全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 15 期 2013 年 8 月

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川续断种质资源遗传多样性的 SRAP 分析
艾 强 1，周 涛 1*，江维克 1，袁 媛 2，肖承鸿 1，熊厚溪 1，贺 勇 3
1. 贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002
2. 中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700
3. 贵州同济堂制药有限公司，贵州 贵阳 550002
摘 要：目的 开展川续断种质资源的遗传多样性研究，为合理利用川续断种质资源提供理论依据。方法 运用 SRAP 分子标
记方法对川黔境内川续断的遗传多样性进行分析。结果 10 对引物共检测到 124 个位点，其中 102 个位点具有多态性，多态位
点百分率（PPL）为 82.26%。川续断总的 Nei’s 基因多样性指数（H）为 0.280 0，Shannon’s 多态性信息指数（I）为 0.435 3；
居群水平上川续断的 PPL 为 53.92%，H 为 0.121 2～0.244 0、I 为 0.179 6～0.361 1，其中 5 个高海拔、小生境特征的居群遗
传多样性指标较高。居群间的基因分化系数 Gst 为 0.293 0，基因流（Nm）为 1.206 4。基于遗传相似度，14 个居群可聚为 3
类。结论 川续断居群的遗传多样性水平丰富，遗传变异主要存在居群内，地理位置（海拔）和气候是川续断居群遗传多样
性较高的影响因素，而地理隔离（小生境）是造成居群内遗传变异高于居群间的另一因素。
关键词：川续断；种质资源；遗传多样性；居群；SRAP
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)15 - 2155 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.15.023
SRAP analysis on genetic diversity for germplasm resources of Dipsacus asper
AI Qiang1, ZHOU Tao1, JIANG Wei-ke1, YUAN Yuan2, XIAO Cheng-hong1, XIONG Hou-xi1, HE Yong3
1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China
2. National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medicinal Sciences, Beijing 100700, China
3. Guizhou Tongjitang Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550002, China
Abstract: Objective To study the genetic diversity of Dipsacus asper from different populations and provide a reference for the
rational utilization of its germplasm. Methods The genetic diversity of the 14 populations of D. asper was analyzed by SRAP
molecular markers. Results Ten pairs of primers produced 124 sites, among which 102 were polymorphic sites. The percentage of
polymorphic loci (PPL) was 82.26%. The Nei’s genetic diversity index (H) and the Shannon’s information index (I) were 0.280 0 and
0.435 3, respectively. At the population level, PPL was 53.92%, H was 0.121 2－0.244 0, and I was 0.179 6－0.361 1. The genetic
diversity values of the five populations were relatively high, and the populations had the characteristics of high altitude and
microhabitat. Genetic differentiation coefficient (Gst) was 0.293 0, gene flow (Nm) was 1.206 4. Cluster analysis based on genetic
similarity indicated that the 14 populations could be divided into three groups. Conclusion The genetic diversity among the
populations of D. asper was at relatively high level. The genetic variance of D. asper mainly existed within the populations. The high
genetic diversity could be attributed to the geographical position (altitude) and climate, while geographic isolation (microhabitat) was
another important factor for the genetic variance within the populations.
Key words: Dipsacus asper Wall. ex Henry; germplasm resources; genetic diversity; population; sequence related amplified polymorphism

川续断 Dipsacus asper Wall. ex Henry 为常用中
药材，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏的功
能，用于肝肾不足、腰膝酸软、风湿痹痛、跌扑损
伤、筋伤骨折、崩漏、胎漏等症的治疗[1]。我国贵
州、四川、云南、湖北为川续断野生资源的主要分
布区，大部分采收的药材经两广、四川集散后销往

