全 文 ：药材与资源
绞股蓝RAPD标记及序列分析
周 娟,罗 育,吴耀生* ,李科志, 徐 鹏,赵瑞强
(广西医科大学 生物化学与分子生物学教研室, 广西 南宁 530021)
摘 要:目的 利用绞股蓝 RAPD标记有效鉴别绞股蓝及其伪品。方法 用 19 条引物对 17 个绞股蓝样品和一个
乌蔹莓样品进行 RAPDPCR 扩增 , 并对绞股蓝 DNA 特异条带克隆测序及序列分析。结果 获得一个绞股蓝
RAPD标记。经克隆测序, 8 个序列高度保守, 片段长度在 766~ 770 bp, 相似性均在 97% 以上。结论 获得的
RAPD标记可以作为合成探针的基础,用于鉴别绞股蓝及其伪品。
关键词:绞股蓝; RAPD标记; 序列分析
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10169205
Sequence analysis of RAPD markers related to Gynostemma pentaphyllum
ZHOU Juan, LU O Yu, WU Yaosheng, LI Kezhi, XU Peng, ZHAO Ruiqiang
( Department of Bio chemistr y and M olecular Biolo gy , Guangxi Medical Univer sity, Nanning 530021, China)
Abstract: Objective T he study is to ident ify the medicinal plant Gynostemma pentaphy llum and its
fake called Cay r at ia j ap onica through the RAPD markers Methods Nineteen random primers screened
w ere applied to amplifying the total DN A extracts of 18 samples w ith RAPD and the spect ific fr agments of
G p entaphy llum were analyzed by cloning and sequencing Results A RAPD marker of G p entaphy l
lum was acquired The result of sequence analy sis indicated that the length of eight sequences is 766- 770
bp and the ident ities o f them are over 97% Conclusion T he RAPD marker acquired could prov ide a basis
fo r making probe to dist inguish G p entaphy l lum and its spurious br eed
Key words: Gynostemma pentap hy l lum ( Thunb ) Markino; RAPD marker; sequence analysis
绞股蓝 Gynostemma pentaphy l lum ( T hunb )
Makino 为葫芦科绞股蓝属内分布最广、资源最丰富
的主要药用植物种类[ 1] 。具有抗肿瘤 [ 2]、调节脂代
谢[ 3]、抗衰老 [ 4]、增强免疫功能 [ 5] 等多种药理作用,
但由于其遗传背景混乱, 又易于与乌蔹莓 Cay ratia
j ap onica ( Benth ) Gagnep 混淆 [ 6] ,严重影响了临
床用药的安全性和加工产品的质量。笔者已获得了
可以区分绞股蓝及乌蔹莓新鲜样品的 RAPD 图谱。
但由于入药的胶股蓝是经过加工处理的干燥品,
DNA 模板有一定程度降解, 即使使用相同随机引
物,以干燥样品与新鲜样品作为模板也可能获得不
同的 RAPD图谱。绞股蓝的特异分子标记研究, 目
前除本课题组外国内尚未见有报道。本研究利用已
筛选出的 19条随机引物,对不同来源的 17份绞股
蓝干燥样品和 1 份乌蔹莓干燥样品进行 RAPD
PCR扩增,以期获得绞股蓝新鲜样品与干燥样品材
料均有的特异条带, 从而对特异条带进行克隆测序
及序列分析,完善利用 RAPD技术在分子水平上进
行药材鉴别[ 79] 。
1 材料与方法
