全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 19 期 2013 年 10 月 ·2688·
大孔树脂纯化核桃隔膜总黄酮的工艺研究
王国军 1,唐 辉 1*,张淑兰 2*,冯 荣 1,王 幻 1,关 丽 2,刘怡娟 1
1. 石河子大学药学院,新疆 石河子 832000
2. 新疆生产建设兵团医院 药剂科,新疆 乌鲁木齐 830002
摘 要:目的 研究核桃隔膜总黄酮的大孔树脂纯化工艺。方法 通过对 12 种不同型号大孔树脂进行静态吸附与解吸实验,
优选适宜的大孔树脂,并优化分离纯化条件。结果 AB-8 型大孔树脂对核桃隔膜总黄酮有较好的吸附和洗脱效果,其最佳
分离纯化条件为 pH 4.70,0.713 5 mg/mL 的质量浓度上样,树脂的上样量为 4 mL/g,上样体积流量为 1.5 BV/h,依次用 2 BV
水洗脱,2.5 BV 50%乙醇洗脱。经 AB-8 树脂处理后的总黄酮质量分数达 72.25%,收率为 93.94%。结论 AB-8 型大孔树脂
用于富集核桃隔膜总黄酮效果最佳,是一种理想的分离纯化介质。
关键词:核桃隔膜;总黄酮;大孔树脂;纯化工艺;吸附动力学特性
中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)19 - 2688 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.19.011
Purification of total flavonoids from diaphragma of Juglans regia
by macroporous resin
WANG Guo-jun1, TANG Hui1, ZHANG Shu-lan2, FENG Rong1, WANG Huan1, GUAN Li2, LIU Yi-juan1
1. College of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832000, China
2. Department of Pharmacy, Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumqi 830002, China
Abstract: Objective To investigate the purification technology of total flavonoids from the diaphragma of Juglans regia by
macroporous resin. Methods Twelve macroporous resins were chosn with static and dynamic adsorption and desorption experiments
to optimize the purification parameters. Results AB-8 macroporous resin was found to have good adsorption and desorption effects.
The optimal purification conditions were pH value of 4.70, sample mass concentration of 0.713 5 mg/mL, the loaded amount of 4
mL/g, and loading flow rate of 1.5 BV/h. The sample was eluted by water with 2 BV and 50% ethanol of 2.5 BV, respectively. The
purity of total flavonoids increased to 72.25% after the purification, and the yield was 93.94%. Conclusion AB-8 is an ideal resin with
the best enrichment for separating and purifying the total flavonoids from diaphragma of J. regia.
Key words: diaphragma of Juglans regia; total flavonoids; macroporous resin; purification technology; adsorption kinetics characteristics
