全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月

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墓头回环烯醚萜酯提取部位抗肿瘤作用及机制研究
杨 波，王一奇，程汝滨，陈佳丽，张如松*
浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053
摘 要：目的 研究墓头回醋酸乙酯提取物环烯醚萜酯部位（PHEBB）的体内外抗肿瘤作用及其机制。方法 硅胶柱色谱
法精制 PHEBB；反相高效液相色谱法分析 PHEBB 化学成分。MTT 法检测 PHEBB 对人肿瘤细胞 KB、COLO-205、SGC-7901
的抑制活性。采用小鼠移植性瘤模型研究 PHEBB 对小鼠 S180肉瘤、H22肝癌的体内抗肿瘤作用；免疫组化法研究 PHEBB 对
肿瘤组织中相关基因表达的影响。结果 PHEBB 主要成分均为环烯醚萜酯类，主要有 desacetylisovaltratum、isovaltrate
acetoxyhydrin。体外实验结果显示，PHEBB 对 KB、COLO-205、SGC-7901 等癌细胞均具有显著抑制作用，IC50在 2.27～5.49
μg/mL。体内实验显示，PHEBB 以 60 mg/kg ip 给予荷瘤小鼠，对 S180肉瘤的抑制率为 45.5%，对 H22肝癌的抑制率为 54.2%；
免疫组化检测结果显示，PHEBB 能上调小鼠 H22肿瘤组织中 Bax 表达，下调 Bcl-2 表达，且能降低肿瘤组织中微血管密度。
结论 PHEBB 抗肿瘤药效物质为环烯醚萜酯；其体内外均具有一定抗肿瘤作用，且其抗肿瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡
及抑制肿瘤微血管有关。
关键词：墓头回；环烯醚萜酯部位；抗肿瘤；细胞凋亡；肿瘤微血管
中图分类号：R282.710.5；R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)20 - 2884 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.20.017
Antitumor effect of iridoid ester fraction from Patriniae Radix and its mechanism
YANG Bo, WANG Yi-qi, CHENG Ru-bin, CHEN Jia-li, ZHANG Ru-song
College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China
Abstract: Objective To purify the iridoid ester fraction of ethyl acetate extract from Patriniae Radix (PHEBB), and to study the
antitumor effect and mechanism in vivo and in vitro. Methods The silica gel column chromatography was used to purify the effective
fraction. The chemical constituents of PHEBB were elucidated by RP-HPLC; MTT assay was used to study the inhibition of PHEBB
on human oral epithelial cancer cells KB, human colon cancer cells COLO-255, and human gastric cancer cells SGC-7901; Mice
transplanted S180 and H22 experiments were used to study the antitumor effect in vivo; The immunohistochemical method was used to
study the effect of IEEAM on the expression of related genes in tumor tissue. Results The main effective components in PHEBB
were desacetylisovaltratum and isovaltrate acetoxyhydrin, and they are both iridoid esters. The results of MTT showed that PHEBB
had the significant inhibition on KB, COLO-205, and SGC-7901 cells, and the IC50 values were within 2.27—5.49 μg/mL; The
experiment of mice transplanted tumor showed that after ip injection with PHEBB at a dose of 60 mg/kg, there was an inhibitory rate of
45.5% on S180 and 54.2% on H22; The immunohistochemistry results showed that PHEBB could upregulate Bax expression in H22
cells, decrease Bcl-2 expression, and reduce the microvascular density in tumor tissue. Conclusion The main components in PHEBB
are iridoid esters, and have certain antitumor effect in vitro and in vivo; the antitumor mechanism of PHEBB might be associated with
the induction of apoptosis and the inhibition of tumor microvessel.
