全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 330 •
天麻素对终末糖基化产物诱导神经小胶质细胞炎症因子表达的影响
张媛元 1，毛瑞阳 2，杜晓红 2，刘 毅 3*
1. 温州市平阳县第二人民医院 肾内科，浙江 温州 325405
2. 温州医学院第一附属医院 干部科，浙江 温州 325000
3. 温州医学院第一附属医院 肾内科，浙江 温州 325000
摘 要：目的 观察终末糖基化产物（AGEs）对小鼠神经小胶质细胞 BV-2 炎症因子白细胞介素（IL-1β、IL-6）表达的影
响及天麻素的干预效应。方法 将体外培养的小鼠小胶质细胞分成对照组、AGEs 组、天麻素（12.5、25、50、100 mg/L）
组，培养 18 h，观察细胞形态变化，酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清中 IL-1β、Il-6 水平，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
方法测定 IL-1β、IL-6 mRNA 表达。结果 倒置显微镜下观察，对照组小胶质细胞多为静止期，突起较少，AGEs 组多数细
胞突起较多，呈阿米巴样，以 AGEs 质量浓度为 300 mg/L 时最明显，天麻素干预组细胞突起较 AGEs 组有所减少，其中以
天麻素 50 mg/L 组最少。与对照组相比，AGEs 组细胞培养上清液中 IL-1β、IL-6 水平，以及细胞内 IL-1β、IL-6 mRNA 表达
明显增加，具有显著差异（P＜0.05）；与 AGEs 组相比，天麻素组细胞培养上清液中 IL-1β、IL-6 水平，以及细胞 IL-1β、IL-6
mRNA 表达均有所降低，其中天麻素 25、50、100 mg/L 组差异显著（P＜0.05），以天麻素 50 mg/L 组降低最显著（P＜0.01）。
结论 AGEs 能够诱发神经小胶质细胞产生 IL-1β、IL-6，天麻素能部分抑制 AGEs 对小胶质细胞的诱导作用。
关键词：天麻素；终末糖基化产物；神经小胶质细胞；白细胞介素 1β；白细胞介素 6
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)02 - 0330 - 05
Effects of gastrodine on expression of inflammatory cytokines in nerve microglia
cell induced by advanced glycation end products
ZHANG Yuan-yuan1, MAO Rui-yang2, DU Xiao-hong2, LIU Yi3
1. Department of Nephrology, Second People’s Hospital of Pingyang County, Wenzhou 325405, China
2. Department of Cadres, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China
3. Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China
Abstract: Objective To investigate the effects of gastrodine (GAS) on the expression of IL-1β and IL-6 in nerve microglia BV-2 cell
of mice induced by different concentrations of advanced glycation end products (AGEs) and GAS intervention. Methods The
cultured BV-2 cells of mice were divided into AGEs group, GAS (12.5, 25, 50, and 100 mg/L) groups, which were cultured for 18 h to
observe the changes of cell morphology. The levels of IL-1β and IL-6 in the cell culture supernate were determined by enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA) and the expressions of IL-1β and mRNA were analysed by reverse transcriptase polymerase chain
reaction (RT-PCR). Results Observed under an inverted microscope, microglia is mostly quiescent and less protruding in control
group; Most cell processes were more and amoeba-like in AGEs group, which was most obviously at the concentration of 300 mg/L.
Cell processes in GAS groups reduced less than those in AGEs groups, of which the least was in GAS group at concentration of 50
mg/L. Compared with the control group, the levels of IL-1β and IL-6 in supernatants of cell culture in AGEs group and the expressions
of IL-1β and IL-6 mRNA increased with significant difference (P<0.05). Compared with AGEs groups, the levels of IL-1β and IL-6 in
supernatants of cell culture in AGEs group and the expressions of IL-1β and IL-6 mRNA obviously decreased, there were significant
differences in AGE groups at the concentrations of 25, 50, and 100 mg/L (P<0.05), among which the decrease was most significant in
the AGE group of 50 mg/L (P<0.01). Conclusion AGEs could induce that nerve microglia produce IL-1β and IL-6 and GAS could
partly inhibit the induction of AGEs on microglia.