核桃隔膜(diaphragma of Juglans redia L.)又
名分心木,为胡桃科胡桃属植物核桃内果皮的种隔,
系新疆维吾尔民间用药,用于治疗肾虚遗精、阳痿
早泄等泌尿系统疾病[1-4]。现代研究表明,核桃隔膜
具有抗氧化、抗菌、抗衰老、调节免疫等多种药理
作用[5-6]。化学成分研究表明,核桃隔膜中总黄酮的
量高于核桃仁、核桃油[7]。目前对核桃隔膜的研究
仅局限于黄酮的提取和定量测定[8-9],对黄酮的纯化
工艺研究还未见报道。
大孔吸附树脂是一类不溶于酸、碱及各种有机
溶剂的有机高聚物吸附剂,具有选择性好、操作简
单、适用范围广等特点,在很多领域都有广泛的应
用[10]。近年来,大孔吸附树脂在医药领域(特别是
天然药物纯化)中广为应用,是提取分离中药有效
成分的一种有效方法[11]。本实验为首次采用大孔吸
附树脂法对核桃隔膜提取物进行纯化富集,通过对
12 种树脂的静态、动态吸附和解吸附筛选实验,优
选出对核桃隔膜总黄酮具有高吸附分离性能的树脂,
收稿日期:2013-05-20
基金项目:兵团科技项目资助(2011BA055)
作者简介:王国军(1988—),男,硕士研究生,研究方向为天然药物分析。Tel: 18139266811 E-mail: 779772056@qq.com
*通信作者 唐 辉,女,教授,研究方向为药物分析及新药研究。Tel: (0993)2055002 E-mail: th_pha@shzu.edu.cn
张淑兰,女,主任药师,从事药物成分分析研究。Tel: (0991)2668520 E-mail: btyy2668520@163.com
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并研究了该树脂吸附分离的工艺条件,为核桃隔膜
总黄酮的提取分离提供了实验方法并为大生产中的
应用提供技术参数。
1 仪器与材料
UV—2401 紫外分光光度仪(日本岛津公司),
德国 Sartorius BP211D 十万分之一电子分析天平;
上海科导 SK5200HP 超声清洗器。日本 EYELA 旋
转蒸发仪。玻璃色谱柱(30 cm×2.0 cm,上海青浦
沪西公司)。SHA—C 型水浴恒温振荡器(江苏金坛
市医疗仪器厂),FW100 型植物粉碎机(天津泰斯
特仪器有限公司),PHS—2C 型数字 pH 酸度计(上
海精密科学仪器厂)。
大孔树脂 NKA-9(天津南开大学化工厂),大
孔树脂 D-101、AB-8、HPD-450、HPD-500、HPD-600、
HPD-700、XDA-1(沧州宝恩化工有限公司),大孔
树脂 HPD-100、HP-20(安徽三星树脂科技有限公
司),大孔树脂 LS-300B(蓝深树脂科技),大孔树
脂 D3520(天津市光复精细化工)。核桃隔膜原料购
自乌鲁木齐二道桥市场,经石河子大学药学院成玉
怀高级实验师鉴定为核桃 Juglans regia L. 的荚膜。
木犀草苷对照品(批号 111720-201106)由中国药品
生物制品检定所提供;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 核桃隔膜总黄酮的测定[12]
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取木犀草苷对照
品 9.91 mg,甲醇溶解定容,制成质量浓度为 198.2
μg/mL 的对照品溶液,摇匀、备用。
2.1.2 线性关系考察 精密量取木犀草苷对照品溶
液 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,置 25 mL 量瓶中,
各加 5% NaNO2 0.7 mL,摇匀后放置 5 min,再加
10% Al(NO3)3 1.2 mL 摇匀,放置 12 min,最后加 4%
NaOH 12.0 mL,振摇,加水至刻度,摇匀后放置 5
min,在 500 nm 处测定吸光度(A)值。以 A 值(Y)
对质量浓度(X)进行线性回归,得木犀草苷的回
归方程为 Y=0.013 2 X+0.015 6,r=0.999 5,结果
表明木犀草苷在 15.86~47.57 μg/mL 呈良好的线性
关系。
2.1.3 上样液的制备 称取粉碎后的核桃隔膜
100.0 g,用 60%乙醇,料液比 1∶15,超声提取 2
次,每次 35 min,合并提取液,减压浓缩后得到粗
提物,将其溶于水,滤过,制成吸附所需浓度的原
料液,备用。
2.1.4 显色溶液的制备 取木犀草苷对照品溶液或
样品溶液 2.0~6.0 mL,置 25 mL 量瓶中,加 5%
NaNO2 0.7 mL,摇匀后放置 5 min,再加 10%