1 1 材料: 26份实验材料中 18份为干燥样品, 8份
为新鲜样品。绞股蓝及乌蔹莓新鲜品均由广西药用
植物园凌征柱研究员、广西中医药研究院何开家研
究员鉴定。种质材料及来源见表 1。
1 2 试剂和仪器: T aqDNA 聚合酶、M109感受态
细胞、Xgal、IPT G、BamH I、H ind !均购自 T akara
宝生物工程有限公司; 10碱基随机引物均由上海生
工生物工程有限公司合成;十六烷基三甲基溴化铵
( CT AB)、乙二胺四乙酸 ( EDT A )、氯仿等均为国
产。PCR仪型号为T 1 Thermocycler( Bionetr a) ,
1692 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100523 基金项目:广西科学基金资助项目(桂科基 0731065) ;广西区教育厅硕士研究生科研创新项目( 2008105981001M 228)作者简介:周 娟( 1982 ∀ ) ,女,硕士,研究方向为药用植物分子生物学。 Email: zhou juan 1213@ 163 com
* 通讯作者 吴耀生 T el: ( 0771) 5358817 Email: w uyaoshen g03@ sina com
表 1 26 份材料的来源及分类
Table 1 Ttwertysix materials used for RAPD and their origins
编号 样 品 采集地或购买地 产 地 采集或购买时间 备 注
JG1 绞股蓝 广西药用植物园 广西南宁 200706 烘干样品
JG2 绞股蓝 广西南宁水街药材铺 广西金秀 200706 商品药材
JG3 绞股蓝 广西药用植物园 广西南宁 200706 烘干样品
JG4 绞股蓝 广西金秀 广西金秀 200810 烘干样品
JG5 绞股蓝 广西金秀 广西金秀 200810 烘干样品
JG6 绞股蓝 广西药用植物园 广西南宁 200706 烘干样品
JG7 绞股蓝 广西大明山 广西大明山 200706 烘干样品
JG8 绞股蓝 广西金秀 广西金秀 200810 烘干样品
JG9 绞股蓝 购于广西南宁药店 陕西 200706 绞股蓝茶叶
JG10 绞股蓝 贵州 贵州 200812 商品药材
JG11 绞股蓝 湖南 湖南 200807 商品药材
JG12 绞股蓝 购于广西南宁药店 湖南常德 200706 绞股蓝茶叶
JG13 绞股蓝 广西医科大学校园 广西南宁 200706 烘干样品
JG14 绞股蓝 广西桂林药材批发站 广西桂林 200706 商品药材
JG15 绞股蓝 广西南宁淡村农贸市场药材铺 广西荔浦 200706 商品药材
JG16 绞股蓝 广西南宁淡村农贸市场药材铺 广西扶绥 200706 商品药材
JG17 绞股蓝 广西南宁水街药材铺 广西靖西 200706 商品药材
W 乌蔹莓 广西凌云 广西凌云 200706 烘干样品
J1 绞股蓝 广西药用植物园 广西南宁 200706 新鲜样品
J2 绞股蓝 广西凌云 广西凌云 200706 新鲜样品
J3 绞股蓝 广西药用植物园 广西南宁 200706 新鲜样品
J4 绞股蓝 广西金秀 广西金秀 200810 新鲜样品
J5 绞股蓝 广西金秀 广西金秀 200810 新鲜样品
J6 绞股蓝 广西药用植物园 广西南宁 200706 新鲜样品
J7 绞股蓝 广西大明山 广西大明山 200706 新鲜样品
J8 绞股蓝 广西金秀 广西金秀 200810 新鲜样品
凝胶成像系统为 UVI ∀ 7600Z 型。Smart specTM
plus核酸蛋白测定仪( BIORAD Lab, Inc, USA )
TGLL218K 台式高速冷冻离心机(太仓市华美生化
仪器厂)。
1 3 方法
1 3 1 总 DNA 提取: 采用改良的 CTAB 法 [ 10] 分
别提取绞股蓝和乌蔹莓新鲜样品 DNA 及干燥样品
DNA。1 5%琼脂糖凝胶电泳检测所得 DNA。用
核酸蛋白测定仪测 260、280 nm 波长处吸光值( A ) ,
得到 A 260 , A 280 , A 260 / A 280及稀释后 DNA 浓度, 并确
定提取总 DNA 的纯度和浓度。
1 3 2 引物:在前期实验中以 8份不同种质的绞股
蓝新鲜样品为材料, 筛选出 19 条适合于绞股蓝
RAPD分析的随机引物。
133 RAPD扩增体系: 使用 25 L 反应体系和优
化的扩增程序, 即 10 # Buffer 2 5 L, 25 mmol/ L
Mg2+ 2L, 10 mol/ L 10碱基随机引物各 1 L, Ex
