全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 7 期 2012 年 7 月

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DNA 条形码序列对 9 种蒿属药用植物的鉴定
刘美子 1, 2，宋经元 1，罗 焜 1，林余霖 1，刘 萍 2*，姚 辉 1*
1. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193
2. 天津中医药大学，天津 300193
摘 要：目的 采用DNA条形码序列对9种常见的蒿属药用植物进行鉴定，为常见蒿属药用植物的鉴定提供分子依据。方法 对
9 种常见蒿属药用植物的 4 条候选 DNA 条形码序列（ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH）进行 PCR 扩增和测序，比较各序列
的扩增和测序效率，应用 BLAST1、Distance 方法来评估各序列的鉴定效率。此外，基于 MEGA5 分析 9 种常见蒿属药用植
物 ITS2 序列种间 K2P 遗传距离并构建 NJ 树。结果 除 matK 外，其余 3 条片段的 PCR 扩增和测序效率均为 100%，ITS2
序列对9种蒿属药用植物的物种水平鉴定成功率最高，为100%，而psbA-trnH、rbcL、matK、matK＋rbcL的鉴定成功率（BLAST1
法）分别为 83.3%、66.7%、54.5%、75%。通过 ITS2 序列的种间 K2P 遗传距离及 NJ 树均能将不同物种全部区分。结论 ITS2
序列可以作为鉴定蒿属药用植物的潜在条形码。
关键词：蒿属；DNA 条形码；ITS2；PCR 扩增；遗传距离
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)07 - 1393 - 05
Identification of nine common medicinal plants from Artemisia L. by DNA
barcoding sequences
LIU Mei-zi1, 2, SONG Jing-yuan1, LUO Kun1, LIN Yu-lin1, LIU Ping2, YAO Hui1
1. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development,
Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To test DNA barcoding sequences in identification of nine common medicinal plants from Artemisia L. and
provide molecular basis for the identification of plants in Artemisia L. Methods The nine species of Artemisia L. were amplified and
sequenced using four candidate sequences (ITS2, rbcL, matK, and psbA-trnH). The PCR amplification and sequencing efficiencies
were compared and the identification efficiency was assessed using BLAST1 and Distance methods. The genetic distances of ITS2
region in the nine medicinal plants were analyzed and NJ tree was constructed by MEGA5. Results Except matK, the amplification
and sequencing efficiencies of the other three sequences were all 100%. The highest identification success rate (BLAST1) of ITS2
at the species level of the nine medicinal plants was 100%, while 83.3%, 66.7%, 54.5%, and 75% for psbA-trnH, rbcL, matK, and
matK + rbcL, respectively. The nine species in Artemisia L. could be distinguished by ITS2 region using inter-specific K2P genetic distance
and NJ tree. Conclusion ITS2 could be used as a potential DNA barcode to correctly identify the medicinal plants in Artemisia L.
Key words: Artemisia L.; DNA barcoding; ITS2; PCR amplification; genetic distance

蒿属Artemisia L.是菊科春黄菊族菊亚族的 1个
属，该属植物多分布在北半球，且多集中在亚欧大
陆[1]，种类繁多，分化复杂，全世界有 344 种，我
国有 187 种 46 变种，许多种类具有药用、食用及防
风固沙等用途[2]，并为《中国药典》2010 版收载。
依据功效及使用情况常将该属药用植物分为 5 类[3]：
青蒿类，如黄花蒿 Artemisia annua L. 因含有青蒿素
而成为疗效迅速的国际抗疟中药[3-6]；茵陈蒿类，如

收稿日期：2012-03-10
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20091106120011）
作者简介：刘美子（1986—），女，在读硕士研究生，研究方向为中药分子鉴定。E-mail: zimeiliu99@163.com
*通讯作者 姚 辉 Tel: (010)57833194 E-mail: scauyaoh@sina.com
刘 萍 Tel: (010)66936427 E-mail: liuping0707@yahoo.com.cn
网络出版时间：2012-05-16 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120516.1411.002.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 7 期 2012 年 7 月

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茵陈蒿 A. capillaries Thunb. 全草入药，具有清热利
湿、利胆退黄的功效；白莲蒿 A. sacrorum Ledeb. 为
地方习用品；艾蒿类，如艾蒿 A. angyi Lévl. et Vant.
