全 文 ：人参种源遗传关系的 ISSR分析
许永华1 ,张爱华1 ,金 慧2 , 方景焕3 , 金永昌3 ,张连学1*
( 1 吉林农业大学中药材学院, 吉林 长春 130118; 2 吉林人参研究院,吉林 通化 134001;
3 韩国国家园艺科学院人参特作部, 阴城 忠清北道 369-871 韩国)
摘 要:目的 阐明不同种源人参的遗传关系。方法 用 ISSR 分子标记研究来自人参主要分布区 17 个种源样
本。结果 从 100个 ISSR 引物中筛选出 10个条带清晰、多态性高的引物, 共扩增出 95 条带, 其中 80 条带为多态
性位点, 多态性条带比率( PPB)为 84 21% ,通过聚类分析,可将 17个人参种源聚为 4 类。结论 分子标记研究结
果与人参的形态性状存在显著的相关性,较好地揭示了人参种源间的遗传关系, 可为人参资源保育和良种选育提
供科学依据。
关键词:人参; 种源;遗传关系; ISSR
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1164-04
Genetic relationship analysis of ginseng by ISSR analysis
XU Yong-hua1 , ZHANG A-i hua1 , JIN Hui2 , BANG Kyong-Hwan3 ,
KIM Young-chang
3
, ZHANG Lian-xue
1
( 1 Collag e of Chinese Medicinal Mat erials, Jilin Ag ricultural U niversit y, Changchun 130118, China; 2 Jilin Institute
of G inseng Resear ch, Tonghua 134001, China; 3 Department of H erbal Crop Resea rch, National Institut e
o f H ort icultural Herbal Science, Eumseong Chungcheongbuk-do 369-873, Ko rea)
Abstract: Objective T o study the genet ic polymorphism and genet ic relat ionship of different resour ce
of ginseng Methods Genetic relat ionship in 17 accessions w hich came from dif ferent o rigins w as meas-
ured by using po lymerase chain r eact ion ( PCR) w ith ISSR marker Results T en ISSR primers w ere se-
lected f rom 50 ISSR primers and used fo r ISSR amplif ication A total of 95 bands w ere gener ated, o f w hich
80 bands w ere po lymor phic bands ( the percentag e o f polymorphic band, PPB= 84 21% ) Seventeen germ-
plasms o f g inseng w ere cluster ed to four Conclusion The similarity coef f icients are calculated w ith NTsys
2 10e sof tw ar e and the dendrog ram is const ructed w ith UPGMA for pro viding a scientif ic basis on genetic
breeding, dif ferent iation, and new cult ivar selection
Key words: ginseng; germplasm ; g enet ic relat ionship; ISSR
人参 Panax ginseng CAMeyer 系五加科
( Araliaceae)多年生植物,另名棒捶,是名贵中药, 有
百草之王的美誉, 是应用最广泛、研究最深入的中
药之一[ 1]。神农本草经按药物功效分类为上品、
中品、下品,人参属中药之上品, 它的突出功效是滋
补、强壮、益智和轻身延年 [ 2]。人参刺激身体的合成
代谢、增加人体对恶劣环境或有害因子的适应性和
抵抗力以及抗疲劳、解毒等作用 [ 3] ,还具有改善勃起
功能障碍的效果 [ 4]。栽培人参是由野生人参驯化来
的混合群体,在我国栽培历史悠久,早在清代就进行
大规模种植[ 1] 。目前,世界上栽培人参的国家主要
