全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

• 2050 •
落花生茎叶 HPLC 指纹图谱研究
郝子博 1, 2，王丽莉 2，张铁军 2*
1. 天津中医药大学，天津 300193
2. 天津药物研究院 中药现代研究部，天津 300193
摘 要：目的 建立落花生茎叶 HPLC 指纹图谱并对其进行化学模式识别。方法 采用 HPLC 法，构建不同产地 13
批落花生茎叶的指纹图谱；采用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行化学模式识别。结果 建立了以 7 个共有峰为
特征指纹信息的 HPLC 指纹图谱，13 批样品被聚分为两大类。结论 HPLC 指纹图谱的构建为落花生茎叶内在质量的
评价研究提供了参考。
关键词：落花生茎叶；HPLC 指纹图谱；化学模式识别；聚类分析；主成分分析
中图分类号：R286.022 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)10 - 2050 - 05
HPLC fingerprint for stems and leaves of Arachis hypogaea
HAO Zi-bo1, 2, WANG Li-li2, ZHANG Tie-jun2
1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
2. Modern Research of Traditional Chinese Medicine Department, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China
Key words: stems and leaves of Arachis hypogaea L.; HPLC fingerprint; chemical pattern recognition; cluster analysis; principal
component analysis

落花生茎叶为豆科落花生属植物落花生
Arachis hypogaea L. 的干燥地上部分。味甘，性平。
具有散瘀消肿、解毒、止汗的功效，用于治疗跌打
损伤，各种疮毒和盗汗等症[1]。现代化学及药理学
研究表明，落花生茎叶中主要含有甾醇、酚酸、脂
肪酸类等成分，具有一定的镇静安神及降压作用，
将落花生茎叶提取物开发成的落花安神合剂更在临
床上肯定了其治疗失眠的疗效[2-8]。我国是落花生生
产大国，落花生茎叶的资源非常丰富，但因其各地
所用品种不同，故无论是从植株形态还是化学成分
上均存在一定的差异。由于落花生并不是传统中药，
所以我国对其作为药物的研究并不完善，没有明确
的质量控制规范。故本实验对落花生茎叶的 HPLC
指纹图谱进行研究，并试图建立落花生茎叶的指纹
图谱，完善落花生茎叶的质量标准，为其进一步开
发奠定基础。
1 仪器与试药
Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪 （ Agilent
Technologies，德国）；AB204—N 电子分析天平
（Mettler Toledo）；超声清洗仪（奥特宝恩斯仪器有
限公司）。
甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇、甲酸为分析纯，
均购自天津市康科德科技有限公司；纯净水购自娃
哈哈有限公司。
13 批落花生茎叶药材分别收集或采集于天津、
河北、陕西、黑龙江、吉林等地（表 1），经天津药
物研究院张铁军研究员鉴定为豆科落花生属植物落
花生 Arachis hypogaea L. 的干燥地上部分。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱 Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5
μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），
线性梯度洗脱：0～15 min，15% A；15～60 min，5%～
30% A；60～80 min，30%～50% A；80～100 min，
50%～100% A；柱温 30 ℃；体积流量 1 mL/min；
检测波长 286 nm；洗脱时间为 100 min；进样量 10

收稿日期：2012-04-23
作者简介：郝子博（1984—），硕士研究生，研究方向为中药新药研发。Tel: 15122680549 E-mail: haozibo123@126.com
*通讯作者 张铁军 Tel: (022)23006848 E-mail: tiezheng4@sina.com
网络出版时间：2012-09-06 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120906.1613.002.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

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表 1 落花生茎叶来源
Table 1 Origins of A. hypogaea stems and leaves
序 号 样 品 产 地 收集时间
S1 落花生茎叶 黑龙江大庆 2010-06
S2 落花生茎叶 吉林扶余县 2010-10
S3 落花生茎叶 天津陈咀镇 2011-10
S4 落花生茎叶 天津陈咀镇 2011-10
S5 落花生茎叶 陕西商南 2011-10
S6 落花生茎叶 天津陈咀镇 2011-11
S7 落花生茎叶 河北香河 2010-11
S8 落花生茎叶 河北香河 2011-06
S9 落花生茎叶 河北香河 2011-11
S10 落花生茎叶 河北邢台 2010-06
S11 落花生茎叶 河北邢台 2011-06
S12 落花生茎叶 河北邢台 2011-10
S13 落花生茎叶 河北武安 2011-08