又称为灸草，针灸疗法中的灸就是将艾叶加工成“艾
绒”，点燃后熏灼穴位，艾叶不仅是止血要药，具有
抗菌、抗病毒、增强免疫功能等作用，而且在食品行
业有广泛的用途。另有野艾蒿 A. lavandulaefolia DC.、
歧茎蒿 A. igniaria Maxim.也作为艾叶的资源植物；
刘寄奴类：如白苞蒿 A. lactiflora Wall. ex DC.等；
还有牡蒿类等种类。蒿属的药用植物由于外部形态
非常相似，不易识别，经常在药材市场及临床应用
中发生混淆使用的情况，如某些地方用茵陈蒿代替
黄花蒿使用[7]，直接影响到临床用药的安全有效，
另有大籽蒿A. sieversiana Ehrhart ex Willd.全国范围
内均有分布，易被混淆。因此，找到快速准确的方
法鉴定蒿属药用植物是非常必要的。有关蒿属植物
鉴定的方法有扫描电镜等形态学鉴定方法[1]，随着
分子生物学的发展，已有用叶绿体 psbA-trnH 片段
特异性 DNA 信息位点区分黄花蒿和同属植物茵陈
蒿及青蒿[8]，还有用叶绿体 trnL-trnF 片段分析蒿属
植物系统发育，但效果不理想[9]。
DNA 条形码（DNA barcoding）是用一段短的
标准的序列对物种进行鉴定的新方法[10-13]，具有快
速、准确、可重复性的特点，为形态相近的物种的
鉴定开拓了新的思路。2003 年加拿大动物学家
Hebert 等[11]发现线粒体中的 CO1 序列成功用于对
动物物种的鉴定。而在植物中，研究学者提出各
种候选序列或序列的不同组合作为植物候选条
形码[14-17]。国际条形码协会植物工作组提出 matK＋
rbcL 作为植物的核心条形码[18]，随后在第三届国际
条形码大会上，进化速率较快的 psbA-trnH 和
ITS/ITS2 序列被提出来进一步进行考察。Gao 等[19]
基于实验样本和 GenBank 数据分析，提出 ITS2 可
作为菊科鉴定的 DNA 条形码序列，ITS2 对蒿属 74
个 物 种 的 91 份 样 品 的 鉴 定 效 率 为 59.3%
（BLAST1），其中包含 4 种蒿属药用植物的 ITS2 序
列，另有部分为国外种及不常见种。本研究选取 9
种常见蒿属药用植物，其中 5 种在 Gao 等[19]研究中
未包括，对其 4 条 DNA 条形码 psbA-trnH、ITS2、
matK、rbcL 序列的 PCR 扩增效率、测序效率和鉴
定效率进行考察比较，为 9 种常见蒿属药用植物提
供快速有效的鉴定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
9 种共 12 份蒿属药用植物新鲜叶片采自北京、
广西、重庆、吉林等地，样品硅胶干燥保存，经中
国医学科学院药用植物研究所林余霖副研究员鉴
定，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究
所，具体凭证号及 GenBank 登录号详见表 1。
1.2 方法
取硅胶干燥的叶子 0.03 g，研磨 2 min，采用植
物 DNA 提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，中国）
提取 DNA。ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL 序列的
PCR 扩增、产物纯化及测序方法均参考 Chen 等[15]
和 Gao 等[19]的研究，将每条序列的双向测序峰图用
CodonCode Aligner V3.7.1 校对拼接，去除引物区及
表 1 样品信息
Table 1 Sample information
GenBank 登陆号 编 号 种 名 采集地 凭证号
psbA-trnH ITS2 matK rbcL
1 黄花蒿 A. annua 北京东灵山 PS0633MT04 GQ435090 GQ434492 JQ173387 JQ173392
2 黄花蒿 A. annua 广西南宁 PS0633MT05 JQ173374 GQ434493 HM989753 JQ173393
3 黄花蒿 A. annua 重庆 PS0633MT08 GQ435091 GQ434494 HM989754 JQ173394
4 艾 蒿 A. argyi 广西南宁 PS0590MT04 GQ435067 GQ434469 HM989726 GQ436428