TaqDNA聚合酶 1 U,模板 DNA 60 ng 左右。RAPD
PCR扩增程序为: 94 ∃ 预变性 3 min,然后按 94 ∃ 变
性50 s, 37 ∃ 退火 50 s, 72 ∃ 延伸 120 s,进行40个循
环,最后 72 ∃ 延伸 10 min, 4 ∃ 保存待测。取 10 L
扩增产物,用 1 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1 3 4 克隆绞股蓝特异 DNA 条带的选择:选择 10
号引物扩增 17份绞股蓝干燥样品材料 RAPD图谱
中重复性好、迁移率相同的一条约 750 bp 的 DNA
片段进行克隆。在 17 份绞股蓝干燥样品中得到的
这条特异条带与 8份新鲜绞股蓝中得到的特异条带
片段电泳迁移率一致。而乌蔹莓新鲜样品及干燥样
品在相应电泳位置没有此条带。
1 3 5 绞股蓝特异 DNA 条带的克隆及测序:采用
8份新鲜绞股蓝为材料, 用 10 号引物扩增得到约
750 bp 的 DNA 片段。用胶回收试剂盒回收纯化,
将纯化后的 DNA 片段与 pMD18T Vector 载体连
接,转化 JM109感受态细胞, 通过蓝白筛选得到阳
性重组体,用质粒 DNA小量提取试剂盒提取质粒,
BamH %、H ind !双酶切鉴定。将阳性克隆送至北
京三博远志公司测序。
1 3 6 DNA 序列分析:使用Vecto r NTI 软件分析
测序结果。运用 NCBI 基因数据库中的 Blast程序
对绞股蓝特征条带进行同源性比对。
2 结果
21 19条随机引物干燥样品材料的RAPD扩增结果:
19条随机引物扩增 17份绞股蓝干燥样品得到的条带
相对分子质量集中在 200~ 2 000 bp,而新鲜样品扩增
1693中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
条带相对分子质量集中在500~ 3 000 bp,干品扩增条
带相对分子质量明显变小。干燥样品扩增条带数目
多,相对分子质量接近,电泳图谱呈梯形。其中 10号
引物在 17份绞股蓝干燥样品中扩增获得一条与 8份
绞股蓝新鲜样品位点一致的区别于乌蔹莓的特异条
带,相对分子质量分别约为 750 bp(图1~ 3)。
图 1 绞股蓝新鲜品 J1~ J8和乌蔹莓扩增结果
Fig 1 Amplif ication of wet samples of G pentaphyllum
J1- J8 and C j aponica
图 2 绞股蓝干品 JG1~ JG8 扩增结果
Fig 2 Amplif ication of dried samples
of G pentaphyllum JG1- JG8
图 3 绞股蓝干品 JG9~ JG17 和乌蔹莓扩增结果
Fig 3 Amplification of dried samples of G penta
phy llum JG9- JG17 and C j ap onica
2 2 阳性重组质粒的鉴定:阳性重组质粒经载体插
入位点两端的 BamH %和 H ind !限制性内切酶双
酶切,均得到相对分子质量大于2 000 bp 的质粒
DNA 和两个目的片段, 相对分子质量大小均为
500、270 bp(图 4)。这是由于克隆目的片段中含有
限制性内切酶位点。这两个片段相对分子质量和大
小与预期结果一致。经测序后证实, 克隆目的片段
中确定含有 H ind !限制性内切酶酶切位点。
图 4 8 个重组质粒酶切鉴定图
Fig 4 Identification of eight recombinants
2 3 8条绞股蓝特异 DNA 带序列一致性分析: 将
引物 10扩增绞股蓝新鲜样品 J1 得到约 750 bp的
特异 DNA 序列命名为 J1150, 其他 7 份绞股蓝新
鲜样品的特异 DNA 序列依次类推。8 条序列相似
性均在 97%以上, 属于高度保守序列。8条序列共
有 35个碱基位点不同,分布于不同部位。主要集中
于两个部分: 20~ 170碱基位点和 530~ 750 碱基位
点,可能是绞股蓝 DNA 的多态性区域(见图 5, 6)。
8条 DNA 序列的长度和一致性分析结果见表 2。
图 5 1~ 8号序列碱基位点 100~ 145 的比对结果
( Vector NTI)
Fig 5 Alignment of base sits 100- 145 of sequences
1- 8 by Vector NITI