Key words: gastrodin (GAS); advanced glycation end products (AGEs); nerve microglia; IL-1β; IL-6

收稿日期：2010-05-18
基金项目：温州市科技局基金资助课题（Y20070010）
作者简介：张媛元（1974—），女，河北张家口人，硕士，主治医师，主要从事中药治疗尿毒症并发症研究。
Tel: (0577)88844105 E-mail: 63950063@163.com
*通讯作者 刘 毅 Tel: 13868408899 E-mail: liuyi@Hosp1.an.cn
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尿毒症脑病是慢性肾功能不全患者常见的中枢
神经系统并发症，有研究报道慢性肾功能衰竭未透
析患者尿毒症脑病发生率高达 82%[1]，然而其发病
机制目前尚不完全清楚。近年来，有研究发现终末
糖基化产物（ advanced glycation end products，
AGEs）可与神经小胶质细胞表面的特异性受体
（receptor of AGEs，RAGE）结合，引起神经小胶质
细胞产生炎症介质，参与尿毒症脑病的的发生[2]，
是尿毒症脑病发病的影响因素，因此，如何抑制
AGEs 的作用可能是治疗尿毒症脑病的一种值得探
索的方法。天麻素系天麻的主要有效成分，具有抗
炎、抗氧化、稳定细胞膜等作用[3]，临床上具有抗
惊厥，抗焦虑，改善学习记忆等功效。现代研究证
实天麻素也可减轻体外模拟脑缺血损伤[4-5]。在临床
中也常用来治疗尿毒症脑病，但治疗机制尚不清楚。
天麻素能否抑制 AGEs 诱导小胶质细胞的炎症因子
表达目前国内外尚未见报道。为此，本研究通过培
养神经小胶质细胞，观察天麻素对 AGEs 所致小胶
质细胞炎症状态的干预作用，探讨其对尿毒症脑病
的防治作用。
1 材料
BV-2 小胶质细胞购自中国医学科学院协和医
科大学基础医学细胞中心（编号 0063），天麻素购
自中国药品生物制品检定所（批号 110807-200205，
质量分数 99%)，DMEM 高糖培养基购自 Hyclon
公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限
公司，0.25%胰蛋白酶为捷瑞生物公司产品，琼脂
糖为 Genetech 公司产品，牛血清白蛋白（BSA）为
Sigma 公司进口分装，trizol 为 Invitrogen 公司产品，
白细胞介素 1β（IL-1β）、白细胞介素 6（IL-6）ELISA
试剂盒为 RB 生物科技公司进口分装，RT-PCR 试剂
盒购自宝生物工程有限公司，DU800 型紫外分光光
度计为 Beckman 公司产品，其他试剂均为国产分析
纯。AGEs-BSA 及 AGEs 对照物的制备与检测参照
文献方法[6]。
2 方法
2.1 细胞培养
BV-2 细胞使用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖
培养液，在 5%CO2、37 ℃培养箱中培养。将处于
对数生长期的细胞以 2×105/孔的密度移入 6 孔板
中，待细胞长至 80%融合时换无血清 DMEM 高糖
培养基饥饿处理 24 h 后，进行实验处理。每组设 3
个复孔，实验重复 3 次。
2.2 实验分组
随机分为阴性对照组、AGEs（实验中加入
AGEs-BSA）模型对照组（AGEs 300 mg/L）和天麻
素干预组（AGEs 300 mg/L＋天麻素，天麻素的终
质量浓度分别为 12.5、25、50、100 mg/L，AGEs
与天麻素同时加入），5%CO2、37 ℃培养箱中培养
18 h（预试验获得的最佳时间点）。
2.3 细胞形态学观察
取对数生长期 BV-2 细胞以 2×105／孔的密度
接种于 6 孔培养板中，培养 18 h 后，倒置相差显微
镜下观察各组细胞形态学变化。
2.4 BV-2 细胞活力的检测
将对数生长期的细胞消化后，用含 10%胎牛血
清的培养基配成单个细胞悬液，以 2×105/孔的密度