5 茵陈蒿 A. capillaris 北京东灵山 PS0712MT01 JQ173375 JQ173381 JQ173388 JQ173395
6 细裂叶莲蒿 A. gmelinii 北京东灵山 PS0594MT01 GQ435070 GQ434472 GQ434109 GQ436432
7 歧茎蒿 A. igniaria 北京东灵山 PS0675MT01 JQ173376 JQ173382 JQ173389 JQ173396
8 白花蒿 A. lactiflora 广西南宁 PS0592MT01 JQ173377 JQ173383 HM989727 GU724217
9 白花蒿 A. lactiflora 广西南宁 PS0592MT02 JQ173378 JQ173384 HM989728 GU724218
10 野艾蒿 A. lavandulaefolia 北京东灵山 PS0703MT01 GQ435131 GQ434533 － GQ436484
11 白莲蒿 A. sacrorum 吉林通化 PS2605MT01 JQ173379 JQ173385 JQ173390 JQ173397
12 大籽蒿 A. sieversiana 北京东灵山 PS0616MT01 JQ173380 JQ173386 JQ173391 JQ173398
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低质量区。ITS2 序列用 HMMer 注释法切除 5.8 S
和 26 S 端，保留 ITS2 的全长。用 CLUSTAL W1.83
进行序列对比，用 MEGA5 计算 K2P 遗传距离，应
用 BLAST1、Distance 和构建 NJ 树方法对 9 种蒿属
药用植物进行鉴定分析。
2 结果
2.1 序列分析
4 条片段的 PCR 扩增效率和测序效率均较高，
除 matK 的扩增效率为 91.7%，其他片段的扩增和测
序效率均为 100%。片段长度方面，ITS2 的长度最短，
为 222～225 bp，其次是 psbA-trnH，为 456～465 bp，
rbcL 和 matK 较长，分别为 703 bp 和 834～843 bp。
各片段的 GC 量以 psbA-trnH 最低，为 27.2%，ITS2
最高，为 55.6%。ITS2 有 30 个变异位点，psbA-trnH
和 rbcL 分别有 20 和 19 个变异位点，而 matK 的变
异位点最少，只有 5 个，CBOL 推荐的 matK＋rbcL
组合的变异位点有24个，psbA-trnH和matK均有9 bp
的插入/缺失，各片段统计结果见表 2。
表 2 各候选条形码的序列特征
Table 2 Sequences characteristics of candidate DNA barcoding
鉴定成功率 / % 基因片段 GC 量 / % PCR 扩增
效率 / %
测序成功
率 / %
变异位点
数 / 个
插入或缺
失 / bp Distance BLAST1
psbA-trnH 27.2 100 100 20 9 75 83.3
ITS2 55.6 100 100 30 2 100 100
matK 35.5 91.7 100 5 9 45.5 54.5
rbcL 41.4 100 100 19 0 66.7 66.7
matK＋rbcL 24 9 75 75

2.2 鉴定效率分析
采用 Distance 和 BLAST1 的方法分析不同 DNA
条形码序列对 9 种常见蒿属药用植物的鉴定效果，
结果见表 2，应用两种方法 ITS2 的鉴定成功率均最
高，为 100%，其次是 psbA-trnH，鉴定成功率为 75%
（Distance）和 83.3%（BLAST1），而 rbcL 和 matK
的鉴定效率较低，分别为 66.7%和 54.5%（BLAST1），
CBOL 推荐的 matK＋rbcL 的鉴定效率为 75%。
2.3 9 种常见蒿属药用植物的 ITS2 序列分析
2.3.1 K2P 遗传距离 黄花蒿和白花蒿不同产地样
本种内 K2P 遗传距离均为 0。9 种常见蒿属药用植
物 ITS2 序列的种间 K2P 遗传距离最小的是细裂叶
莲蒿和白莲蒿，为 0.004；种间 K2P 遗传距离最大
的是艾蒿和茵陈蒿，及茵陈蒿和野艾蒿之间，为