图 6 1~ 8号序列碱基位点 525~ 563 的比对结果
( Vector NTI)
Fig 6 Alignment of base sits 525- 563 of sequences
1- 8 by Vector NTI
1694 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
表 2 8 条绞股蓝序列长度及一致性比较
Table 2 Length and consistency comparison of eight sequences of G pentaphy llum
条带长
度/ b p
绞股蓝特异
DNA 带编号 J1750 J2750 J3750 J4750 J5750 J6750 J7750 J8750
769 J1750 100 0%
766 J2750 97 7% 100 0%
768 J3750 99 3% 98 0% 100 0%
767 J4750 98 6% 98 2% 99 0% 100 0%
770 J5750 98 3% 97 4% 98 4% 98 8% 100 0%
769 J6750 99 9% 97 8% 98 7% 98 4% 100 0%
766 J7750 98 3% 97 8% 99 2% 98 6% 98 4% 100 0%
769 J8750 98 1% 97 5% 98 4% 99 0% 98 3% 98 2% 98 8% 100 0%
2 4 8条绞股蓝特征带序列生物信息学分析: 8 条
绞股蓝特异 DNA 序列经 Blastn 分析, 结果显示 8
条序列与 99个来自其他物种的基因序列有部分相
似性,但相似位点片段在 40~ 90 bp,整体同源性较
小(图 7)。将这 8条序列提交到 NCBI 进行开放阅
读框架 ORF 的识别, 结果显示,这 8条序列有两种
相同的可能的编码区域, 分别编码 48 和 45个氨基
酸。这两个 ORF 区, 是否编码蛋白及有何功能还
有待进一步的研究。该 8条序列含有大量 A 和 T ,
A和 T 的量约为 68%。经酶切位点分析, 8条序列
均含有 11 种内切酶的酶切位点, 其中序列 J1750、
J6750有一个 Ssp %酶切位点, J3750、J4750、J5
750、J7750、J8750 有 2 个 Ssp %酶切位点, J2750
有 3个 Ssp %酶切位点,其他 10种内切酶在 8条序
列的酶切位点均为单一酶切位点(表 3)。
3 讨论
本研究在前期工作的基础上, 利用筛选出的
19对RAPD随机引物对绞股蓝干燥样品进行扩增,
获得一条绞股蓝新鲜样品和干燥样品共有的约
图 7 序列 J1750 与 GenBank中已知 DNA序列比对
得到的相似片段分布
Fig 7 Distribution of similar fragment aligning
J1750 with GenBank&s sequences
表 3 8 条绞股蓝序列酶切位点分析
Table 3 Restriction site analysis of eight sequences
of G pentaphy llum
内切酶 酶切位点序列
Ac c65% G/ GTACC
Aha! T TT / AAA
A sp 718I G/ GTACC
Bbv ∋ GAAGACNN/
Bcl % T / GATCA
Bsc91I GAAGACNN/
DraI T TT / AAA
H ind! A/ AGCT T
K p n% GGTAC/ C
S sp % AAT / ATT
Vsp % AT / TAAT
750 bp 的特异条带, 而乌蔹莓没有扩增出此条带。
将得到的 8个克隆测序后,发现这是一段高度保守
的序列。通过NCBI中 Blast比对,未发现同源性较
高的序列, 说明这是一段新发现的 DNA 序列。该
段序列含有 11种酶切位点,根据其分布位点可选用
内切酶 A cc65 %、A sp718%中的任何一种与 Bbv ∋
或者与 B sc91%进行双酶切可将该标记两端随机引
物结合的部分切除后制为探针, 可以减轻杂交背景,
提高检测效率。也可选取合适的限制性内切酶, 对
该扩增产物进行酶切,获取 Cleaved amplif ied poly
mor phic sequence ( CAPs)分子标记。CAPs是一种
以 PCR为基础的分子标记(又称为 PCRRFLP)。
CAPs更为稳定可靠、快速有效, 并且对基因染色体
的变化尤其是单核苷酸变异更为灵敏 [ 11]。