接种至 96 孔板，每孔体积 100 μL，培养 24 h 后换
液，每孔加入含AGEs 300 mg/L的无血清培养基100
μL，干预组加入含 AGEs 300 mg/L 和含天麻素的无
血清培养基 100 μL，天麻素的终质量浓度分别为
12.5、25、50、100 mg/L，每组设 6 个复孔。5%CO2、
37 ℃培养箱中培养 18 h 后，每孔加入 CCK8 试剂
10 μL，37 ℃继续孵育 30 min，450 nm 测定各孔吸
光度（A）值，计算细胞活力。
细胞活力＝（干预组 A 值－阴性对照组 A 值）/（模型
对照组 A 值－阴性对照组 A 值）
2.5 细胞培养上清液中 IL-1β、IL-6 水平的测定
将细胞以 1×105／孔的密度接种于 96 孔培养
板内，每孔 100 μL，每组设 6 个复孔，细胞贴壁生
长至 80%时换无血清培养液培养 24 h，使细胞同步
化后，再换含 AGEs 以及不同质量浓度天麻素的培
养液进行培养，18 h 后吸取上清，12 000 r/min 离心
5 min，提取细胞上清，−80 ℃保存待测。根据 ELISA
试剂盒说明测上清液中蛋白浓度。
2.6 RT-PCR 法检测培养细胞 IL-1β、IL-6 mRNA
的表达
2.6.1 引物合成 根据 GenBank 设计 IL-1β、IL-6
及 β-actin 引物： IL-1β 上游引物 5’-TCAGG
AGGCAGTATCAC-3’ ，下 游 引 物 5’-TTACACA
GGACAGTATAGATT-3’，扩增长度 390 bp，退火温
度 54 ℃，30 个循环； IL-6 上游引物 5’-TTC
ACAAGTCCGGACAGGAG-3’，下游引物 5’-TGG
TCTTGGTCCTTAGCCAC-3’，扩增长度 488 bp，退
火温度 54 ℃，32 个循环；β-actin 上游引物 5’-CCCA
CTCCTAAGAGGAGGATG-3’，下游引物 5’-AGG
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GAGACCAAAGCCTTCAT-3’，扩增长度 214 bp，
退火温度 52 ℃，28 个循环。由上海捷瑞生物工程
公司合成，聚丙酰胺凝胶电泳纯化。
2.6.2 抽提细胞总RNA 用Trizol试剂按照说明书
抽提培养后各组细胞的总 RNA，经紫外分光光度计
测定 RNA 的 A260 与 A280 的比值在 1.8～2.0，1%甲
醛变性凝胶电泳证实总 RNA 的完整性较好（28 S
与 18 S 两条电泳带吸光度比值约为 2︰1）。
2.6.3 RT-PCR 逆转录法合成 cDNA 根据宝生物
公司 RT 试剂盒说明，采用的逆转录体系为 MgSO４
2 μL（25 mmol/L）、2×Bcalst Buffer 5 μL、RNase
Free dH2O 0.75 μL、dNTP mixture（各 10 mmol/L）
0.5 μL、RNase inhibitor（40 U/μL）0.25 μL、BcaBEST
polymerase（22 U/μL）0.5 μL，Random 9 mers 0.5 μL，
实验样品 RNA 0.5 μL，反应总体系为 10 uL。PCR
扩增：以 IL-1β、IL-6 及 β-actin 上下游引物分别扩
增目的基因及内参对照，进行 PCR 反应，扩增反应
体系为 MgSO４ 3 μL（25 mmol/L），5×Bca 2nd
Buffer 8 uL，灭菌蒸馏水 27.75 μL，Bca-Optimized
Taq 0.25 μL，上下游引物分别为 0.5 μL，反应总体
系为 40 μL。扩增条件为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃
变性 30 s，退火 30 s，延伸 1 min，72 ℃末端延伸
10 min。取溴酚蓝加样缓冲液 2 μL，PCR 扩增产物
8 μL，混匀后点样于 2%琼脂糖凝胶（含 EB 0.5
mg/L）加样孔中，120 Ｖ电泳 20 min。
2.6.4 半定量结果分析 将 PCR 反应产物进行琼
脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统成像，对扩增产
物的电泳条带进行灰度扫描，Gelpro3.1 软件分析各
条带吸光度，分别计算 IL-1β、IL-6 基因与 β-actin
的比值，每次实验均重复 3 次。
2.7 统计学方法
使用 SPSS 11.5 统计软件进行分析，数据以
sx ± 表示，两组间比较用独立样本 t 检验，多组间
比较用单因素方差分析，组间比较及多组与对照组
比较用 S-N-K、Dunnett-t 检验。
3 结果
3.1 AGEs-BSA 荧光光谱分析
荧光光谱扫描显示，本实验制备的 AGE-BSA
相对于单纯的 BSA 有较强的 450 nm 发射峰，前者
是后者的 5 倍，单纯的 BSA 也存在一定的 450 nm
发射峰[7]，但较低。本实验制备的 AGE-BSA 符合
AGEs 的激发荧光特性的文献报道[8-9]。
3.2 细胞的形态学变化
倒置显微镜下阴性对照组多为静止期小胶质细
胞，此期细胞生长迅速，胞体较小，呈圆形，少量
细胞有突起；AGEs 组可发现较多细胞聚集成团，
有的胞体变得肥大，胞核大而圆，核仁明显；有的
胞体变为梭形，由胞体伸出 1 个或多个较长的枝状
突起，细胞立体感、折光度减弱，胞浆内颗粒物增
多；天麻素组的这种表现有所好转，细胞突触减少，
立体感，折光度增强，以质量浓度为 50 mg/L 组最
明显，见图 1。
3.3 对 BV-2 细胞活力的影响
AGEs 及天麻素作用于小胶质细胞并不能影响
小胶质细胞的数量，各组 A 值无显著性差异（P＞
0.05），见表 1。


对照 AGEs 300 mg·L−1 天麻素 50 mg·L−1
图 1 BV-2 细胞的形态学变化
Fig. 1 Morphological changes of BV-2 cells
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表 1 天麻素对小胶质细胞 BV-2 活力及 IL-1β和 IL-6 的影响 ( 6=± n s,x )
Table 1 Effect of GAS on vitality of BV-2 cells and expressions of IL-1β and IL-6 mRNA ( 6=± n s,x )
组别 ρ/(mg·L−1) A IL-1β/(ng·L−1) IL-6/(ng·L−1) IL-1β mRNA IL-6 mRNA
对照 – 0.70±0.16 27.73±9.97 22.13± 6.72 0.557±0.125 0.485±0.112
AGEs 300 0.64±0.15 94.92±9.41** 183.19±41.16** 0.948±0.160** 0.970±0.146**
GAS 12.5 0.59±0.23 86.55±6.84** 179.77±26.89** 0.840±0.086** 0.828±0.097**
25 0.76±0.13 65.47±8.13**# 103.43±25.67**# 0.718±0.152*# 0.773±0.099*#
50 0.72±0.18 44.52±5.36*## 55.54±21.69*## 0.583±0.110## 0.558±0.096##
100 0.61±0.24 54.47±9.13*## 76.05±25.36*## 0.628±0.080# 0.610±0.085#
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与 AGEs 组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs control group; #P<0.05 ##P<0.01 vs AGEs group
3.4 培养上清液中 IL-1β和 IL-6 水平
与对照组相比，AGEs 组培养上清液 IL-1β、IL-6
水平明显升高，差异显著（P＜0.05）；与 AGEs 组
相比，天麻素各组培养上清中 IL-1β、IL-6 水平均
明显降低，差异非常显著（P＜0.01），其中以天麻