0.096；9 种蒿属药用植物种间平均 K2P 遗传距离为
0.041。黄花蒿与其他蒿属药用植物的 K2P 遗传距
离为 0.018～0.085，艾蒿为 0.014～0.096，而茵陈蒿
与其他种的 K2P 遗传距离较大，为 0.075～0.096。
9种蒿属药用植物两两物种间K2P遗传距离见表 3。
2.3.2 Neighbor-Joining（NJ）树 基于 ITS2 序列
构建 9 种常见蒿属药用植物 NJ 树，结果如图 1 所
示，不同来源的黄花蒿聚为一支，艾蒿与歧茎蒿聚
为一支，亲缘关系较近，2 个白花蒿样品先聚为一
支，后又与大籽蒿聚为一支。茵陈蒿独立为一支，
与其他蒿属药用植物亲缘关系较远。从 NJ 树图可
以看出，9 种常见蒿属药用植物均可以互相区分。
表 3 ITS2 序列的种间 K2P 遗传距离
Table 3 K2P genetic distance of inter-specific ITS2 sequence
样 本 黄花蒿 艾 蒿 茵陈蒿 细裂叶莲蒿 歧茎蒿 白花蒿 野艾蒿 白莲蒿
艾蒿 0.046
茵陈蒿 0.085 0.096
细裂叶莲蒿 0.018 0.056 0.091
歧茎蒿 0.051 0.014 0.081 0.061
白花蒿 0.023 0.023 0.075 0.032 0.027
野艾蒿 0.041 0.027 0.096 0.051 0.032 0.018
白莲蒿 0.023 0.051 0.085 0.004 0.056 0.027 0.046
大籽蒿 0.036 0.037 0.085 0.046 0.041 0.013 0.032 0.041
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图 1 基于 ITS2 序列构建的 NJ 树
Fig. 1 NJ tree based on ITS2 sequence
3 讨论
蒿属是菊科的一个大属，其种类繁多，有很多
具有药用价值，尤其是从黄花蒿中提取出具有抗虐
活性的青蒿素后，其需求量剧增，由于同属植物外
部形态极其相近，在药材市场上经常混用，威胁到
了临床用药的安全。DNA 条形码依靠 DNA 片段上
承载的序列信息的不同可以对物种进行快速、准确
的鉴定，在本研究中 CBOL 推荐的 rbcL 序列较保
守，matK 序列种内种间的重叠较大，两者均不适用
于 9 种常见蒿属药用植物的鉴定，matK＋rbcL 的鉴
定效率也仅为 75%。psbA-trnH 是进化速率较快的
基因间隔区之一，两端具有较为保守的 psbA 和
trnH，该序列的显著特点是存在较多的插入/缺失，
刘涛等[8]用 psbA-trnH 序列上的信息位点成功鉴定
黄花蒿、茵陈蒿和青蒿。在本研究中黄花蒿有 9 个
碱基（TTCATAAAT）的缺失，其他蒿属植物均无。
9 种常见蒿属药用植物 psbA-trnH 的种间变异小于
ITS2 序列，鉴定成功率也小于 ITS2。ITS2 是位于
nrITS 序列上 5.8 S～26 S 核糖体 DNA 的内转录间
隔区，具备了 5.8 S 和 26 S 两端的保守区设计通用
引物，该序列最早被应用于系统发育和物种的分类
研究中[20-22]，包含丰富的变异位点和信息位点，可
以用于对物种进行鉴定。Gao 等[19]对菊科 2 315 个
种 3 490 个样品分析后提出 ITS2 可用于菊科鉴定的
条形码，但对蒿属 74 个物种 91 份样本的鉴定效率
仅为 59.3%，本研究中 ITS2 在 9 种常见蒿属药用植
物的PCR扩增和测序效率均为 100%，基于BLAST1
和 Distance 方法的鉴定效率均为 100%，通过分析 9
种常见蒿属药用植物 ITS2 种间 K2P 遗传距离和 NJ
树可以看出，ITS2 序列均可准确鉴定黄花蒿等 9 种
常见蒿属药用植物。
药用植物 DNA 条形码鉴定研究为中药的真伪鉴
定指出了新的发展方向，是中药鉴定方法的创新[23]，
陈士林等[24]提出以 ITS2为主体的药用植物DNA条
形码鉴定体系，在本研究中，ITS2 能很好地鉴定 9
种常见蒿属药用植物，由于样品量有限，几种蒿属
药用植物 ITS2 序列种内变异尚需进一步研究。
参考文献
[1] 祝东立, 贺学礼, 石 硕. 河北小五台山 18 种蒿属植
物果皮微形态学研究 [J]. 河北农业大学学报, 2007,
30(6): 57-62.