收稿日期：2013-03-02
基金项目：国家自然科学地区基金资助项目（81160501）；国家“十一五”科技支撑项目（2009BA174B01）；贵阳市科技创新公共技术平台项
目（2010 筑科合字第 3-2 号）
作者简介：艾 强（1977—），男，硕士，主要从事中药资源鉴定与评价研究。Tel: 13511991672 E-mail: aiqiang2011@163.com
*通信作者 周 涛（1968—），女，教授。E-mail: taozhou88@163.com
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全国。近年来，在一些中成药如“仙灵骨葆胶囊”、
“骨康胶囊”、“大活络丹”、“祛风止痛片”等的市场
需求带动下，对川续断药材资源的需求急剧增加。
据文献报道[2-3]和本课题组前期的研究结果，川续断
药材的质量不仅随产地不同有差异，而且不同原植
株间的植物学性状、栽培抗性等也存在较明显差别，
提示川续断存在丰富的生物多样性。但就目前有关
川续断种质资源的遗传多样性研究还鲜见报道。
遗传多样性是指种内不同居群之间和同一居群
不同个体之间的遗传变异的总和，它是生物多样性
的基础和内在形式。近年来，利用分子标记技术开
展药用植物种质资源研究已有广泛报道[4-7]。其中的
相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术可反
映生物体基因组内含子、间隔序列及启动子长度的
多态性水平，具有简便、易从序列中得到分离的条
带等优点[8]。本实验运用 SRAP 分子标记方法对
川黔境内的川续断种质资源开展遗传多样性水平
分析，旨在通过阐明川续断物种、居群之间及个
体的遗传分布水平，为合理利用川续断种质资源、
探讨川续断道地药材品质形成的影响机制提供理
论基础。
1 材料、仪器与试剂
1.1 材料
样品于 2009—2011 年采自四川西昌、盐源，贵
州六枝、雷山、关岭、盘县等 14 个地区的不同生境，
统一种植于贵州省龙里县麻芝乡贵州同济堂中药材
种植公司的川续断种质资源圃。2012 年 3 月采集 14
个居群共 140 单株样的新鲜幼嫩叶片，置−20 ℃冰
箱保存。所有样品凭证标本均经贵阳中医学院生药
教研室江维克教授、魏升华副教授共同鉴定。见表 1。
表 1 实验材料
Table 1 Experimental materials
居群编号 采集地 样本数 经度（E） 纬度（N） 海拔 / m
1 贵州六枝堕却乡 10 105°15′ 26°17′ 1 777
2 贵州雷山西江镇 10 108°12′ 26°30′ 1 353
3 贵州关岭永宁镇 10 105°31′ 25°56′ 1 314
4 贵州盘县旧营乡 10 104°45′ 25°49′ 1 578
5 贵州大方长石镇 10 105°40′ 27°31′ 1 632
6 贵州麻江龙山镇 10 107°41′ 26°30′ 914
7 贵州盘县羊场镇 10 104°49′ 25°52′ 1 700
8 贵州开阳禾丰乡 10 106°53′ 26°54′ 1 300
9 贵州龙里龙山镇 10 106°56′ 26°27′ 1 140
10 贵州水城野钟乡 10 104°53′ 26°18′ 2 090
11 贵州修文扎佐镇 10 106°42′ 26°52′ 1 296
12 贵州大方凤山乡 10 105°44′ 27°16′ 1 866
13 四川西昌大箐乡 10 102°20′ 27°46′ 1 933
14 四川盐源卫城镇 10 101°39′ 27°27′ 2 452