汪小全[ 12] 等报道, 从干样品中提取的 DNA 模
板可获得与鲜样品同等的扩增效果, 从同一个体的
干叶和鲜叶片中提取的 DNA 模板可获得完全一致
的扩增产物; DNA 模板严重降解对 RAPD产物有
一定影响。而本研究中发现,绞股蓝新鲜样品与干
燥样品的 RA PD图谱存在一定差别。绞股蓝干燥
样品扩增出来的条带与新鲜样品相比, 2 000 bp以
上的大片段明显减少, 而 750 bp以下的小片段明显
1695中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
增多,扩增片段大小集中在 250~ 2 000 bp; 在新鲜
样品中扩增较弱的片段, 尤其是一些大片段, 在干燥
样品中基本扩增不出来, 而在新鲜样品中扩增较强
的片段在干燥样品中依然能有效扩增。这是由于绞
股蓝作为中草药, 入药前的加工步骤造成了 DNA
不同程度的降解。这也进一步说明要利用 RA PD
技术鉴定中药材, 要考虑到新鲜药材和干药材
RAPD 指纹图谱的差别。若是想将 RAPD 标记转
化 为 sequence character ized ampl if ied regions
( SCA R)标记, 应针对是新鲜药材和干药材共有的
特异条带。
王培训[ 13]等在利用 RAPD技术对南北五味子
进行鉴别的研究中发现, 以醋制南五味子为模板, 各
条引物的 PCR产物电泳图谱见不到 PCR产物。在
中药过程炮制中某些需要经过高达 150 ∃ 的高温处
理,导致 DNA 严重降解且 DNA 双链分子之间形成
共价键,从而得不到 PCR产物。而新鲜绞股蓝只需
干燥后即可入药,其干药材的 DNA 降解程度较轻,
在本研究所采用的 17份绞股蓝干燥样品中, 均可得
到 PCR产物。
在后续研究中, 我们首先将针对此段 DNA 序
列设计特异引物, 将其转化为稳定的 SCAR标记,
增加扩增结果的稳定性和可重复性,从而将此特异
DNA 片段应用于绞股蓝的鉴定。
致谢:广西药用植物园凌征柱研究员、广西中医药
研究院何开家研究员为本研究鉴定并提供部分样品。
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毛钩藤和无柄果钩藤的 ITS序列分析研究
朱 爽1 ,周 林1 , 黄楷鸿1 , 黄宏靓1 ,高晓霞2 ,曾常青3 *
( 1 广东药学院生命科学与生物制药学院,广东 广州 510006; 2 广东药学院药科学院, 广东 广州 510006;
3 广东药学院中药学院, 广东 广州 510006)
摘 要:目的 以核糖体转录间隔区( rDNA IT S)序列为分子标记, 对钩藤属的 2 种常用中药材毛钩藤 Uncaria
hirs ute和无柄果钩藤 U sessilif ructus 进行遗传分析,阐明钩藤属内不同种间的分子系统发育关系。方法 通过改
良 CT AB 法对毛钩藤和无柄果钩藤进行总 DNA 提取, 利用通用引物对 rDNA IT S 序列进行 PCR扩增, RFLP 分析
和序列测定,用 PAUP软件进行系统发育分析,构建最大简约树。结果 获得毛钩藤和无柄果钩藤的限制性内切
酶( Msp %& H ae ! )酶切图谱以及 rDNA ITS 区的完整序列,其序列长度均为 718 bp。结论 通过基于 rDNA
ITS 序列进行 RFLP分析、序列测定和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对钩藤属植物进行准确的分子鉴
定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学依据。
关键词:毛钩藤; 无柄果钩藤; IT S 序列
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10169605
1696 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100308 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30800227)作者简介:朱 爽( 1977 ∀ ) ,男,讲师。 Tel/ Fax: ( 020) 39352201 Email: w en chengji@ yahoo com cn
* 通讯作者 曾常青 T el/ Fax: ( 020) 39352181 Em ail: gdz cq@ 163 com