[2] 林有润. 中国植物志（第 76 卷, 第 2 分册）[M]. 北京:
科学出版社, 1991.
[3] 刘硕谦, 田 娜, 李 娟. 青蒿素组合生物合成的研究
进展 [J]. 中草药, 2007, 38(9): 1425-1431.
[4] 杨瑞仪, 卢元媛, 杨雪芹, 等. 低温诱导黄花蒿中青蒿
素的生物合成及其机制研究 [J]. 中草药, 2012, 43(2):
350-354.
[5] 张祖荣, 廖志华, 彭梅芳. 黄花蒿 HDS 基因的克隆与
功能分析 [J]. 中草药, 2012, 43(1): 148-154.
[6] Korenromp E L, Williams B G, Gouws E, et al.
Measurement of trends in childhood malaria mortality in
Africa: an assessment of progress to toward targets based
on verbal autopsy [J]. Lancet Infect Dis, 2003, 3:
349-358.
[7] 孙会忠, 宋月芹, 赵春玲, 等. 蒿属两种药用植物的形
态学鉴别 [J]. 时珍国医国药, 2008, 19(11): 2733-2734.
[8] 刘 涛, 纪运恒. 蒿属药用植物叶绿体上的 psbA-trnH
序列分析 [J]. 中国农学通报, 2009, 25(12): 46-49.
[9] 王铁娟, 韩国栋, 柴兆芳. 蒿属叶绿体 DNA trnL-trnF
的序列分析与系统发育的意义 [J]. 内蒙古大学学报,
2007, 6: 665-671.
[10] Hebert P D, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological
identification through DNA barcodes [J]. Proc Biol Sci,
2003, 270: 313-321.
[11] Hebert P D, Penton E H, Burns J M, et al. Ten species in
one: DNA barcoding reveals cryptic species in the
Neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator [J].
Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 14812-14817.
[12] 陈士林, 苏钢强, 邹健强, 等. 中国中药资源可持续发
展体系构建 [J]. 中国中药杂志, 2005, 15(3): 1141-1146.
[13] Kress W J, Wurdack K J, Zimmer E A, et al. Use of DNA
barcodes to identify flowering plants [J]. Proc Natl Acad
Sci USA, 2005, 102: 8369-8374.
[14] Han J P, Liu C, Li M H, et al. Relationship between DNA
barcoding and chemical classification of salvia medicinal
4
7
10
12
8
9
6
11
1
2
3
5
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 7 期 2012 年 7 月

• 1397 •
herbs [J]. Chin Herb Med, 2010, 2(1): 16-29.
[15] Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2
region as a novel DNA barcode for identifying medicinal
plant species [J]. PLoS One, 2010, 5: e8613.
[16] Chinese Plant BOL Group. Comparative analysis of a
large dataset indicates that internal transcribed spacer
(ITS) should be incorporated into the core barcode for
seed plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108:
19641-19646.
[17] Li D Z, Liu J Q, Chen Z D, et al. Plant DNA barcoding in
China [J]. J Syst Evol, 2011, 49(3), 165-168.
[18] CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land
plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:
12794-12797.
[19] Gao T, Yao H, Song J Y, et al. Evaluating the feasibility of
using candidate DNA barcodes in discriminating species
of the large Asteraceae family [J]. BMC Evol Biol, 2010,
10: 324.
[20] Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S—28S rRNA
interaction and HMM-based ITS2 annotation [J]. Gene,
2009, 430: 50-57.
[21] Müller T, Philippi N, Dandekar T, et al. Distinguishing
species [J]. RNA, 2007, 13: 1469-1472.
[22] Miao M, Warren A, Song W, et al. Analysis of the internal
transcribed spacer 2 (ITS2) region of scuticociliates and
related taxa (Ciliophora: Oligohymenophorea) to infer
their evolution and phylogeny [J]. Protist, 2008, 159:
519-533.
[23] 陈士林, 姚 辉, 宋经元, 等. 基于 DNA barcoding (条
形码) 技术的中药材鉴定 [J]. 世界科学技术—中医药
现代化, 2007, 9(3): 7-12.
[24] 陈士林, 庞晓慧, 姚 辉, 等. 中药 DNA 条形码鉴定
体系及研究方向 [J]. 世界科学技术—中医药现代化,
2011, 13(6): 747-754.