素 50 mg/L 组最低，与天麻素 12.5、25、100 mg/L
组相比，差异显著（P＜0.05），见表 1。
3.5 IL-1β、IL-6 mRNA 的表达
RT-PCR 结果提示，AGEs 组细胞 IL-1β、IL-6
mRNA 表达量明显高于对照组（P＜0.01），天麻素
组细胞 IL-1β、IL-6 mRNA 表达有所减少，与 AGEs
组相比，均差异显著（P＜0.01），其中以天麻素 50
mg/L 组表达量最少，与天麻素 12.5、25、100 mg/L
组相比，差异显著（P＜0.05），见表 1 和图 2。

IL-1β
IL-6
100 50 25 12.5 300 对照 Marker β-actin
天麻素/(mg·L−1) AGEs/(mg·L−1)
图 2 天麻素对 AGEs 诱导 BV-2 细胞 IL-1β和 IL-6 mRNA 表达的影响
Fig. 2 Effect of GAS on expressions of IL-1β and IL-6 mRNA in BV-2 cells induced by AGEs
4 讨论
慢性肾衰病人，由于 AGEs 清除率下降，以及
尿毒症本身氧化应激增强，AGEs 生成增加，致使
循环和组织中 AGEs 水平明显增高[10]。有研究发现
在慢性肾功能不全状态下，中枢神经系统有 AGEs
物质沉积，可能是引起尿毒症脑病的原因之一[11-12]，
但 AGEs 通过哪种途径影响中枢神经系统功能目前
尚不清楚。
近年来的研究显示神经小胶质细胞在维持中枢
神经系统正常功能中起着重要作用，神经小胶质细
胞广泛分布于中枢神经系统，在中枢神经系统中起
着支持、营养、保护和修复的作用。小胶质细胞还
参与神经损伤后的免疫反应。一般情况下，激活的
小胶质细胞可以中止或者降低受累组织或细胞的生
化代谢紊乱，但持续激活后小胶质细胞往往具有细
胞毒性效应，也可对周围残存组织或正常组织造成
继发损害，影响正常神经功能。Mohamed 等[13]发现
椎体神经元和神经胶质细胞中也存在 AGEs 受体，
AGEs 修饰的蛋白质与 AGE 受体结合，吸引胶质细
胞，当大量神经小胶质细胞聚集并激活，分泌包括
TNF-α、IL-1β、IL-6 和氮氧化物在内的一系列炎症
细胞因子和细胞毒性物质，可损伤神经元。因此，
推测尿毒症脑病发生与 AGEs 激活神经小胶质细胞
产生炎症介质有关。
本研究发现 AGEs 可诱导神经小胶质细胞产生
IL-1β、IL-6。神经小胶质细胞产生的 IL-1β、IL-6
与 AGEs 呈剂量依赖性关系，这与以往一些研究一
致[14]。AGEs 作用于细胞上 AGEs 受体，介导细胞
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产生氧化应激反应，并进一步促进炎症细胞产生炎
症介质[15]，活性氧自由基具有自身正反馈效应，一
旦激活，就有逐渐放大的趋势。在尿毒症状态下，
机体细胞氧化和抗氧化系统失衡，过度激活小胶质
细胞产生过量的前炎症细胞因子、自由基和 NO，
引起神经细胞损伤，影响神经功能。因此，研究如
何阻断小胶质细胞激活，改善神经细胞炎症状态具
有重要意义。为此，本实验选用 BV-2 细胞系进行
培养，研究天麻素对 AGEs 诱导产生 IL-1β、IL-6
的影响，探讨尿毒症脑病发病机制，寻找防治尿毒
症脑病新靶点。
本实验发现一定质量浓度的天麻素能够抑制
AGEs 刺激下神经小胶质细胞 IL-1β、IL-6 的表达，
其中 50 mg/L 时这种作用最明显。其机制可能是天
麻素能够通过抑制氧自由基产生，减少脂质过氧
化物（LPO）的产生，清除自由基，抑制小胶质细
胞的活化，减少 IL-1β、IL-6 等炎症因子表达，从
而减轻神经系统微炎症状态，对神经细胞起到保护
作用。
总之，本研究发现 AGEs 可以诱发神经小胶质
细胞 IL-1β、IL-6 的表达，而天麻素可部分抑制这
种作用，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。
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