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大鼠在体肠吸收穿心莲内酯的特征研究
叶 　玲 ,刘 　薇 ,唐 　斓 ,夏笔军 ,龚 　耘 ,刘中秋 3
(南方医科大学药学院 ,广东 广州 　510515)
摘　要 :目的 　为探讨穿心莲内酯生物利用度低的原因 ,考察穿心莲内酯肠道吸收特性 ,肝肠循环和肠道酶代谢特
点。方法 　采用大鼠在体肠灌流模型。运用 HPLC 法测定肠灌流液、胆汁以及经肠道酶降解后样品中穿心莲内酯
的量。结果 　穿心莲内酯在不同肠段的吸收率 ,以十二指肠最高 ,达 40 % ,而在结肠最低 ,仅有 10 %。穿心莲内酯
在十二指肠灌流液中的生物降解最显著 (1 h 降解约 50 %) ,在回肠、结肠中则几乎无降解反应。穿心莲内酯有胆
汁排泄 ,其排泄量为灌流药物总量的 0176 %。结论 　穿心莲内酯在大鼠肠道的吸收较差 ,而在十二指肠中吸收表
现较好是由于存在较强的肠道酶代谢作用。同时 ,穿心莲内酯存在明显的肝肠循环。穿心莲内酯生物利用度低的
原因与肠吸收差、肠道酶代谢作用强和肝肠循环有关。
关键词 :穿心莲内酯 ;大鼠在体肠灌流 ;肠道酶 ;吸收
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0219 04
Absorption characteristics of andrographolide in rat intestine in situ
YE Ling , L IU Wei , TAN G Lan , XIA Bi2jun , GON G Yun , L IU Zhong2qiu
(School of Pharmaceutical Sciences , Southern Medical University , Guangzhou 510515 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he causes of poor bioavailability of andrograp holide , t he absorp2
tion characteristics , hepatic2enteric recycling , and metabolism of andrograp holide in rat intestines were ob2
served1 Methods 　A single2pass“four2site”rat intestinal perf usion model i n si t u was employed1 The con2
cent ration of andrograp holide in perf usates , bile , and i n vi t ro incubation samples for metabolites of an2
drograp holide by the intestinal enzymes , respectively , was determined by HPL C1 Results 　In the perf u2
sion model , maximal absorption of andrograp holide occurred in t he duodenum wit h a 40 % absorption rate ,
whereas only 10 % of andrograp holide was absorbed in t he colon1 Moreover , andrograp holide was rapidly
hydrolyzed (about 50 % in 1 h) in the duodenum perf usates but was not hydrolyzed at all in t he colon and
ileum perf usates1 On t he other hand , andrograp holide was excreted by bile wit h a total of 3104 % pref used
amount of andrograp holide1 Conclusion 　The poor absorption , rapidly hydrolysis , and hepatic2enteric re2
cycling in the intestine all cont ribute to t he poor bioavailability of andrograp holide1
Key words : andrograp holide ; t he rat intestinal perf usion i n si t u ; intestinal enzymes ; absorption