有中国、韩国、日本、朝鲜及俄罗斯,以我国的人参产
量最多。我国人参主要产区为东北三省, 其中以吉
林省为人参主产地, 占我国人参产量的 80%以上。
这些栽培人参群体, 经过千百年来生态环境和生产
者的长期选择,使不同产地的栽培人参群体出现了
一些遗传分化 [ 5]。马小军等 [ 6, 7] 应用 RA PD 和
AFLP等方法对我国野山参与栽培参、栽培参不同
栽培群体、不同农家类型间的遗传关系进行了系统
的研究;邵爱娟等 [ 8]用 RAPD法分析了我国人参农
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* 收稿日期: 2009- 10-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30570187)作者简介:许永华( 1966 ) ,男,吉林通化人,博士研究生,研究方向为药用植物栽培加工。
T el: 13756943327 E-mail: xuyongh ua777@ yeah net
* 通讯作者 张连学 T el: ( 0431) 84532952 E- mail : zlxb ook sea@ 163 com
家类型大马牙和二马牙不同品系的遗传关系; 李靖
等[ 9]用 ISSR法分析了人参农家类型的遗传多样性
和亲缘关系。而对不同国家的人参品种和农家类型
的遗传变异尚缺乏深入研究。
简单序列重复区间( ISSR)标记技术是一种新型
的微卫星类分子标记技术,具有稳定性好、多态性高、
实验操作简单、快速等特点,而且 ISSR标记可以揭示
整个基因组的部分特征,不受季节、环境等外在因素
的影响,并呈孟德尔式遗传[ 10] 。因此,该技术一问世
就被广泛应用于植物遗传作图与基因定位、种质资源
鉴定、植物分类、进化及遗传多样性研究[ 11]。
本研究用 ISSR 分子标记对来自于韩国、朝鲜
和我国的 16份人参品种及 1 份农家品种人参属西
洋参 P quinquef ol ium L 进行亲缘关系分析, 探
索利用 ISSR分子标记研究供试栽培品种的分类和
系统发育的可行性, 以期为全面了解人参品种的亲
缘关系及构建指纹图谱提供技术支持, 同时也为人
参资源的开发利用及新品种的选育提供科学依据。
1 材料与方法
1 1 材料: 供试材料中 1~ 9 号和 11号为新鲜嫩
叶,分别采自黑龙江、吉林、辽宁等 3省, 12 号为山
参(水参) , 10号和 13~ 17号为干人参根,分别购于
朝鲜和韩国(表 1) ,除 11号样品为五加科人参属西
洋参外,其他均为人参属人参。ISSR引物参考加拿
大英属哥伦比亚大学提供的引物序列, 由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成。
表 1 人参种源的来源和性状
Table 1 Sources and characteristics of ginseng germplasm
编号 名 称 采集地 性 状
1 福星(品种) 抚松 根茎短, 根主体短,人参产量高
2 宝泉(品种) 长白 根茎短, 根主体短,人参产量高
3 大马牙 抚松 根茎短, 根主体短,须根多, 产量高
4 二马牙 集安 根茎适中, 根主体长,人参主体致密
5 集美(品种) 集安 根茎适中, 根主体长,人参致密
6 边条 集安 根茎适中, 根主体长,人参致密, 参型秀气
7 圆膀园芦 集安 根茎长, 根茎圆柱型,根主体上端球型
8 石柱 宽甸 根茎长, 主体小,抗性强
9 长脖 集安 根茎长, 主体小,抗性强
10 高丽参 朝鲜 根茎短, 主体短
11 西洋参 靖宇 根茎短, 主体短
12 山参 集安 根茎长, 主体短,须根长
13 天丰(品种) 韩国 紫茎, 叶柄具有黑色斑点,果熟期较晚
14 仙丰(品种) 韩国 质量好, 抗地上部病害
15 年丰(品种) 韩国 茎矮, 双茎多,根主体短粗
16 金丰(品种) 韩国 结实率高
17 高丰(品种) 韩国 茎矮, 浓绿色
1 2 DNA 的提取与纯化:采用改良 CT AB法[ 12] 提
取 DNA。在液氮条件下把材料迅速研磨成粉末, 将
粉末放入 50 mL 的离心管中,然后加入缓冲液 22 5
mL,充分混匀。将离心管置于 65 水浴锅中,水浴
1 0~ 1 5 h,离心 20 m in;将上清液小心转移至新离
心管中, 加入等体积预冷异丙醇, 缓慢混匀, 挑出
DNA 后,用 70%乙醇洗涤 DNA。将离心管置于室
温使其干燥, 加入适量 1 TE 溶解 DNA 进行纯化
后,在- 20 下保存备用。
1 3 ISSR扩增与检测:从加拿大 Brit ish-Co lumbia
大学生物技术实验室提供的 100 条引物中选择了
50条,引物由上海生工生物工程有限公司合成,经 3
个模板对 50个引物进行初选和复选,结果从中选取
了多态性较好的 10条引物进行后续试验。