1.2 仪器与试剂
PCR 仪（Mastercycler，德国 Eppendof）；凝胶成
像系统（GGM/D2，英国 Syngene）；核酸定量分析仪
（Nanodrop 2000，美国 Thermo）；电泳仪（DYY—6C
型，北京六一仪器厂）；冷冻离心机（Centrifuge
5810R，德国 Eppendof）；植物基因组 DNA 提取试
剂盒（离心柱型，Tiangen 公司）；Premix Ex TaqTM
Version 2.0（Loading dye mix，宝生物工程大连有限
公司）；5×TBE 缓冲液（Tris 硼酸电泳缓冲液，临
用前配成 0.5×TBE）；琼脂糖（西班牙 Biowest
agarose）；EB（溴化乙锭溶液 RT203，Tiangen 公司）；
Marker（D2000，Tiangen 公司）。
2 方法
2.1 基因组 DNA 的提取
采用 DNA 提取试剂盒提取各单株基因组
DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量，核
酸定量分析仪检测 DNA 的纯度和质量浓度，并将质
量浓度调整为 20 ng/μL，−20 ℃保存备用。
2.2 SRAP 引物的合成与筛选
SRAP 引物序列参考加州大学蔬菜作物系Li 等[8]
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发表的序列，由上海捷瑞生物工程公司合成，共 80
对。以居群 6 的 2 号个体 DNA 为模板，筛选多态
性好、条带清晰的引物用于川续断种质资源遗传多
样性分析。
2.3 PCR 扩增与产物检测
反应体系为：Ex Taq mix 10 μL，引物正反向各
1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 补足至 20 μL。扩增
程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃、30 s，35 ℃、60 s，
72 ℃、60 s，5 个循环；94 ℃、30 s，35 ℃、60 s，
72 ℃、60 s，35 个循环；72 ℃后延伸 10 min，4 ℃
保存。PCR 产物 5 μL 于 1.5%琼脂糖凝胶中电泳 1 h
后在凝胶成像系统下观察并拍照。
2.4 数据统计与分析
2.4.1 条带记录 从 80 对 SRAP 引物中筛选出 10
对条带清晰、多态性丰富、重复性好的引物。10 对
引物针对某一同源带（同一引物扩增的电泳迁移率
一致的条带），有记作“1”，无记作“0”，只判读清
晰易辨的扩增带，生成“0，1”二态性数据矩阵。
对于多态性位点，将重复试验中能稳定重复出现的
条带做统计分析。
2.4.2 数据分析 运用 POPGENE 1.32 软件进行遗
传参数分析，运用 NTSYS 2.1 软件对川续断居群进
行聚类分析，构建遗传聚类图。
3 结果与分析
3.1 川续断 SRAP-PCR 扩增结果
结果显示，10 对引物共扩增 124 个位点，每对
引物最少扩增 9 个位点，最多扩增 15 个位点，平均
每对引物扩增 12 个位点。扩增片段大小在 100～
1 600 bp，见图 1、2。其中，多态性位点 102 个，
多态性位点百分率（PPL）为 82.26%。引物 ME1EM8
和 ME1EM4 的 PPL 最高，ME3EM12 的 PPL 最低。
见表 2。
3.2 川续断的遗传多样性与遗传变异水平
川续断在物种水平上的 PPL 达到 82.26%，H
为 0.280 0，I 为 0.435 3，显示出较高的遗传多样性
水平。居群水平上川续断的 PPL 为 53.92%，H 在
0.121 2～0.244 0、I 在 0.179 6～0.361 1，其中居群
1、4、5、10 和 13 的遗传多样性较高，居群的 I 值
均达到 0.300 0 以上。而居群 2、6、7 和 12 的遗传
多样性低。见表 3。
3.3 川续断的遗传多样性 Nei’s 分析
川续断总的基因多样性（Ht）为 0.280 0，川
续断居群内和居群间基因多样性分别为 0.198 0

M-Marker，1～50 依次为 1、2、3、4 及 5 居群的 10 个个体样本
M-Marker, 1—50 are samples of 1, 2, 3, 4, and 5, respectively
图 1 引物 ME3EM11 对川续断居群样品的 SRAP 扩增图
Fig. 1 SRAP electrophoresis of D. asper population
samples amplified with Primer ME3EM11

M-Marker，51～100 依次为居群 10～14 的 10 个个体样本
M-Marker, 51－100 are samples of 10－14, respectively
图 2 引物 ME1EM4 对川续断居群样品的 SRAP 扩增图
Fig. 2 SRAP electrophoresis of D. asper population
samples amplified with Primer ME1EM4
和 0.082 0，分别占 Ht 的 70.70%、29.30%。居群
间基因分化系数（Gst）为 0.293 0，即有 29.30%
的遗传变异存在于居群间，70.70%的遗传变异存
在于居群内，显示川续断居群内的遗传变异大于
居群间的遗传变异。川续断居群的平均基因流
（Nm）为 1.206 4＞1.0，表明各居群间的基因流
水平较高。
3.4 川续断居群的 UPGMA 聚类
依据 Nei’s 遗传相似度，以 NTSYS 2.1 软件构
建的遗传聚类图显示，当遗传相似度为 0.88 时，川
续断居群明显聚为 3 大类：居群 12 独立为 1 类；居
M 50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26
M 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
2 000 bp
1 000 bp
700 bp
500 bp
200 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
700 bp
500 bp
200 bp
100 bp