·912·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009204212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家“十一五”支撑计划项目 (2006BAI11B08204) ;广东省高等学校自然科学研究重点项目 (06Z008) ;广州市科学技术局应用
基础项目 (2007J I2C0021)
作者简介 :叶　玲 (1984 —) , 女 , 广东阳春人 ,2007 级博士研究生 ,从事药物吸收与代谢研究。
Tel : (020) 61648597 　E2mail :lotus623 @1261com3 通讯作者　刘中秋　Tel : (020) 61648596 　E2mail :liuzq @fimmu1com
　　穿心莲为爵床科植物穿心莲 A n d rog ra p his
p anicul at a (B urm1f1 ) Nees 的干燥地上部分 ,具有
清热解毒、凉血、消肿、抗菌等作用[ 1 ] 。穿心莲叶中
主要含二萜类内酯化合物 ,其中穿心莲内酯的量最
高。穿心莲内酯亦是穿心莲的活性成分之一 ,具有
利胆、消炎等作用[1 ] 。但穿心莲内酯水溶性差 ,体外
溶出慢 ,导致体内吸收差 ,从而引起生物利用度
低[2～4 ] 。为探讨穿心莲内酯肠吸收特征以及影响其
生物利用度低的生物学因素 ,本实验采用大鼠肠灌
流模型研究了穿心莲内酯在不同肠段的吸收特点、
肝肠循环行为以及肠道酶的代谢作用。
1 　仪器与材料
安捷伦 HP1200 型高效液相色谱仪和可变波长
检测器 (美国) ;十万分之一电子分析天平 (德国赛多
利斯) ; 冷冻高速离心机 (德国 Eppendorf ) ;多通道
注射泵 (美国哈佛仪器公司) ;p H 计 (德国梅特勒2托
利多) ;纯水蒸馏器 (美国 Millpore 公司) 。
穿心莲对照品 (南京替斯艾么中药研究所 ,批号
TCM0052080316 ,质量分数 98 %以上) ;睾丸酮 (日
本东京 Nacalai Tesque 公司 ,批号 32811261 ,质量
分数 98 %以上) ; HBSS ( Hanks’ Balanced Salt s) 缓
冲盐粉末 (美国 Sigma 公司) ;甲醇等均为分析纯。
Sprague2Dawley (SD) 大鼠 ,雄性 ,由南方医科
大学动物实验中心提供 ,合格证 : SCXK (粤) 20062
0015。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 :色谱柱为 Alltima C18 (250 mm ×
416 mm ,5μm) ;流动相乙腈 (A)2水 (B) ;梯度洗脱 ,
0～6 min ,A 相从 5 %变成 20 % ,6～7 min ,A 相从
20 %变成 35 % ,7～15 min ,A 相维持 35 % ,15～16
min ,A 相从 35 %变成 60 % ;体积流量 :1 mL/ min ;
进样体积 :200μL ;检测波长为 225 nm。以睾丸酮
为内标物 , H PL C 色谱峰见图 1。
212 　贮备液的制备 :精密称取穿心莲内酯对照品
a2穿心莲内酯　b2睾丸酮
a2andrographolide 　b2testosterone
图 1 　对照品( A) 、样品( B)及阴性样品( C)的 HPLC色谱图
Fig11 　HPLC Chromatograms of reference substance ( A) , sample ( B) , and negative sample ( C)
22141 mg ,定容于 4 mL 乙醇中 ,得 16 mmol/ L 穿
心莲内酯贮备溶液。
213 　HBSS 溶液配制 :称取 HBSS 粉末 918 g ,溶于
蒸馏水中 ,制成 1 000 mL ,备用。
214 　标准曲线的绘制 :精密吸取不同体积穿心莲内
酯贮备溶液 ,用 HBSS 溶液 (p H 615) 稀释定容 ,再
分别加入睾丸酮甲醇溶液 (内标液) ,得浓度为 4、8、
16、32、64、128μmol/ L 系列对照品溶液 ,进样测定 ,
记录峰面积。以穿心莲内酯与内标睾丸酮峰面积之
比对浓度进行回归 ,得回归方程 A = 010318 C +
01002 8 ( r = 01999 8) 。表明穿心莲内酯在 4～128
μmol/ L 线性关系良好。
215 　精密度试验 :配制含穿心莲内酯 4、32、128
μmol/ L 灌流液样品 ,测定 5 次 ,计算日内和日间
RSD ,见表 1。
216 　回收率试验 :精密吸取穿心莲内酯贮备溶液 ,
表 1 　穿心莲内酯日内日间精密度
Table 1 　Precision of andrographolide in inter2 and intra2day ( x ±s , n = 5)
加入量/
(μmol ·L - 1)
日内
测得值/ (μmol ·L - 1) 精密度/ % RSD/ %
日间
测得值/ (μmol ·L - 1) 精密度/ % RSD/ %
4 　　 3177 ±0109 941 25 21 43 41 14 ±01 06 103150 61 2