μL，柱温 30 ℃。
2.2 供试品溶液的制备
将各批次样品粉碎，过 80 目筛。取粉碎后粉末
1 g，精密称定，置于 250 mL 具塞锥形瓶中，精密
加入 70%甲醇 100 mL，称取质量，超声 1 h，放冷
至室温，用甲醇补足减少质量，摇匀，用 0.45 μm
微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取原儿茶酸对照品适量，配制成 0.1
mg/mL 的对照品溶液，避光保存。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取 S2 批次样品供试品连续进
样 6 次，测得各共有峰峰面积的 RSD 均＜3%，说
明仪器精密度良好。
2.4.2 重复性试验 取 S2批次样品 6份，按照“2.2”
项方法制备，供试品溶液分别测得各共有峰峰面积
RSD 均＜3%，表明方法重复性良好。
2.4.3 稳定性试验 取 S2 批次样品制备供试品，
分别在 0、2、6、8、12 h 进样，测得各共有峰峰面
积 RSD 均＜3%，说明样品在 12 h 内稳定。
3 结果
3.1 指纹图谱的测定及共有峰标记
精密吸取各供试品适量，在“2.1”项色谱条件
下进行测定。共标定 7 个特征峰（图 1），选取原儿
茶酸作为参照峰，保留时间与峰面积为 1，计算其
他各峰的相对保留时间与相对峰面积值，结果见表
2 和 3。

1-原儿茶酸
1-protocatechuic acid
图 1 落花生样品的 HPLC 指纹图谱
Fig. 1 HPLC fingerprint of A. hypogaae samples
表 2 各共有峰的相对保留时间
Table 2 Relative retention time of common peaks
相对保留时间 样 品 峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7
S1 1 1.185 452 1.559 773 2.246 404 2.268 004 2.335 402 4.382 691
S2 1 1.182 475 1.547 330 2.221 224 2.244 188 2.306 899 4.333 333
S3 1 1.178 294 1.544 502 2.222 487 2.243 964 2.311 682 4.337 778
S4 1 1.176 315 1.508 263 2.201 199 2.219 615 2.289 829 4.301 162
S5 1 1.171 907 1.504 846 2.209 399 2.226 845 2.298 426 4.306 699
S6 1 1.132 483 1.493 645 2.129 352 2.170 658 2.182 768 4.195 524
S7 1 1.104 346 1.401 891 2.021 403 2.052 523 2.066 530 3.987 526
S8 1 1.149 425 1.468 030 2.123 482 2.152 450 2.165 101 4.175 826
S9 1 1.106 781 1.402 194 2.019 004 2.049 418 2.062 804 3.997 542
S10 1 1.110 064 1.446 123 2.048 345 2.081 049 2.093 713 4.046 967
S11 1 1.111 363 1.447 049 2.049 065 2.081 657 2.093 646 4.044 314
S12 1 1.107 524 1.430 581 2.032 372 2.063 950 2.082 253 4.015 789
S13 1 1.106 197 1.415 276 2.030 789 2.060 433 2.077 787 4.011 717
RSD / % － 3.007 012 3.788 027 4.244 721 3.969 523 5.044 035 3.661 759

0 20 40 60 80 100
1
3 4
5
6
7
t / min
2
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