1 4 ISSR反应体系及程序: 反应体系为 25 L,其
中模板 DNA 60 ng , 引物 5 mo l/ L 1 0 L, 10
PCR缓冲液 2 5 L, 10 mol/ L dNT Ps 0 5 L, Taq
酶 1 U , ddH 2O 补足, 另加石蜡油覆盖。10 PCR
缓冲液, MgCl2 , T aq 酶, dNT Ps, 均购自天根生化科
技公司。反应程序为: 94 预变性 5 min; 94 变
性 30 s, 52 退火 1 min, 72 延伸 2 min, 循环 47
次; 72 延伸10 min, 4 下保存。在PTC-2000型
PCR仪上扩增。
1 5 PCR产物凝胶电泳: 扩增产物采用 6%变性的
聚丙烯酰胺凝胶检测。扩增样品中加入 4 5 L 的
Loading buf fer ( 0 25% 溴酚蓝、0 25% 二甲苯青
FF、30%甘油水溶液) ,恒功率 80 W, 电泳 2 h左右,
银染检测。
1 6 数据统计与分析:同一引物,同一位点,根据扩
增产物的有( 1)无( 0)得到二元资料, 形成 0, 1矩阵。
用 NT SYS-pc 2 10软件进行分析,计算遗传相似系
数,运用 U PMGA 法构建树状聚类图。
2 结果与分析
2 1 基因组 DNA结果检测与分析:获取高质量的
基因组 DNA 是试验成功的关键步骤之一。采用
CTAB 法从材料中提取模板 DNA,所提取 DNA 的
A 260 / A 280在 1 80~ 1 90, 其浓度、纯度均符合实验
要求。
2 2 ISSR引物筛选分析:随机用 3个样品对 50个
引物进行筛选,结果有较多引物都有扩增, 每个引物
可扩增出 1~ 17条带不等; 再次对条带清晰、主带明
显的初筛引物进行筛选, 最终选用的 10个引物, 反
应稳定、扩增性强和重复性好,见表 2。
2 3 ISSR多态性分析:筛选出的 10个引物共检测
到 95条带,平均每条引物扩增出 9 5条带, ISSR扩
增片段大约集中在 100~ 2 000 bp。其中 80条带表
现为多态性, 占总的 84 21%, 每个引物检测到的多
1165中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
态性条带约有 8 42条。扩增出条带最多的引物为
842, 共 17条; 条带最少的是引物 818; 多态性最高
的是引物 807 和 815, 多态率高达 100% , 见表 2。
引物 873扩增的结果见图 1。
表 2 引物序列及其扩增结果
Table 2 Number of fragment amplified with ISSR
primers for 17 ginseng accessions
引物 序 列 总条带数
多态性带数
(人参种内多态)
多态
率/ %
807 A GAGAGAGAGAGAGAGT 8 8 100
815 A GAGAGAGAGAGAGAGG 8 8( 6) 100
818 CACACA CACACA CACAG 5 4 80
823 A CACACACACACACA CT 8 6( 3) 75
826 A CACACACACACACA CG 8 6( 5) 75
842 GA GAGAGAGAGAGAGAYG 17 16( 14) 94
856 CACACA CACACA CACARC 13 8 63
859 CACACA CACACA CACARG 6 5 83
861 A CCACCACCACCACC 6 5 83
873 A GCAGCAGCAGCAGC 16 14 88
2 4 遗传距离聚类分析:利用聚类分析软件 NT-
SYS-pc 2 10对 ISSR扩增所得的多态性位点进行
分析,得到人参 17份样品的遗传相似矩阵, 相似值
为 0 792时,可划分成 4大类,见图 2,第类有 1~
9号种源,第 类有 10号和 13~ 17 号种源,第 类
12号为山参,第类为 11号西洋参, 第类中再分
为 A 和 B类。A 为马牙类, B为长脖类。
M-D2000 1-福星 2-宝泉 3-大马牙 4-二马牙 5-集美
6-边条 7-圆膀园芦 8-石柱 9-长脖 10-高丽参 11-西洋参
12-山参 13-天丰 14-仙丰 15-连丰 16-金丰 17-高丰
M-D2000 1-Fuxin g 2-Baoqu an 3-Damaya 4-Ermaya
5-Jim ei 6-Biant iao 7-Yuanbangyuanlu 8-Shizhu
9-Changbo 10-Korea gin sen g 11-American ginseng
12-W ild gin sen g 13-Chunpoong 14-Sunpoong
15-Yunpoong 16-Gumpoong 17-Gopoog
图 1 引物 873 扩增结果
Fig 1 ISSR Amplification results of ginseng