32 　　 33105 ±0116 1031 28 01 48 321 43 ±01 40 101134 31 7
128 　　 128134 ±1128 1001 27 01 10 1301 48 ±31 79 101194 21 9
用空白 HBSS 缓冲液稀释成 4、32、128μmol/ L ,进
行测定 5 次 ,将所得的峰面积比代入回归方程计算
浓度 ,以所得浓度与实际浓度的比值作为相对回收
率 ,结果见表 2。
217 　大鼠在体灌流试验 :精密称取一定体积穿心莲
内酯对照品储备液贮备液 ,用 HBSS 溶液 (p H 615)
·022· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
表 2 　穿心莲内酯的回收率( x ±s , n = 5)
Table 2 　Recovery of andrographolide ( x ±s , n = 5)
浓度/ (μmol ·L - 1) 回收率/ % RSD/ %
4 　　　　 941 25 ±2139 　　 21 43
32 　　　　 1031 27 ±0150 　　 01 49
128 　　　　 1001 27 ±1100 　　 01 49
稀释定容 ,得浓度为 80μmol/ L 灌流液 ,备用。术前
大鼠禁食 16 h ,自由饮水 ,腹腔注射乌拉坦溶液麻醉 ,
固定麻醉动物 ,置于小电热毯上 ,保持正常的体温。
沿腹中线切口 4 cm 打开腹腔 ,靠近十二指肠处插入
胆汁导管 ,分别在十二指肠、空肠、回肠和结肠两端
插聚乙烯管 ,用无菌的手术线固定 ,实验时用等渗生
理盐水浸渍的纱布覆盖肠组织表面以保湿 ,用等渗生
理盐水冲洗肠内容物后换灌流液 ,用一恒速多通道注
射泵灌流肠腔 ,灌流速度为 0125 mL/ min ,平衡 30
min 后 ,每隔 30 min 收集出口管中灌流液 ,灌注前收
集一次胆汁和血浆样品 ,随后每隔 30 min 收集一份。
实验共收集 4 次流出液 ,实验结束后 ,测量肠段长度。
出口管中药物浓度 HPLC 检测 ;胆汁样品用缓冲液
按 1 ∶4 稀释 , HPLC检测[5～7 ] 。
大鼠肠灌流实验中 ,收集各肠段流出液的同时 ,
设空白管 ,收集空白灌流液 ,精确称重 ,以校正水分
变化对结果的影响。分别在十二指肠、空肠、回肠和
结肠 4 个肠段回流 ,考察穿心莲内酯在大鼠各肠段
的吸收率 ,计算肠段吸收量 ( Mab )和吸收率。
Mab = Qτ( CA in - CAout )
吸收率 = Mab / M原 ×100 %
Mab为穿心莲内酯的吸收量 , M原 为灌流前溶液 , Q 为灌
流的速度 ,τ单一样品收集的时间段 (30 min) , CA in为进口溶
液的浓度 (μmol/ L) , CAout为出口溶液的浓度 (μmol/ L)
两组间数据的比较采用单向方差分析 ,结果见
表 3。
表 3 　大鼠在不同 4 段肠道的穿心莲内酯吸收率
( x ±s , n = 4)
Table 3 　Absorption rate of andrographolide in various
four intestinal segments in rats ( x ±s , n = 4)
肠　段 吸收率/ %
十二指肠 42196 ±5174
空肠　　 24168 ±6169
回肠　　 10159 ±4109
结肠　　 9117 ±4132
　　可知不同肠段药物的吸收率按十二指肠、空肠 ,
回肠和结肠依次下降。十二指肠的吸收率为 42 % ,
分别与空肠、回肠、结肠的吸收率两两比较均具有显
著性差异 ( P < 0105) ,空肠分别与回肠和结肠段相
比 ,也有明显差异 ( P < 0105) ,回肠和结肠段相比 ,
不具有显著性差异 ( P > 0105) ,在结肠中吸收率最
低 ,仅为 10 %。结果表明 ,穿心莲内酯在十二指肠
的吸收最好 ,其次为空肠 ;在回肠和结肠吸收较差。
218 　胆汁中穿心莲内酯的测定 :用 80μmol/ L 穿
心莲内酯灌流液对大鼠肠段进行灌流后 ,采用
HPL C 法在胆汁中能检测出穿心莲内酯。在不同时
间点的胆汁样品中检测穿心莲内酯的结果见图 2。
可见在灌流过程中 ,穿心莲内酯进入胆汁的量逐渐
增加 ,在 60 min 时达到平衡 ,计算可知 ,进入胆汁的
总量占灌流总量的 0176 %。
图 2 　不同时间在胆汁中检测出的穿心莲内酯
Fig12 　Contents of andrographolide in bile
at different times
219 　穿心莲内酯在不同 p H 值肠循环液中稳定性
考察 :分别用稀盐酸和稀氢氧化钠调节 80μmol/ L
供试液的 p H 值为 510、615、714、910 ,在相同实验
条件下不经肠段直接循环 ,分别于 0、1、2、4、6、8 h
取样 ,测定穿心莲内酯在循环液中的浓度变化 ,见表
4。结果表明穿心莲内酯在不同 p H 值的肠灌流液
中 8 h 内浓度没有变化。
2110 　穿心莲内酯在含肠道酶肠循环液中稳定性考