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表 3 各共有峰的相对峰面积
Table 3 Relative peak areas of common peaks
相对峰面积 样 品
峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7
S1 1 6.478 98 0.628 89 4.393 05 1.080 44 2.117 002 0.294 333
S2 1 7.204 13 2.594 32 1.452 20 2.025 84 1.023 256 0.421 189
S3 1 9.993 59 1.256 41 3.897 44 1.378 20 1.403 846 0.592 949
S4 1 10.855 26 0.754 39 8.855 26 1.530 70 3.030 702 0.973 684
S5 1 10.177 33 1.212 21 4.642 44 7.906 98 1.389 535 0.613 372
S6 1 14.616 82 2.000 00 3.644 86 5.065 42 5.009 346 2.794 393
S7 1 16.716 49 1.994 84 3.324 74 5.989 69 4.541 237 1.159 794
S8 1 30.948 72 4.777 78 2.136 75 10.564 10 5.803 419 1.820 513
S9 1 13.648 90 1.457 68 2.288 40 5.808 78 2.771 160 0.708 464
S10 1 18.190 00 1.405 00 3.005 00 14.180 00 4.365 000 1.190 000
S11 1 21.293 10 1.762 07 0.765 52 3.796 55 1.300 000 0.803 448
S12 1 24.876 19 4.447 62 7.342 86 15.933 33 5.542 857 2.209 524
S13 1 23.064 52 4.395 16 4.379 03 20.895 16 1.403 226 2.161 290
RSD / % 0 46.245 31 64.821 20 58.050 96 84.940 13 58.182 220 65.108 200

3.2 指纹图谱聚类分析
以 13 批不同产地的落花生茎叶为研究对
象，进行指纹图谱研究，得到 7 个明显的共有
色谱峰，将 1 号峰设为参比峰，将其他色谱峰
相对于 1 号峰的峰面积量化，得到原始数据矩
阵，运用 SPSS 统计分析软件对其进行系统聚类
分析，聚类分析图见图 2。从图 2 可以看出，13
批药材可分为两类，1、2、5 号样品为一类，剩
余 10 种样品为第二类，不同产地落花生茎叶样
品间成分差异较大。
3.3 落花生茎叶指纹图谱主成分分析（PCA）
应用 SPSS 统计分析软件对 13 批落花生茎叶进

图 2 落花生茎叶聚类分析图
Fig. 2 Cluster analysis of A. hypogaea stems and leaves
行了 PCA，即将它们投影至低维空间来看它们之间
的微细差别，先将原始数据矩阵经标准化处理，再
对其进行运算，主成分个数提取原则为主成分对应
的特征值大于 1 的前 m 个主成分，主成分分析结
果见表 4。由分析结果可知，前 5 个成分累积贡献
率可达 94.792%，其中前 3 个成分贡献较大。将提
取的 7 个成分和对应的特征值做散点图（图 3），观
察散点图发现前 6 个成分的斜率非常陡，而剩余的
其他成分之间的斜率则非常平缓。斜率越陡贡献率
越大，斜率越平缓，贡献率越小。
通过SPSS统计分析软件计算出因子负荷矩阵，
见表 5，可以看出 1、4、6 号色谱峰在主成分 1 中
有明显的正相负荷，表明其增加，第 1 主成分增大；
2、5 号色谱峰在第 1 主成分中有明显的逆相负荷，
表明其增加，第 1 主成分减少。其他对第 1 主成分
影响相对较小。6、7 号色谱峰有明显的正相负荷，
表 4 特征值与贡献率
Table 4 Eigenvalues and contribution rates
成分 特征值 贡献率 / % 累积贡献率 / %
1 2.709 38.694 38.694
2 1.521 21.728 60.422
3 1.107 15.819 76.241
4 0.776 11.079 87.320
5 0.523 7.472 94.792
6 0.229 3.266 98.059
7 0.136 1.941 100.000

0 5 10 15 20 25
S7
S9
S8
S11
S6
S3
S10
S12
S13
S4
S1
S2
S5
遗传距离
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图 3 落花生茎叶特征值散点图
Fig. 3 Scatter plot of eigenvatues for A. hypogaea
stems and leaves
表 5 因子负荷矩阵
Table 5 Matrix of factor loadings
色谱峰 1 2 3
1 0.289 −0.285 0.297
2 −0.294 0.112 0.107
3 −0.089 −0.309 0.746
4 0.300 0.076 −0.014
5 −0.214 0.103 0.006
6 0.235 0.419 0.122
7 −0.022 0.526 0.481