Key words: Patriniae Radix; iridoid ester fraction; antitumor; cell apoptosis; tumor microvessel

墓头回 Patriniae Radix 系败酱科植物异叶败酱
Patrinia heterophylla Bunge 及糙叶败酱 P. scabra
Bunge 的根及根茎，民间常用于治疗恶性肿瘤，疗
效显著。水溶性三萜皂苷多是墓头回抗肿瘤作用的
药效物质[1]。也有研究表明异叶败酱近缘植物脂溶
性提取物亦具有显著抗肿瘤作用[2]。
本课题组从墓头回醋酸乙酯提取物（PHE）中
分离、精制得到有效部位 PHEB（主要含环烯醚萜

收稿日期：2013-03-18
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY13C020003）；浙江省医药卫生科技计划（2012KYB137）
作者简介：杨 波（1978—），男，讲师，主要研究方向为中药及天然药物抗肿瘤活性成分的研究与开发。E-mail: skyby@126.com
*通信作者 张如松 Tel: (0571)86613798 E-mail: zrs789@hotmail.com
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酯和木质素），PHEB 在体内外均具有显著的抗肿
瘤作用，还具有诱导人前列腺癌细胞 PC3 凋亡的作
用[3]，继而从 PHEB 中分离、鉴定了 8 个环烯醚萜
酯、3 个木脂素。但前期实验显示，PHEB 有一定
毒性，每次 ip 给药 60 mg/kg 10 d 后有小鼠死亡。
本试验将 PHEB 进一步精制，以期增效减毒，研究
精制后的有效部位中药效物质以及体内外抗肿瘤作
用及其机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
PHEB 由浙江中医药大学中药资源工程学实验
室从 PHE 中分离、精制得到；desacetylisovaltratum、
isovaltrate acetoxyhydrin 为本课题组从 PHEB 中分
离并鉴定，质量分数＞98%；DMEM 培养基、RPMI
1640 培养基，美国 Invitrogen Life Technologies 公
司；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物制品有限公
司；MTT，美国 Biosharp 公司；胰蛋白酶，美国
Amresco 公司；环磷酰胺，德国 Baxter Oncology
Gmbh 公司；VWF 抗体，丹麦 DAKO 公司；Bax
（P-19）SC-526、Bcl-2（N-19）SC-492，美国 Santa
Cruz Biotechnology 公司；化学纯石油醚、醋酸乙酯；
色谱纯乙腈；水为双蒸水。
1.2 仪器
高效液相色谱仪，美国 Waters Corporation 公
司；Kromasil C18 分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）,
瑞典 Akzo Nobel 公司；CO2 培养箱、Sorvall ST16
离心机，美国 Thermo Fisher Scientific 公司；Model
680 酶标仪，美国 Bio-Rad 公司；Forma—86C 超低
温冰箱，美国 Thermo electron 公司；CKX41 倒置显
微镜，日本 Olympus 公司。
1.3 细胞与动物
人口腔上皮癌 KB 细胞、人结肠癌 COLO-205
细胞、人胃癌 SGC-7901 细胞、小鼠 S180 肉瘤、H22
肝癌瘤株，均由浙江省医学科学院提供。
雄性 ICR 小鼠，体质量（20±2）g，由浙江中
医药大学动物实验中心提供，许可证号 SYXK（浙）
2008-0115。
2 方法
2.1 PHEBB 的制备
对 PHEB 进行色谱分离，得到 3 个粗提取部位，
依次为 PHEBA、PHEBB、PHEBC。经 RP-HPLC
分析，PHEBB 主要成分为 desacetylisovaltratum、
isovaltrate acetoxyhydrin，均为环烯醚萜酯类成分，
质量分数分别为 65%、25%。
2.2 细胞培养
SGC-7901 细胞在 RPMI 1640 培养液中培养，
KB 及 COLO-205 细胞在 DMEM 培养液中培养。
培养基用 NaHCO3 调 pH 值至近中性，配成含
