全 文 ：离子注入介导甘草基因组 DNA转化酵母菌
金 　湘1 ,毛培宏1 3 ① ,吕 　杰1 ,2
(11 新疆大学物理科学与技术学院 离子束生物技术中心 ,新疆 乌鲁木齐 　830008 ;
21 南京工业大学制药与生命科学学院 ,江苏 南京 　210009)
摘 　要 :目的 　以甘草酸为目标产物 ,探讨氮离子 (N + ) 和氩离子 (Ar + ) 注入介导甘草基因组 DNA 在酵母菌中的
转化。方法 　通过 N + 和 Ar + 注入介导乌拉尔甘草基因组 DNA 在异常汉逊酵母 H ansenula anomala 中随机转化 ,
转化后的酵母菌经斜面传代和液体培养后 ,用醋酐2浓硫酸定性检识和 RP2HPLC 方法 ,检测重组酵母菌培养液中
甘草酸和甘草次酸的量。结果 　获得了生物合成甘草酸和/ 或甘草次酸的重组酵母菌 5 株。液体培养 96 h ,RP2
HPLC测试其培养液中甘草酸最高量 114149 mg/ L ,18α2甘草次酸和 18β2甘草次酸最高量分别为 0156 和 0181 mg/ L。
TLC 检测发现其中 1 株重组酵母菌的培养液中含一种未知的红色组分。结论 　采用离子注入介导甘草基因级
DNA 大分子转化技术 ,可获得易于人工培养的产生甘草酸等次生代谢产物的微生物工程菌株。
关键词 :离子注入 ;甘草基因组 DNA ;重组酵母菌 ;甘草酸
中图分类号 :R282. 2 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320461204
Transformation of Glycyr r hiza uralensis genomic D NA into yeast mediated by ion implantation
J IN Xiang1 , MAO Pei2hong1 , L U Jie1 ,2
(11 Institute of Ion Beam Biotechnology , College of Physic Science and Technology , Xinjiang University , Urumqi 830008 ,
China ; 21 College of Life Science and Pharmacy , Nanjing University of Technology , Nanjing 210009 , China)
Abstract : Objective 　Wit h t he sole object of glycyrrhizic acid p roduct s , t he met hods were investigated
for Gl ycy rrhi z a uralensis genomic DNA transformation into H ansenul a anom al a by nit rogen and argon ion
implantation1 Methods 　The genomic DNA from G1 uralensis was randomly t ransferred into H1 anom al a
by nit rogen and argon ion bombardment1 The recombined yeast s were cultured by t he slant and liquid cul2
tivation , in which t he content s of glycyrrhizic acid and glycyrrhetic acid were determined by acetic
anhydried2H2 SO4 qualitative test and RP2HPL C determination1 Results 　Five recombined yeast st rains t hat
p roduced glycyrrhizic acid and glycyrrhetic acid were obtained1 After cult ured in liquid medium for 96 h ,
t he highest content of glycyrrhizic acid in t he cultivation liquid was 114149 mg/ L and t hat of 18α2glycyr2
rhetic acid and 18β2glycyrrhetic acid were respectively 0156 and 0181 mg/ L by RP2H PL C1 A kind of un2
