全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 11 期 2012 年 11 月

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抗肿瘤活性茯苓多糖的提取、纯化与结构分析
黄 灿，王玉明，赵 骏*
天津中医药大学中药学院，天津 300193
摘 要：目的 对具有抗肿瘤活性的茯苓多糖进行提取、纯化以及结构分析。方法 采用水提醇沉法提取茯苓多糖，三氯乙
酸法除蛋白，凝胶色谱柱纯化得到抗肿瘤活性茯苓多糖 ATPCP，高效液相凝胶色谱法测其相对分子质量，样品水解后经过
TLC 及 GC-MS 分析确定单糖组成，通过 FT-IR、13C-NMR 和 1H-NMR 对其进行结构分析。结果 GPC 结果显示抗肿瘤活性
茯苓多糖的重均相对分子质量为 16 850，多分散性为 1.34，TLC 及 GC-MS 结果显示其含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露
糖，各单糖的物质的量比为 1∶2.36∶5.49∶2.34。FT-IR 和 NMR 结果显示 ATPCP 含有 α-型和 β-型吡喃糖，其主链为 1, 6-
糖苷键，并存在 1, 4-糖苷键支链。结论 茯苓中具有抗肿瘤活性的茯苓多糖是由 4 种确定的单糖组成并伴有支链的杂多糖。
关键词：茯苓多糖；抗肿瘤；组分分析；核磁共振；红外光谱分析
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)11 - 2146 - 04
Preparation, purification, and analysis of chemical composition of anti-tumor
polysaccharide from Poria cocos
HUANG Can, WANG Yu-ming, ZHAO Jun
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Key words: polysaccharides of Poria cocos (Fr.) Wolf.; anti-tumor; component analysis; NMR; FT-IR

自从发现茯苓 Poria cocos (Fr.) Wolf. 多糖的抗
肿瘤活性以来，对其活性研究一直是多糖抗肿瘤活
性研究的热点之一。研究发现多糖的形态结构，相
对分子质量以及化学成分组成均会影响多糖的抗肿
瘤活性[1]。Ke 等[2]以热水为溶剂提取出茯苓多糖，
分析由核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和
半乳糖组成，通过小鼠体内抗肿瘤实验证明其能够
明显抑制肿瘤细胞的生长，并能增加小鼠体内的
SOD、CAT 和 GPX 的活性。目前，鲜有文献报道茯
苓多糖相对分子质量对茯苓多糖抗肿瘤活性的影
响。本实验为了探究茯苓多糖相对分子质量、结构
与茯苓多糖抗肿瘤活性之间的关系，分离得到不同
相对分子质量段的茯苓多糖，由体外细胞试验筛选
出具有抗肿瘤活性的茯苓多糖进行结构分析，确定
了活性茯苓多糖的相对分子质量分布，为抗肿瘤活
性研究提供新的依据。
1 材料与仪器
RE—52A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、
GZK—40 电热真空干燥箱（天津市华北实验仪器有
限公司）、UV—2401PC 紫外可见分光仪（日本岛
津）、智能型傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet 公司）、
Brucker—Plus 400 核磁共振波谱仪（瑞士 Brucker 公
司）、GC MS—QP2010SE 气相色谱质谱联用仪（日
本岛津）、Waters 高效液相色谱仪，Shodex SB-804 HQ
（300 mm×8 mm，10 μm）（北京京京时代科技发展
有限公司），右旋糖苷 Dextran（Fluca）依次为（重
均相对分子质量约值）1 000、5 000、12 000、25 000、
50 000、80 00、150 000、410 000、670 000（北京
拜尔迪生物有限公司），葡萄糖、半乳糖、木糖、果
糖、鼠李糖、树胶醛糖（均为分析纯，天津市博迪
化工有限公司），岩藻糖对照品（10082526，天津一
方科技有限公司）。
5 月龄 SPF 级 SD 雄性大鼠（由天津中医药大
学实验动物中心提供），Bel-7402 细胞株（上海润
成生物科技有限公司），茯苓购自安徽省亳州市药
材市场，经天津中医药大学李天祥副教授鉴定为
多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos (Fr.) Wolf. 的干燥
菌核。