察 :分别取空白灌流液 60 mL 对大鼠各肠段循环灌
流 1 h ,流速为 1 mL/ min ,用此溶液配制 80μmol/ L
穿心莲内酯 ,密闭容器 ,置 37 ℃水浴中 ,分别于 0、
1、2、4、6、8 h 取样 ,测定穿心莲内酯在循环液中的
变化 ,结果见表 4。可见肠道酶对穿心莲内酯有水
解作用 ,其中十二指肠和空肠酶的水解作用较强。
特别是在十二指肠中 ,1 h 内穿心莲内酯被水解了
约 50 % ,8 h 内几乎完全被水解 ;空肠中 ,8 h 内被水
解了约 50 %。而在回肠和结肠中 ,肠道酶对穿心莲
同内酯的水解作用较弱 ,8 h 内几乎无水解作用。
3 　讨论
研究药物胃肠道吸收的实验方法大致可分为体
外试验法、在体试验法和体内试验法[8 ] 。药物的吸
收行为与特征常采用动物实验特别的大小鼠进行预
测 ,其大鼠吸收行为与人体吸收行为的相关性已被
·122·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
表 4 　穿心莲内酯在不同 pH值的灌流液中的稳定性( x ±s , n = 3)
Table 4 　Stabil ity of andrographolide in solution of intestinal perfusates at different pH values ( x ±s , n = 3)
p H 值
各时间点穿心莲/ (μmol ·L - 1)
0 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h
510 80 811 09 ±1131 781 97 ±21 34 79148 ±21 57 771 89 ±1158 771 24 ±21 30
615 80 791 58 ±1128 801 58 ±11 23 78156 ±11 25 791 57 ±2137 771 74 ±11 52
714 80 801 16 ±2157 791 48 ±21 56 78197 ±21 39 771 89 ±1158 781 26 ±11 38
910 80 821 88 ±1151 811 31 ±21 25 79154 ±11 32 781 56 ±1100 791 22 ±21 32
表 5 　穿心莲内酯在含肠道酶循环液中的稳定性( x ±s , n = 3)
Table 5 　Stabil ity of andrographolide in solution of intestinal perfusates containing intestinal enzymes ( x ±s , n = 3)
肠　段
各时间点穿心莲/ (μmol ·L - 1)
0 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h
十二指肠 80 391 54 ±0215 261 31 ±01 35 13178 ±01 15 9192 ±01 19 21 98 ±0132
空肠　　 80 621 13 ±0181 551 39 ±11 32 47165 ±01 05 441 70 ±0147 431 96 ±01 25
回肠　　 80 771 89 ±1111 771 51 ±01 93 76126 ±11 53 751 89 ±0165 751 43 ±11 98
结肠　　 80 791 19 ±1148 771 45 ±01 68 75181 ±01 71 751 45 ±2127 751 06 ±01 29
文献所证实[9 ] ,其实验结果可外推动至人。在体大
鼠肠灌流实验能较好的保持大鼠的正常生理状态 ,
保持肠道中的代谢酶 ,是一种研究药物吸收的常用
方法。采用 4 段肠同时灌流法 ,可较准确的预测药
物在不同肠段的吸收特征 ,能为研究肠道给药系统
提供依据。
穿心莲内酯的溶解性差 ,亲水性弱 ,导致了其生
物利用度低[2 ,3 ] 。本实验采用在体大鼠肠灌模型研
究了穿心莲内酯的肠道吸收行为与特征。结果表
明 ,穿心莲内酯主要在十二指肠和空肠吸收 ,而在回
肠与结肠则吸收较少 ,但总的吸收量均不高。同时 ,
十二指肠和回肠段的肠道酶对穿心莲的水解作用较
强 ,而在结肠与回肠则较弱 ,该结果说明 ,肠道细菌
对穿心莲内酯的水解作用较弱 ,因为肠道菌主要含
在结肠道中[ 5 ,7 ] 。因此 ,可推测穿心莲内酯的生物
利用度主要是由于肠道吸收和肠道代谢酶的作用。
在该肠灌流模型中 ,笔者试验了穿心莲内酯的
肝肠循环 ,结果显示在胆汁中能检测到穿心莲内酯 ,
说明它存在肝肠循环 ,即穿心莲内酯能被胆汁排回
到肠腔 ,再经肠腔吸收 ,而形成肝肠循环。肝肠循环
也是穿心莲内酯生物利用度低的另一原因。
　　因此 ,本实验结果提示穿心莲内酯肠道的吸收
较差 ,而在十二指肠中吸收表现较好是由于存在较
强的肠道酶代谢作用。同时 ,穿心莲内酯存在明显
的肝肠循环。穿心莲内酯生物利用度低的原因与肠
吸收差、肠道酶代谢作用强和肝肠循环有关。
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