表明其增加，第 2 主成分增大；1 色谱峰、3 色谱峰
在主成分 2 中有明显的逆相负荷，表明其增加，第
2 主成分减少；其他对第 2 主成分影响相对较小。3、
7 号色谱峰在主成分 3 中有明显的正相负荷，表明
其增加，第 3 主成分增大，其他对第 3 主成分影响
相对较小。
对数据矩阵进行 PCA 后，分别以其第 1、2、3
主成分建立坐标系，进行投影即可得到所有样本的
PCA 平面和 3D 投影图（图 4、5）。样本间内在的
相互关系即可较好地表现出来进而实现样本之间的
分类。从图中可以看出将落花生茎叶分为两类，其
结果与聚类分析结果一致。

图 4 主成分平面得分图
Fig. 4 Score graph of principal components

图 5 主成分 3D 得分图
Fig. 5 3D score graph of principal component
3.4 指纹图谱相似度分析
将在聚类分析中分为一类的 10 批药材数据
导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软
件（2004A）进行色谱峰的匹配，10 批样品的
HPLC 指纹图谱纵向叠加图见图 6，参照文献方
法 [9]测得各药材相似度。S2、S5、S6、S7、S8、
S9、S10、S11、S12、S13 的相似度分别为 0.923、
0.957、0.978、0.931、0.882、0.915、0.933、0.964、
0.943、0.948。从分析结果可以看出，不同产地
不同采收时间的落花生茎叶，在其成分的比例
上有一定差异。
4 讨论
4.1 检测波长的选择
分别对220、254、286、320 nm波长下进行HPLC
检测波长的考察，发现在 286 nm 下分离度最佳，

图 6 10 批落花生茎叶的 HPLC 指纹图谱纵向叠加图
Fig. 6 Vertical overlap of HPLC fingerprint for ten
batches of A. hypogaea stems and leaves

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
1 2 3 4 5 6 7
共有峰
特
征
值


−1.5 −1.0 −0.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0
4
3
2
1
0
−1
−2
2
10
5 7 9 12
11
6
13
3 1
4
PCA1
PC
A
2 8

4
3
2
1
0
−1
−2
432 1 0 −1 −1
−0.500.5
1.01.5
2.02.5
1
4 3
2
8
5 10
12 9
13
11
6
PCA1PCA2
PC
A
3
7
R
S2
S5

S13
～

t / min
0 20 40 60 80 100
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且各色谱峰均能完好地体现在色谱图上，故该指纹
图谱选用 286 nm 作为液相条件。
4.2 色谱条件方法学考察
色谱条件方法学考察的统计学计算，目前国内
学者常用统计学计算方法：①以共有峰的相对保留
时间、相对峰面积计算各指纹图谱的 RSD 考察精密
度、稳定性、重复性，要求 RSD 均＜5%[10]；②以
峰面积百分数＞5%的全部色谱峰的相对保留时间、
相对峰面积计算各指纹图谱的 RSD 考察精密度、稳
定性、重复性，要求 RSD 均＜5%[11]。
4.3 不同产地落花生茎叶的差异性
通过各种指纹图谱考察方法可以发现，天津与
河北所产落花生茎叶较为相近，与黑龙江、吉林等
产地的落花生茎叶有很大差异，除自然环境的差异
外，种植品种也有较大差异，如来自于黑龙江的落
花生样品为“小白沙”；吉林的样品则为吉林省的特
色品种“四粒红”；而天津与河北的落花生则大多数
为“中花”与“农花”；所以不同种植品种的落花生
茎叶有较大的成分差异。
4.4 指纹图谱相似度评价
通过对 10 批样品的指纹图谱分析表明，产地不
同的落花生茎叶 HPLC 指纹图谱有很大的差异，但
均具有相同的色谱峰。经相似度计算，发现其相似
度除 S8 外均在 0.9～1.0，也说明不同产地，不同采
收时间的落花生茎叶有一定的差异。
4.5 建立指纹图谱的意义
本实验建立的 HPLC 指纹图谱分析方法，能够使
落花生茎叶的共有成分在色谱图中体现，所建立的指
纹图谱具有较好的稳定性与可控性，可用于落花生茎
叶的质量控制，为其进一步作为新药开发奠定基础。
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