10%FBS 的全培养液，加 2%双抗。细胞均在 37 ℃、
95%相对湿度、5%CO2培养箱中培养。每周传代1～
2 次。
2.3 MTT 法检测肿瘤细胞的生长[4]
取“2.2”项下对数生长期肿瘤细胞，消化计数，
按 2.5×103～3×103/孔接种于 96 孔培养板，每孔
100 μL，培养 24 h，加不同质量浓度的 PHEBB（至
终质量浓度 0.5～20 μg/mL），每组 4 个平行孔。培
养 72 h，加 MTT（5 mg/mL）20 μL，37 ℃培养 4 h，
终止培养，用酶标仪测定 570 nm 处吸光度（A）值，
计算肿瘤细胞生长抑制率。根据抑制率，用
82798-IC50 软件计算半数抑制浓度（IC50）。实验重
复 3 次。
抑制率＝(A 对照－A 给药) / A 对照
2.4 PHEBB 体内抗肿瘤实验
无菌抽取 S180 肉瘤及 H22 肝癌荷瘤小鼠腹水，
以无菌生理盐水稀释，调细胞密度为 1×107/mL，
于每只小鼠右前肢皮下接种 0.2 mL。接种 24 h 后将
小鼠随机分为 5 组：PHEBB 低、中、高剂量（30、
45、60 mg/kg）组，模型组（0.9%生理盐水），环磷
酰胺（25 mg/kg）阳性对照组，每组 10 只。各给药
组每日 ip 给药 1 次，连续给药 10 d。停药次日称小
鼠的体质量，解剖剥离肿瘤组织，称质量，计算抑
瘤率。同时取瘤块，浸泡在 5%甲醛溶液中，以备
免疫组化测定。
抑瘤率＝1－实验组平均瘤质量 / 模型组平均瘤质量
2.5 免疫组化染色法检测相关蛋白表达[5-6]
取“2.4”项下各组小鼠 H22 肝癌细胞移植瘤，
结节外固定，观察大体形态后放入包埋框内，在中
性缓冲福尔马林液固定 4 h，自来水、80%～100%
乙醇梯度洗涤，二甲苯透明 2 次，切片在石蜡液中
浸蜡 3 h，包埋组织，连续切片，烘箱烤片 6 h。二
甲苯脱蜡，100%～70%乙醇梯度洗涤，蒸馏水水化，
高温、高压下进行抗原修复，PBS洗涤 3次，3% H2O2
处理 10 min，PBS 洗 3 次。滴加适当比例稀释的一
抗，Bax（P-19）SC-526（1∶200），Bcl-2（N-19）
SC-492（1∶150），VWF（1∶200），PBS 代替一抗
作为空白对照。滴加一抗后，37 ℃孵育 60 min，
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PBS 冲洗 3 次，滴加山羊抗兔二抗，37 ℃孵育 40
min，PBS 冲洗 3 次，二氨基联苯胺（DAB）显色 1
min，终止反应后，Harris 苏木素液复染细胞核 1
min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
Bax 和 Bcl-2 阳性表达为细胞核核膜、胞浆着
色均为黄色，阴性表达为细胞核膜及胞浆呈蓝色。
微血管密度微血管密度（MVD）阳性表达为血管内
皮细胞呈棕色或棕黄色。
2.6 数据处理
数据均以 ±x s 表示，采用 SPSS 15.0 统计学
软件进行统计分析，两组间比较采用 Dunnett’s t
检验。
3 结果
3.1 对肿瘤细胞增殖的影响
PHEBB对KB细胞、COLO-205细胞、SGC-7901
细胞的增殖均具有显著抑制作用，IC50 值分别为
（3.80±1.69）、（5.49±0.97）、（2.27±0.25）μg/mL。
3.2 对小鼠 S180 肉瘤和 H22 肝癌移植瘤的影响
PHEBB对小鼠 S180肉瘤及H22肝癌移植瘤均具
有一定的抑制作用，剂量分别为 30、45、60 mg/kg
时，对小鼠移植性 S180 肉瘤的抑瘤率分别为 31.7%、
35.4%、45.5%，对小鼠移植性 H22 肝癌的抑瘤率分
别为 22.0%、27.4%、54.2%，且呈剂量相关性。结
果见表 1、2。PHEBB 对小鼠体质量无显著影响。
表 1 PHEBB 对 S180荷瘤小鼠肿瘤质量和体质量的影响 ( ± = 10x s , n )
Table 1 Effects of PHEBB on tumor and body weights of S180-bearing mice ( ± = 10x s , n )
体质量 / g 组 别 剂量 / (mg·kg−1)
给药前 给药后
肿瘤质量 / g 抑瘤率 / %
模型组 — 23.46±1.54 25.56±1.10 0.90±0.15 —
30 23.16±1.16 23.42±1.88 0.61±0.05 31.7