收稿日期：2012-02-16
基金项目：天津市重点项目“基于调控固有免疫的茯苓多糖抗肿瘤作用及机理研究”（10JCZDJC21300）
作者简介：黄 灿（1988—），女，硕士研究生，安徽安庆人，药物分析学硕士。Tel: 13821736523 E-mail: 5055386273@qq.com
*通讯作者 赵 骏 E-mail:zhaojun_022@sina.com
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2 抗肿瘤活性茯苓多糖（APPC）的提取
2.1 活性茯苓多糖的确定
取 70 ℃下烘干的茯苓 4 kg ，按料液比 1∶12
加入蒸馏水，回流提取 2 次，每次 3 h，合并 2 次滤
液，浓缩，加入乙醇使其体积分数达到 80%，4 ℃放
置过夜，滤过，沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗
涤，低温烘干，加入适量蒸馏水溶解，除去少量不溶
物，加入 200 mL 的 10%三氯乙酸，搅拌 30 min，4 ℃
静置过夜，滤过除去沉淀。上清液加入乙醇使醇浓度
达到 20%，4 ℃静置过夜，离心，沉淀分别用丙酮、
乙醚、无水乙醇洗涤，低温烘干，即得 A 段茯苓多
糖，重复以上操作但上清液加入乙醇使其体积分数依
次分别为 40%、60%、80%，即得 B、C、D 段茯苓
多糖。
2.2 APPC 的筛选
分离大鼠外周血白细胞，将 A、B、C、D 以
及总多糖作用于白细胞 2 h 后，再将白细胞作用于
肝癌 Bel-7402 细胞，以玫瑰花环样结构的形成作
为指标，证明由 C 段作用的白细胞可提高白细胞
在肝癌 Bel-7420 细胞周围形成玫瑰花环样结构的
比例。由此筛选出 C 段（命名为 APPC）为抗肿
瘤活性多糖[3]。
2.3 均一相对分子质量茯苓活性多糖的确定
APPC 经过葡聚糖凝胶 Sephadex G-75，以蒸馏
水为流动相洗脱得均一相对分子质量茯苓活性多
糖，待结构分析。
3 结构分析
3.1 相对分子质量测定
3.1.1 色谱条件 LC—20AT 恒流泵，CTO—20A
柱温箱，RID—10A 检测器（示差折光检测器），色
谱柱为 Shodex SB-804HQ（300 mm×8 mm，10
μm），柱温 30 ℃，检测池温度 30 ℃，流动相为三
蒸水，体积流量 0.8 mL/min。
3.1.2 利用排阻色谱-示差折光法对所得的活性多
糖进行相对分子质量测定 对照品使用右旋糖苷
Dextran （Fluca）的相对分子质量依次为 1 000、5 000、
12 000、25 000、50 000、80 000、150 000、410 000、
670 000，用三蒸水溶解，经 0.45 μm 滤膜滤过，以
对照品的保留时间为横坐标，相对分子质量的对数
值为纵坐标做 GPC 的标准曲线。根据样品的保留时
间，计算出样品的相对分子质量。
3.2 TLC 分析单糖组成
3.2.1 样品水解液制备[4] 称取 APPC 20 mg，加入 2
mol/L 的硫酸 4 mL 于具塞试管中，105 ℃水解 10 h，
Ba(OH)2中和，离心，取上清液，浓缩至 1 mL，备用。
3.2.2 对照品溶液制备 配置各单糖对照品质量浓
度为 2 mg/mL，备用。
3.2.3 显色剂制备 称取 0.93 g 苯胺和 1.66 g 邻苯
二甲酸溶于 100 mL 水饱和正丁醇中，备用。
3.2.4 展开系统 以展开剂 1（正丁醇-醋酸乙酯-
异丙醇-无水乙醇-水 7∶16∶12∶10∶9），展开剂 2
（正丁醇-醋酸乙酯-异丙醇-乙酸-吡啶-水 7∶20∶
12∶7∶6∶5），采用上行法 2 次展开，展开距离相
同，晾干后均匀喷上显色剂，置 105 ℃烘箱 20 min。
由 Rf 值确定单糖组成。
3.3 GC-MS 分析单糖组成
3.3.1 色谱条件 柱温 100 ℃，进样口温度 280
℃，分流比 30∶1，程序升温：100 ℃保持 3 min，
14 ℃/min 升温至 163 ℃，保持 9 min；20 ℃/min
升温至 210 ℃，保持 3 min；25 ℃/min 升温至 280
℃保持 3 min。
3.3.2 对照品乙酰化处理 精密称取单糖对照品各
2 mg，加入盐酸羟胺吡啶溶液（20 mg/mL）1 mL，
混匀后于 90 ℃水浴 30 min，冷却至室温后加入 1 mL
乙酸酐，混匀，90 ℃水浴 30 min，冷却，15 000 r/min
离心 15 min，取上清液 1 μL 进样。
3.3.3 水解样品乙酰化处理 精密称取水解
ATPCP 10 mg，加入盐酸羟胺吡啶溶液（20 mg/mL）
0.5 mL，混匀后于 90 ℃水浴 30 min，冷却至室温
后加入 0.5 mL 醋酸酐，混匀，90 ℃水浴 30 min，
冷却，15 000 r/min 离心 15 min，取上清液 1 μL 进样。
3.4 红外波谱分析以及核磁共振波谱分析
3.4.1 红外光谱分析 采用 KBr 压片法在 400～
4 000 cm−1 测定。
3.4.2 核磁共振分析 Bruker AV600 型超导核磁共
振谱仪，温度 300 K，溶剂为 D2O，DMSO 定标。
4 结果
4.1 APPC 的相对分子质量分布
图 1 显示 APPC 的 Mp（峰尖相对分子质量）
为 13 917，多分散性为 1.34。切片积分计算出ATPCP
的 Mw（重均相对分子质量）为 16 580，Mn（数均
相对分子质量）为 12 620。
4.2 薄层色谱分析
通过计算各单糖的 Rf 值，与单糖对照品对照，
结果显示抗肿瘤活性 APPC 可能含有甘露糖、葡萄
糖、果糖、岩藻糖、半乳糖。
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4.3 GC-MS 分析单糖组成
由图 2 分析可知 ATPCP 含有岩藻糖、甘露糖、
葡萄糖和半乳糖。根据峰面积可计算各单糖之间的
物质的量之比为 1∶2.36∶5.49∶2.34。
4.4 红外光谱分析
红外图谱显示[1]，3 418 cm−1 处强且宽的吸收峰
是O-H与C-H的伸缩振动，为糖类物质的特征吸收，
并且存在明显的分子间氢键；2 928 cm−1是饱和 C-H