M 100 99 98 97 96 95 94 93 92 91 90 89 88 87 86 85 84 83 82 81 80 79 78 77 76
M 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60 59 58 57 56 55 54 53 52 51
2 000 bp
1 000 bp
700 bp
500 bp
200 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
700 bp
500 bp
200 bp
100 bp
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表 2 SRAP 引物组合的扩增结果及其多态性
Table 2 Amplification results and polymorphism of SRAP primer combinations
引物名称 正向序列 反向序列 总带数 多态性带数 PPL / %
ME3EM16 TGAGTCCAAACCGGAAT GACTGCGTACGAATTAAC 14 12 85.71
ME3EM12 TGAGTCCAAACCGGAAT GACTGCGTACGAATTCAA 12 7 58.33
ME3EM11 TGAGTCCAAACCGGAAT GACTGCGTACGAATTCGG 15 12 80.00
ME1EM12 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTCAA 10 8 80.00
ME1EM16 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTAAC 14 12 85.71
ME1EM8 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTGCC 13 13 100.00
ME1EM4 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTTGA 12 12 100.00
ME1EM2 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTTGC 12 8 66.67
ME10EM17 TGAGTCCAAACCGGTCT GACTGCGTACGAATTGAC 9 6 66.67
ME10EM16 TGAGTCCAAACCGGTCT GACTGCGTACGAATTAAC 13 12 92.31
合计 — — 124 102 82.26

表 3 不同居群川续断遗传多样性比较分析
Table 3 Comparative analysis on genetic diversity in different D. asper populations
居群编号 多态位点数 PPL / % Na Ne H I
1 78 62.90 1.629 0±0.485 0 1.401 4±0.398 4 0.227 7±0.210 1 0.336 3±0.295 3
2 60 48.39 1.483 9±0.501 8 1.307 7±0.380 9 0.176 7±0.204 8 0.261 9±0.292 9
3 60 48.39 1.483 9±0.501 8 1.336 0±0.393 9 0.189 9±0.212 4 0.277 7±0.303 2
4 82 66.13 1.661 3±0.475 2 1.471 6±0.394 9 0.265 2±0.209 5 0.386 4±0.296 1
5 73 58.87 1.588 7±0.494 1 1.381 5±0.401 9 0.215 8±0.211 0 0.318 6±0.297 5
6 42 33.87 1.338 7±0.475 2 1.214 6±0.360 4 0.121 2±0.190 4 0.179 6±0.272 0
7 58 46.77 1.467 7±0.501 0 1.287 8±0.381 5 0.164 1±0.203 6 0.243 9±0.289 5
8 66 53.23 1.532 3±0.501 0 1.359 3±0.396 4 0.203 1±0.213 1 0.297 8±0.302 8
9 66 53.23 1.532 3±0.501 0 1.335 3±0.394 6 0.190 3±0.208 9 0.281 9±0.295 6
10 82 66.13 1.661 3±0.475 2 1.422 1±0.377 2 0.244 0±0.202 9 0.361 1±0.287 6
11 72 58.06 1.580 6±0.495 5 1.340 2±0.392 8 0.194 8±0.205 3 0.291 5±0.288 8
12 56 45.16 1.451 6±0.499 7 1.284 7±0.373 5 0.164 0±0.201 6 0.243 5±0.289 3
13 78 62.90 1.629 0±0.485 0 1.413 7±0.396 2 0.234 8±0.209 8 0.345 9±0.295 8
14 63 50.81 1.508 1±0.502 0 1.314 2±0.384 2 0.179 9±0.205 8 0.267 2±0.292 6
平均 66 53.92 1.539 2±0.492 4 1.347 9±0.387 6 0.198 0±0.206 4 0.292 4±0.292 8
物种水平 102 82.26 1.822 6±0.142 1 1.452 4±0.310 1 0.280 0±0.150 8 0.435 3±0.192 5