with Primer 873
1-福星 2-宝泉 3-大马牙 4-二马牙 5-集美 6-边条 7-圆膀园芦 8-石柱 9-长脖 10-高丽参
11-西洋参 12-山参 13-天丰 14-仙丰 15-连丰 16-金丰 17-高丰
1-Fuxing 2- Baoquan 3-Dam aya 4-E rmaya 5- Jimei 6-Biant iao 7- Yuanb angyuanlu 8-Shizhu 9-Changbo 10- Korea
gin seng 11-American gin sen g 12-w ild ginseng 13-C hunpoong 14- Sunpoong 15-Yunpoong 16-Gum poon g 17-Gopoog
图 2 17 份人参材料 ISSR聚类结果
Fig 2 Dendrogram of 17 ginseng accessions based on ISSR marker
2 5 主成分分析: 在 N TSYS-pc 2 10软件上对不
同人参材料进行主成分分析, 第一、第二和第三的主
成分方差累积贡献率为 58 13%, 并根据主成分进
行作图,所形成的人参材料的位置分布如图 3所示。
在主成分 3-D散点图上, 位置靠近者表示其关系密
切,远离者表示其关系疏远。将位置靠近的材料划
归在一起,结果表明主成分分析的结果与 U PGMA
聚类分析结果基本一致,同一地区的大部分人参材
料聚在一起, 主成分分析结果更直观地表明了不同
人参材料之间的亲缘关系,是对聚类结果的直观解
释和佐证。
3 讨论
1166 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
1-福星 2-宝泉 3-大马牙 4-二马牙 5-集美 6-边条
7-圆膀园芦 8-石柱 9-长脖 10-高丽参 11-西洋参
12-山参 13-天丰 14-仙丰 15-连丰 16-金丰 17-高丰
1-Fuxing 2-Baoquan 3- Damaya 4-E rmaya 5- Jimei
6-Bian tiao 7-Yuanbangyuanlu 8-Shizhu 9- Changbo
10-Korea gin sen g 11-American ginseng
12-w ild ginseng 13-Chunpoong 14-Sunpoong
15-Yunpoong 16- Gum poon g 17-Gopoog
图 3 17份人参材料 ISSR主成分分析
Fig 3 PCA of 17 ginseng accessions based on ISSR marker
人参大部分分布于北温带, 主要在中国、韩国、
朝鲜、日本和俄罗斯。在我国则以东北为分布中心。
人参品种和农家类型是由野山参驯化后经人工选育
而得到,一般是根据其根的形态特征来划分的。目
前人参品种及农家类型已经形成了各自相对稳定的
性状特征。本研究结果表明, 人参品种及农家类型
存在明显的遗传差异,通过聚类分析和主成分分析,
西洋参与人参的相似系数最小( 0 560) , 山参与栽培
人参的相似系数为 0 648, 明显区分山参与栽培的
人参,与马小军的研究结果一致[ 1]。山参与栽培的
人参的相似系数甚小, 说明通过长期的人工栽培和
驯化,人工选择和自然选择使品种和农家类型的遗
传基因在野生种的基础上发生了较大的变化, 突显
了植物体的优良特性, 使外观特征及内在质量等遗
传性状稳定, 形成了优质的人参品种和农家类型。
供试 17 个种源在相似系数为 0 792 时可分为 4 大
类,原产于美洲的西洋参与产于亚洲的人参明显各
聚为一类, 在人参中产于中国的山参 12号与栽培的
人参间遗传距离显著,产于韩国栽培人参和朝鲜栽
培人参聚为一类, 其余的中国人参聚为一类,栽培的
人参遗传变异与地理分布存在显著的相关性,地理
位置接近的种源遗传性状较为接近。不同国家间很
少或基本上不进行种质资源交换, 影响本国内人参
遗传多样性, 影响人参新品种选育,所以需要进行国
际间人参种源交流以培育新的优良品种。从聚类分
析图中得出, 类为中国人参,其中 A 亚类中包括 1
~ 6号种源,是马牙类人参, B亚类包括 7~ 9号种
源,为长脖类(圆膀园芦,石柱参,长脖参) , 结果同马
小军等[ 1] RA PD 结果一致, 研究表明形态分类与
ISSR分子标记分类一致, 从芦头分类具有一定的科
学性。
结果表明,人参的亲缘关系虽然比较近,可是依
然能够通过分子标记技术进一步区分中国、朝鲜、韩
国的亲缘关系。说明 ISSR分子标记技术在鉴定物
种亲缘关系上有重要的应用价值。
综上所述, 该研究利用 ISSR 标记技术初步揭
示了人参主要品种与农家品种的亲缘关系,为进一
步对人参种源进行遗传多样性分析和人参育种奠定
了一定的理论基础。
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