45 22.39±1.33 22.19±2.65 0.58±0.08** 35.4
PHEBB
60 22.43±1.32 21.77±1.77 0.49±0.13** 45.5
环磷酰胺 25 22.71±1.12 22.89±3.06 0.48±0.20** 46.6
与模型组比较：**P＜0.01，下表同
**P < 0.01 vs model group, same as below Table
表 2 PHEBB 对 H22荷瘤小鼠肿瘤质量和体质量的影响 ( ± = 10x s , n )
Table 2 Effects of PHEBB on tumor and body weights of H22-bearing mice ( ± = 10x s , n )
体质量 / g 组 别 剂量 / (mg·kg−1)
给药前 给药后
肿瘤质量 / g 抑瘤率 / %
模型组 — 21.31±0.91 27.94±2.35 1.33±0.29 —
30 22.27±0.69 26.88±2.11 1.04±0.19 22.0
45 21.97±1.21 23.98±1.44 0.97±0.20** 27.4
PHEBB
60 23.13±1.69 22.88±2.57 0.61±0.09** 54.2
环磷酰胺 25 22.34±1.18 25.37±2.07 0.85±0.11** 36.4

3.3 对相关蛋白表达的影响
模型组小鼠 H22 肝癌移植瘤组织 Bax 呈蓝色；
PHEBB各剂量组及环磷酰胺组小鼠H22肝癌移植瘤
组织 Bax 棕黄色染色加深。模型组小鼠 H22肝癌移
植瘤组织 Bcl-2 呈棕黄色；PHEBB 各剂量组及环磷
酰胺组小鼠 H22 肝癌移植瘤组织棕黄色染色减弱，
蓝色染色增强。模型组小鼠 H22 肝癌移植瘤组织
MVD 棕黄色染色较弱；PHEBB 各剂量组及环磷酰
胺组小鼠 H22 肝癌移植瘤组织组织棕黄色染色程度
增强。上述结果表明，PHEBB 能上调 Bax 表达，
下调 Bcl-2 表达，降低 MVD，且具有一定的剂量相
关性。结果见图 1。
4 讨论
研究表明，异叶败酱总苷片具有抑制人大肠癌
HT-29 裸鼠异种移植瘤细胞增殖、诱导瘤细胞凋亡
的作用[7]。异叶败酱总苷为水溶性三萜皂苷类成分，
而本研究表明，主要含环烯醚萜酯类成分的异叶败
酱脂溶性提取物 PHEBB 亦具有抗肿瘤作用。
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图 1 免疫组化法测定 PHEBB 对 H22肝癌瘤组织中 Bax、Bcl-2、MVD 表达的影响
Fig. 1 Effects of PHEBB on expression of Bax, Bcl-2, and MVD in mice H22 hepatoma tumor tissue
by immunohistochemical method
从败酱属植物脂溶性提取物中发现了多个环烯醚
萜酯，该类成分具有镇静、催眠作用，并已用于临
床[8-10]。其环烯醚萜酯成分亦具有显著的抑制人源
肿瘤细胞株增殖的活性，是核转运蛋白 Rev 抑制剂，
具有抗 HIV、抗流感、逆转肿瘤多药耐药等生物活
性[11-15]。因此，环烯醚萜酯是一类在生物医药领域
具有良好应用前景的有机小分子。
本实验结果显示，PHEBB 体外对 3 种人源肿瘤
细胞具有一定抑制作用，体内对小鼠移植性肿瘤亦
具有抑制作用。抗肿瘤作用机制研究结果显示，
PHEBB 能上调促细胞凋亡蛋白 Bax 表达，下调抑
制细胞凋亡蛋白 Bcl-2 的表达。因此，破坏促细胞
凋亡因子与抑细胞凋亡因子的动态平衡，诱导瘤细
胞凋亡，可能是 PHEBB 抑制小鼠移植性肿瘤的作
用机制之一。免疫组化检测结果显示，PHEBB 能降
低 H22 小鼠瘤组织微血管密度。因此，抑制小鼠瘤
组织中微血管增殖，亦是 PHEBB 抗肿瘤作用机制
之一。笔者拟扩大瘤谱，进一步研究 PHEBB 对人
源肿瘤细胞抑制作用的选择性，对人源肿瘤裸鼠异
种移植瘤的作用。PHEBB 抗肿瘤作用机制及其作用
的靶点、干预的细胞信号传导通路也将进一步研究。
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Bax
Bcl-2
MVD
模型 PHEBB 30 mg·kg−1 PHEBB 45 mg·kg−1 PHEBB 60 mg·kg−1 环磷酰胺
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