佳，甘草
酸能达到较好分离，理论塔板数高于 5 000。
甘草加水分解后可产生二分子葡萄糖醛酸和一
分子 18β-甘草次酸，甘草次酸是甘草甜素结构中的
活性部分，本实验共进行了 6 种有效成分测定，其
中包括甘草次酸，但在本实验的高效液相色谱测定
中甘草次酸却没有被检测出来，据推测可能与水的
温度有关。该甘草次酸是否是由复合物分解所致以
及如果是由分解产生，其分解的机制如何，有待进
一步探讨[8]。
甘草酸是甘草甜味的主要来源，推测其量应在
0.03～0.07 mg/g，但在黄连复方汤中，实际量却远
远少于这个数值。根据理化性质分析：甘草含三萜
类、黄酮类、生物碱类和多糖类物质。三萜皂苷类
化合物：甘草酸水解后得二分子葡萄糖醛酸和 18 β-
甘草次酸，其结构式中含有羧基。黄连和黄柏都含
有生物碱并且主要生物碱的结构母核多为苄基异喹
啉原小檗碱型，氮原子为季铵型。小檗碱具有 α-羟
胺结构，在碱性下能有醇式、季铵式、醛式 3 种互
变的结构式，其中以季铵式最稳定，可以离子化呈
强碱性。这样羧基中电离的氢离子会和季铵式中的
氢氧根离子发生酸碱中和反应，使得甘草在煎剂中
的煎出量可因配伍其他中药而有很大差异。
致谢：浙江农林大学袁珂教授、张汝民教授、
林海萍副教授、胡润淮教授和张新凤副教授对本稿
提出的意见和建议。特别感谢河北农业大学马玉忠
教授给予的支持。
参考文献
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