图 1 抗肿瘤茯苓多糖凝胶色谱图
Fig. 1 Molecular weight distribution of APPC

1-岩藻糖 2-甘露糖 3-葡萄糖 4-半乳糖
1-fucose 2-mannose 3-glucose 4-galactose
图 2 单糖对照品 (A) 与 APPC (B) 的 GC-MS 图
Fig. 2 GC-MS chromatograms of monosaccharide
reference substances (A) and APPC (B)
的伸缩振动，1 658 cm−1 处吸收峰是由 O-H 的弯曲
振动引起，1 416 cm−1 和 1 368 cm−1 是次甲基的变形
振动吸收峰，1 247 cm−1 是吡喃糖环 C-O-C 伸缩振
动吸收峰，1 400 cm−1 和 1 200 cm−1 是糖类的 C-H
变角振动，1 141 cm−1 是吡喃糖环的 C-O 吸收峰，
1 080 cm−1和 1 027 cm−1是-OH的变角振动吸收峰，
876 cm−1 为 β型糖苷键的吸收峰，773 cm−1 为吡喃
糖环的 C-O-C 的对称振动峰。561 cm−1 和 517 cm−1
是 C-CO 的变形振动吸收峰。
4.5 核磁共振波谱分析
13C-NMR (100 MHz, D2O) δ: 102.4, 101.5, 98.1,
77.6, 73.5, 71.6, 70.5, 70.2, 69.7, 68.4, 67.3, 66.9,
61.3, 15.8。1H-NMR (400 MHz, D2O) δ: 5.05, 4.99,
4.96, 4.94, 4.70, 4.10, 4.01, 3.96, 3.93, 3.85, 3.82,
3.72, 3.60, 3.57, 1.16, 1.11。多糖的氢谱信号大多数
在 δ 3.5～5.5，δ 5.05, 4.99, 4.96, 4.94 为异头碳质子
信号，显示可能含有 4 种单糖，δ 1.11 处是岩藻糖
的 6 位质子信号。13C-NMR 谱显示[5-6]，δ 102.4,
101.5, 98.1 为端基异头碳信号。δ 70.0～75.0 为未取
代的 C-2, C-3, C-4 共振峰，δ 77.6 是被取代的 C-4 糖
苷键的共振峰，δ 70.2 为发生取代的 C-6 的共振峰，
δ 61.3 说明存在游离的 C-6，δ 15.8 处含有吸收峰说
明有 6-位脱氧糖的甲基存在，这与气质联用检测出
的岩藻糖相符，由峰高比可知多糖的主链是由 1-6 连
接的糖苷键为主，并有 1-4 连接的糖苷键的支链。
5 讨论
文献报道有多种展开系统，且均是单次展开。
但实验中多次尝试，发现单次展开分离效果不佳，
后采用 2 种展开剂 2 次展开达到满意的分离效果。
另外，本实验尝试过多种单糖显色剂，最终选择显
色效果最好的苯胺-邻苯二甲酸显色剂。
GC-MS 分析中衍生化方法的不同对检测结果
影响很大，本实验比较了硅烷化以及糖腈乙酰酯衍
生化的方法，采用糖腈乙酰酯衍生化的方法出峰效
果较好。
本实验在经典的水提醇沉的多糖提取方法的基
础上进一步改进，获得 4 种不同相对分子质量段的茯
苓多糖，确定了茯苓多糖的相对分子质量对抗肿瘤活
性的影响，为开发茯苓多糖药物提供依据。茯苓多糖
ATPCP 的结构研究有利于进一步探索其结构与抗肿
瘤活性的关系，以便寻找更为有效的药物多糖。
参考文献
[1] Wang Y F, Zhang M, Ruan D, et al. Chemical

0 5 10 15 20 25 30
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A
B

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