Al(NO3)3 1.2 mL 摇匀,放置 12 min,最后加 4%
NaOH 12.0 mL,振摇,加水至刻度,摇匀后放置 5
min,即得显色溶液。
2.1.5 测定波长的选择 吸取对照品和样品溶液各
3.0 mL,按“2.1.4”项下方法制得显色溶液,在波
长 200~800 nm 处扫描。结果表明,对照品和样品
的显色溶液均在 500 nm 处有最大吸收,因此选 500
nm 为测定波长。
2.1.6 总黄酮的测定 称取粗提物 15.36 mg,水定
容于 25 mL 量瓶中,从中精密吸取 2 mL,按“2.1.2”
项下“加 5% NaNO2 0.7 mL 起”依法测定 A 值,测
得粗提物中总黄酮质量分数为 31.27%,RSD 为
2.23%(n=3)。
2.2 树脂筛选研究[13-14]
2.2.1 大孔树脂预处理 树脂先用 95%乙醇浸泡
24 h 充分溶胀后,用水洗至无白色浑浊现象,再以
蒸馏水洗至无醇味。洗尽醇后用 4% HCl 溶液浸泡 4
h,然后用蒸馏水洗至中性,最后用 4% NaOH 溶液
浸泡 4 h,蒸馏水洗至中性,备用。
2.2.2 静态吸附-解吸实验 称取预处理好的 12 种
型号大孔树脂(D-101、HPD-100、HPD-700、HP-20、
LS-300B、HPD-450、AB-8、HPD-600、HPD-500、
XDA-1、NKA-9、D3520)各 2.0 g(湿质量)置 100
mL 具塞锥形瓶中,分别加入 50 mL“2.1.3”项下
制得的样品液(1.081 0 mg/mL),于恒温水浴振荡
器中振摇 24 h,上层液滤过,测定 A 值,计算总黄
酮质量浓度。将滤出的各树脂另置于 100 mL 具塞
锥形瓶中,精密加入 70%乙醇 50 mL,其余操作同
上,得解吸后的滤液,测定 A 值,计算解吸液的质
量浓度。计算静态吸附量、解吸量、吸附率及解吸
率[吸附量=(C0-C1) V1 / m,解吸量=C2V2 / m,
吸附率=(C0-C1) / C0,解吸率=C2 / (C0-C1),式
中 C0 为吸附前样液中总黄酮质量浓度(mg/mL),
C1 为吸附后样液中总黄酮质量浓度(mg/mL),C2
为解吸后样液中总黄酮质量浓度(mg/mL),V1 为
吸附液体积(mL),V2 为解吸液体积(mL),m 为
湿树脂质量(g)],结果见表 1。可见,HPD-700、
HPD-450、AB-8、HPD-500、HPD-600、XDA-1 型
大孔型号树脂对核桃隔膜总黄酮的吸附率均超过
72%,但从解吸率考察 HPD-600、XDA-1 型号树脂
却不到 80%,而其他 4 种树脂解吸率均超过 80%。
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表 1 12 种大孔树脂的静态吸附和解吸性能
Table 1 Adsorption-desorption capacity of 12 types
of macroporous resins
树脂类型 极性
吸附量 /
(mg·g−1)
吸附率 /
%
解析量 /
(mg·g−1)
解吸率 /
%
D-101 非极性 17.23 68.92 14.95 80.27
HPD-100 非极性 16.81 67.25 13.68 75.24
HPD-700 非极性 18.06 72.25 16.30 83.48
HP-20 非极性 16.65 66.60 14.15 78.61
LS-300B 弱极性 17.23 68.92 15.95 85.64
HPD-450 弱极性 19.03 76.13 16.60 80.68
AB-8 弱极性 18.55 74.19 16.95 84.54
HPD-600 极性 19.15 76.60 16.30 78.84
HPD-500 极性 19.45 77.80 17.70 84.19
XDA-1 极性 19.01 76.04 15.50 75.43
NKA-9 极性 17.81 71.23 15.13 78.57
D3520 极性 17.30 69.20 16.05 85.83
综合考虑分析,选取 HPD-700、HPD-450、AB-8、
HPD-500 4种树脂作进一步的静态吸附动力学考察。
2.2.3 大孔树脂的静态吸附动力学特性 称取预处
理好的 HPD-700、HPD-450、AB-8、HPD-500 型号
大孔树脂各 2.0 g,于 100 mL 具塞锥形瓶中,精确
加入一定质量浓度的供试液 50 mL,置于恒温振荡
器中振荡,每隔 1 h 取上清液,测定 A 值并计算吸
附率,绘制各型号树脂静态吸附曲线,结果见图 1。
由图可知AB-8树脂对供试液的吸附率在4 h内升高
最快,4 h 后吸附率趋于稳定,基本达到吸附平衡,