known red component was found in t he cultivation liquid of one recombined st rain by TL C1 Conclusion
The recombined yeast st rains of p roducing glycyrrhizic acid could be obtained G1 uralensis genomic DNA
transformation into yeast mediated by t he ion implantation1
Key words : ion implantaton ; Gl ycy rrhi z a uralensis F1 genome DNA ; recombined yeast ; glycyrrhizic
acid
　　甘草为豆科甘草属多年生深根性草本植物 ,具
有抗寒、耐热、抗盐碱等优良特性 ,是荒漠、半荒漠地
区保持水土、改良土壤、防风固沙的重要药用植物。
甘草酸 (glycyrrhizic acid , GA)是甘草地下部分最重
要的五环三萜皂苷类生理活性物质之一 ,高剂量的
GA 可以完全阻止 SARS 病毒的复制[1 ] ; GA 能促进
艾滋病患者免疫力的恢复 ,诱导干扰素 ,抑制癌细胞
的生长[ 2 ,3 ] 。GA 一直依赖于植物来源 ,属于资源依
赖型产品。若能构建产 GA 的微生物工程菌株 ,最
终实现 GA 的微生物发酵生产 ,将对干旱、半干旱、
荒漠地区生态环境的保护产生深远的影响。但 GA
的生物合成途径复杂 ,目前还没有与 GA 生物合成
·164·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009206208　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30560182、30960006)
作者简介 :金　湘 (1960 —) ,女 ,新疆奇台人 ,助理研究员 ,主要从事微生物代谢、分子生物学和离子束生物技术相关领域研究。3 通讯作者　毛培宏　Tel : (0991) 4543656 　E2mail :phmao @china. com ; phmao @xju1edu1cn
相关的基因信息 ,因此 ,至今无人按照常规的基因工
程方法构建工程菌。
离子注入生命体的独特机制 ,使其成为一种新
的转基因手段[4 ] 。在药用植物基因组 DNA 转化酵
母菌方面 ,吕杰等[5 ] 利用离子注入介导药用植物麻
黄基因组 DNA 转化酵母菌 ,获得了遗传稳定的以
葡萄糖为碳源、NaNO3 为氮源生物合成麻黄碱和/
或伪麻黄碱的重组酵母菌。基于离子注入介导
DNA 大分子遗传转化的原理[4 ] ,笔者进行了离子注
入介导甘草基因组 DNA 在异常汉逊酵母菌中的随
机转化 ,以期获得产 GA 的重组酵母菌株。
1 　材料与方法
111 　菌种 : 异常汉逊酵母 H ansenul a anom al a
2340 ,来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
112 　主要试剂和仪器 :葡萄糖 ·H2 O ,蛋白胨 ,酵母
膏粉 ,琼脂粉 ,石英砂 ,变色硅胶 ,皂苷类物质定性检
识试剂和薄层色谱试剂 ,RP2HPL C 试剂〔其中 GA、
18α2甘草次酸 ( 18α2glycyrrhetic acid , 18α2GAs) 和
18β2甘草次酸 (18β2glycyrrhietic acid , 18β2GAs) 购
自 Sigma 公司〕; CTAB 及基因组 DNA 提取用试
剂。IBB Device 1 多功能离子注入机 , Sigma 3 —
18 K离心机 ,Waters1525 RP2H PL C 色谱仪。
113 　YPD 培养基 :酵母膏 10 g、蛋白胨 20 g、葡萄
糖 20 g、蒸馏水 1 000 mL 。
114 　野生甘草的采集及其基因组 DNA 的制备 :野
生乌拉尔甘草 Gl ycy rrhi z a uralensis F1 的采集方
法及应用 CTAB 法制备其基因组 DNA 的方法均按
文献方法[6 ]进行。
115 　酵母菌膜的制备及其离子注入 :按文献方法[ 5 ]
进行。
116 　甘草基因组 DNA 的导入 :离子注入结束后 ,立
即用 2 mL 质量浓度为 400μg/ mL 的甘草基因组
DNA 的 TE 缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜 ,
28～30 ℃静止温育 2 h 后 ,用无菌玻璃刮铲反复洗脱