群 13 和 14 聚为 1 类；其余居群则出现交叉聚类的
关系，具体表现为：①位于贵州西部的居群 3、4、
5 与东部的居群 2 聚为 1 类；②贵州中部的居群 8、
9、11，西部的居群 1、10 和东部的居群 6 聚为 1
类，再与西部的居群 7 聚为 1 大类。见图 3。
4 讨论
川续断为多年生草本植物，分布较广。其雄蕊
伸出花冠外，花药丁字着生，体现出异花和风媒授
粉特征。Hamrick 等[9]认为，寿命长、地理分布广、
异交为主、风媒传粉、结实率高的物种大多有较高
的遗传多样性。依据 Nybom[10]的研究，多年生、广
布种在植物种群水平 H 和 I 的平均值分别为 0.25 和
0.22，若为双子叶植物，其居群水平的 H 的平均值
为 0.19[11]。本研究中川续断在物种水平上 PPL 为
82.26%，H 为 0.198 0、I 为 0.292 4，这与 Hamrick、
Nybom 的研究结论相一致。由于实验的样本主要为
贵州境内分布的居群，没有包括其他自然分布区，
故川续断实际的遗传多样性指标应还要略高于本文
数值。庞广昌等[12]认为，物种居群间的遗传多样性
水平越高，表明该物种适应的环境就越广。川续断
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图 3 川续断居群的 UPGMA 聚类图
Fig. 3 Dendrogram of D. asper populations
by UPGMA cluster analysis
来自中高海拔、喀斯特复杂地形、偏寒小生境中的
5 个居群（1、4、5、10、13）具有较高的遗传多样
性，其 PPL、H 和 I 值也高于地处低海拔、开阔河
滩生境居群 6 的近 2 倍，这种环境差异导致的遗传
多样性结果，体现了川续断对不同环境适应的一个
广泛程度。如果对遗传多样性水平高的居群的每个
基因位点进行 χ2 检验，并结合居群的环境差异，可
推断出基因和环境适应性的关系，这对选择育种有
一定的指导意义[12]。笔者建议将上述这 5 个续断居
群作为优良种质资源进行保存和关注。
川续断居群间的平均基因流 Nm为 1.206 4，提
示居群间基因的交流比较顺利，能够防止由遗传漂
变引起的遗传分化，有利于种群的稳定。但由于本
实验样本仅限贵州境内，故其 Nm 低于 Hamrick 总
结的广布种植物的 Nm（1.881）[13]。在植物中，基
因流会受花粉、种子的扩散和传播影响，也受分布
区地理隔离的影响。从川续断居群遗传聚类分组来
看， 居群 13 与 14 同处在四川西南部，彼此较近的
地理距离与其遗传距离相一致；居群 12 独立为一
支，推测是贵州的高原喀斯特地貌使生境片段化，
所形成的小生境可能对该居群川续断的基因交流产
生一定的隔离影响。综合而言，推测分布区的海拔
和气候对川续断居群遗传多样性水平有较大影响，
而地理隔离（小生境）是造成居群内遗传变异增加
的另一因素。
此外，分析显示，川续断的遗传变异主要存在
于居群内，说明居群内需要足够的个体差异方有利
于种群（居群）的稳定，但这种变异水平一般不稳
定，是其不断适应生存环境产生的结果。这与本课
题组另一项针对上述居群的川续断药材次生代谢物
积累水平分析的结果吻合，即居群内个体间的化学
成分差异显著，居群间化学成分与海拔有相关性。
提示在制定川续断遗传资源的保育策略和良种选育
时应重点关注那些变异较大的居群。
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