而其他 3 种树脂对供试液的吸附率均在 8 h 内上升
最快,8 h 后吸附率趋于稳定,基本达到吸附平衡,
因此 AB-8 树脂为核桃隔膜总黄酮分离纯化的最佳
树脂。
2.3 AB-8 树脂分离纯化总黄酮的工艺
2.3.1 上样液质量浓度对 AB-8 树脂吸附率的影响
图 1 4 种树脂的静态吸附曲线
Fig. 1 Static adsorption curve of four types of resins
称取 5 份处理好的 AB-8 型树脂各 2.0 g 于 100 mL
具塞锥形瓶中,精确加入总黄酮质量浓度分别为
0.271 9、0.516 4、0.713 5、0.969 9、1.192 2 mg/mL
的供试液,置于恒温振荡器中振荡 4 h 后,取上清
液测定 A 值,计算吸附率,结果吸附率分别为
69.40%、71.72%、73.37%、73.23%、73.74%。上样
液质量浓度在 0.271 9~0.713 5 mg/mL 时,吸附率
迅速增加,质量浓度在 0.713 5~1.192 2 mg/mL 时,
吸附率增加速度减慢,考虑到上样质量浓度过高时,
容易发生絮凝和沉淀,堵塞树脂柱。故确定 0.713 5
mg/mL 为该树脂的最佳上样质量浓度。
2.3.2 上样液pH值对AB-8树脂吸附率的影响 称
取 5 份处理好的 AB-8 型树脂各 2.0 g,分别调至 pH
值为 1.70、2.70、3.70、4.70(原液)、5.70、6.70
的供试液,振荡吸附 4 h 后,取上清液测定 A 值,
结果吸附率分别为 77.14%、75.09%、73.38%、
73.26%、65.30%、62.81%。当 pH 值低于 4.70 时吸
附效果好,随着供试液 pH 值的升高,吸附效果下
降,说明总黄酮在酸性条件下容易被吸附。供试液
pH 值在 1.70~4.70 树脂的吸附性能较好。但 pH 值
过低时,可能会导致黄酮苷的水解。故确定为 4.70
为优选 pH 值。
2.3.3 上样体积流量对 AB-8 树脂吸附率的影响
取核桃隔膜提取液 100 mL(0.713 5 mg/mL),以不
同的体积流量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h)上
样,测定吸附后溶液中总黄酮质量浓度,计算吸附
率,结果吸附率分别为 75.69%、75.64%、74.79%、
72.13%、65.17%。吸附率随上样体积流量增大而降
低,体积流量在 1~2 BV/h 时,下降趋势小,在 2~
2.5 BV/h 时下降趋势明显。其原因可能是体积流量
较小时,提取液与树脂接触的时间较长,有利于黄
酮类物质从液相扩散到树脂内部,从而提高了吸附
率,综合分析,选择上样体积流量为 1.5 BV/h。
2.3.4 AB-8 树脂动态吸附试验 取处理好的树脂
60 g(80 mL)装柱,将供试品溶液以水调制质量浓
度为 0.713 5 mg/mL 时上样,每 10 mL 收集 1 管,
测定 A 值,并绘制动态吸附曲线,结果见图 2。由
图可见,初始阶段,流出液的 A 值很小,吸附效率
较高,当上样量增加到 260 mL(约 3 BV)时,开
始有明显泄漏,并逐渐接近饱和吸附。故选择树脂
的上样量为 4 mL/g。
2.3.5 洗脱溶剂乙醇体积分数对 AB-8 树脂解吸率
的影响 称取 6 份处理好的 AB-8 型树脂各 2.0 g,
吸
附
率
/
%
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
t / h
HPD-450
HPD-500
HPD-700
AB-8
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图 2 AB-8 树脂的动态吸附曲线
Fig. 2 Dynamic adsorption curve of AB-8 resin
用一定质量浓度的供试品溶液使之吸附平衡后,分
别加入等体积的 40%、50%、55%、60%、65%、70%、
75%、80%、85%、90%乙醇,置于恒温振荡器上解
吸附 4 h,取上清液测定 A 值,结果解析率分别为
76.46%、83.62%、81.78%、80.95%、76.27%、74.41%、
71.89%、74.95%、75.85%、76.41%。当乙醇体积分
数小于 50%时,解吸率随乙醇体积分数的增加而增
大,50%乙醇解吸率最大,当乙醇体积分数大于 50%
时,解吸率呈下降趋势。可能是由于乙醇体积分数
增大,醇溶性的杂质增多,降低了解吸率。因此,
选择乙醇体积分数为 50%。
2.3.6 AB-8 树脂动态解吸试验 上样吸附后,先用
2 BV 蒸馏水洗去杂质,然后用 50%乙醇以 1.5 BV/h
的体积流量洗脱,每 10 mL 收集 1 管洗脱液,测定
A 值,并绘制动态解吸曲线,结果见图 3。由图可
知,50%乙醇的洗脱曲线峰型集中,无明显拖尾现
象。第 7 管,即 70 mL 解吸液中总黄酮的量就已达
到最大值,第 18 管,即 180 mL 解吸液中总黄酮已
基本洗脱完全。因此,选取 180 mL(约 2.5 BV)
为洗脱液用量。
2.4 AB-8 树脂最佳工艺验证
为验证优选工艺的可行性,按照已优选的最佳
工艺条件:pH 值为 4.70、上样质量浓度为 0.713 5
mg/mL,树脂的上样量 4 mL/g,上样体积流量 1.5
图 3 AB-8 树脂的动态解吸曲线
Fig. 3 Dynamic desorption curve of AB-8 resin
BV/h,依次用 2 BV 水洗脱,2.5 BV 50%乙醇洗脱,
进行 3 次平行试验,洗脱液浓缩至干,称质量。经
测定计算得总黄酮的质量分数和收率,结果总黄酮
质量分数分别为 72.66%、72.01%、72.07%,收率分
别为 94.16%、93.68%、93.99%。结果表明在上述工
艺条件下 AB-8 树脂对核桃隔膜总黄酮的吸附纯化
稳定,且总黄酮的质量分数、收率均较高。
总黄酮质量分数=(Ce×Ve) / Qe
总黄酮收率=P / Q
式中 Ce为洗脱液的质量浓度(mg/mL),Ve为洗脱液的体积
(mL),Qe 为洗脱液干燥后的质量(g),P 为洗脱液中总黄
酮的质量(g),Q 为上样液中总黄酮的质量(g)
2.5 AB-8 树脂再生试验研究
AB-8 树脂柱先用 95%乙醇洗脱至无色后,再
用 5 BV、4%的 NaOH 洗脱,体积流量 1.5 BV/h,
然后用蒸馏水洗至中性,再用 5 BV、4% HCl 洗脱,
最后用蒸馏水洗至中性即可。再生后,质量分数仍
可达 60.5%以上,收率 76.7%以上。经过 3 次再生
后树脂颜色变深,残留在树脂上的杂质较多使吸附
能力减弱不可再用。
3 讨论
不同类型的树脂对核桃隔膜总黄酮的吸附性能
均为极性(HPD-600、HPD-500、XDA-1)>弱极
性(AB-8、HPD-450)>非极性树脂(HPD-700),
显示极性和弱极性树脂具有较好的吸附性能,但解
吸率却显示为弱极性树脂(LS-300B、HPD-450、
AB-8)>极性树脂(HPD-500、D3520)>非极性
树脂(D-101、HPD-700)。综合判断,弱极性大孔
树脂更适用于核桃隔膜总黄酮的分离纯化。
实验中考察了吸附率、解析率、吸附液质量浓
度及 pH 值、洗脱剂乙醇体积分数等影响树脂吸附
性能的主要因素。同时,用水量和洗脱剂的体积流
量对黄酮质量分数也有影响,用水量增大,会对黄
酮质量分数有所提高,但是也降低了纯化物的量;
解吸体积流量增大,则会造成不同极性的溶质分子
洗脱不均匀,从而引起质量分数下降;体积分数过
慢则会延长纯化周期。因此,经过预试验及文献报
道[15],采用解吸体积流量为 1.5 BV/h,水的洗脱用
量为 2 BV。
树脂的预处理是除去树脂中残留物,是保证树
脂发挥高效分离纯化功能的前提条件;样品的预处
理也很关键,上柱前样品的澄清程度和树脂的载样
量、纯化效果有直接的关系;样品洗脱前,配好的
总
黄
酮
/
(m
g·
m
L−
1 )
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 100 200 300 400
洗脱体积 / mL
8
6
4
2
0
总
黄
酮
/
(m
g·
m
L−
1 )
0 80 160 240
流出液体积 / mL
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乙醇先超声脱气,可以防止乙醇与水混溶放出大量
热而产生气泡。
实验中选用了 12 种常用于分离黄酮的大孔吸附
树脂进行筛选。通过静态吸附与解吸、静态动力学
特性实验,确定 AB-8 型树脂对核桃隔膜总黄酮有良
好的吸附性能,其工艺条件为 pH 值 4.70、0.713 5
mg/mL 的上样质量浓度,上样量 4 mL/g 树脂,上
样体积流量为 1.5 BV/h,依次用 2 BV 水洗脱,2.5
BV 50%乙醇洗脱,树脂可重复使用 3 次。在此条件
下,乙醇洗脱物中核桃隔膜总黄酮质量分数达 72%
以上,收率 93%以上,与纯化前相比总黄酮的质量
分数明显提高,富集效果良好。该工艺操作简单、
重复性好,可作为核桃隔膜总黄酮的有效富集方法,
在核桃隔膜总黄酮工艺中有一定的推广应用价值。
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