2 min ,获得洗脱液。取 011 mL 洗脱液用无菌玻璃
刮铲均匀涂布于 YPD 平板培养基 ,倒置 ,于 28～30
℃培养 72 h。未注入 Ar + 或 N + 的酵母菌膜也按相
同方法处理 ,并以 2 mL 无菌水代替甘草基因组
DNA TE 缓冲液 ,浸泡离子注入后的菌膜为对照。
117 　重组酵母菌培养液 GA 的检测 :将 YPD 平板培
养基上生长的酵母菌菌落分别接入 YPD 斜面 ,28～
30 ℃培养 72 h ,分别转接 YPD 液体培养基 ,置摇床
230 r/ min、28～30 ℃培养 96 h。液体培养结束后 ,
8 000 × g 离心 10 min ,收集上清液 ,进行皂苷类物
质的定性检识、薄层色谱检测和 RP2H PL C 测试。
GA 的 RP2HPLC 检测方法[7 ,8 ] : Waters 1525
pump RP2HPLC 色谱仪 , UV2487 双通道紫外检测
器 ,检测波长 (λ) 210 nm , Kromasil 10025 C18 色谱柱
(150 mm ×416 mm) ,Breeze 3130 色谱工作站。流动
相 :012 mol/ L 乙酸铵2〔甲醇2乙腈 (2 ∶1)〕(75 ∶25) ;
体积流量 :112 mL/ min。每次进样量 1010μL。
GAs 的 RP2HPL C 检测方法[ 7 ,8 ] :流动相 : 012
mol/ L 乙酸铵2〔甲醇2乙腈 (2 ∶1)〕(70 ∶30) ,其他
条件与 GA 的 RP2H PL C 检测方法相同。
2 　结果和分析
211 　重组酵母菌培养液中皂苷类物质的定性检识 :
通过 Ar + 和 N + 注入介导甘草基因组 DNA 在酵母
菌中的转化 ,获得了 1 266 株 T2 代重组酵母菌 ,其
中 Ar + 注入介导获得 494 株 ,N + 注入介导获得 772
株。以皂苷类物质为目标组分 ,对 T2 代和 T3 代重
组酵母菌培养液进行醋酐2浓硫酸 ( Liebermann2
Burchard′s reaction) 定性检识 ,结果表明 , T2 代菌
株培养液中皂苷类物质的阳性反应率平均为
22191 % ,其中 27193 %可遗传至 T3 代。由此获得
了产皂苷类物质的 T3 代重组酵母菌 81 株。真空
条件下未注入 Ar + 或 N + 的酵母菌 ,在导入甘草基
因组 DNA 的处理中 ,未获得皂苷类物质阳性反应
的菌株。以 2 mL 无菌水代替甘草基因组 DNA TE
缓冲液 ,浸泡离子注入后的菌膜为对照的处理中 ,也
未获得皂苷类物质阳性反应的菌株。
212 　重组酵母菌培养液的 RP2HPL C 检测 :将 T3
代皂苷类物质定性检识为阳性的重组菌株连续传代
至 T8 代 ,其中 5 株重组菌株的定性检识仍为阳性 ,
说明其产皂苷类物质的性能稳定 ,培养液的 RP2
HPL C 检测结果 (表 1) 表明 ,重组菌株 N7059 培养
液中 GA 质量分数为 114149 mg/ L , 18α2GAs 和
18β2GAs 质量分数分别为 0156 和 0180 mg/ L ,而重
组菌株 A2053 的培养液中未检出 18β2GAs。这 5
个重组菌株培养液中的 GA 和 GAs 的量各不相同 ,
说明它们在 GA 和 GAs 生物合成代谢方面存在差
异 ,反映了离子注入介导外源 DNA 大分子转化的
随机性和重组酵母菌的遗传多样性。
　　尽管重组菌株 N7059 培养液中 GA 量较高 ,但从
其 RP2HPLC色谱图 (图 12B)中发现 , GA 与其保留时
间 (RT)更长的未知组分未完全分离 ,这说明 GA 在
培养液中并不是处于游离状态 ,而是与某一组分呈紧
密结合状态 ,而其 GAs 则处于游离状态 (图 12D) 。
213 　重组酵母菌培养液的薄层色谱检测 :将生物合
·264· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
表 1 　重组酵母菌 T8 代培养液中 GA和 GAs 的量
Table 1 　Yields of GA and GAs in extracellular solutions
of generation T8 recombined yeasts
菌株编号
GA/
(mg ·L - 1)
18α2GAs/
(mg ·L - 1)
18β2GAs/
(mg ·L - 1)
A1027 60125 0114 01 11
A2053 65102 0103 —
A2163 48141 0118 01 20
A2474 25125 0142 01 81
N7059 114149 0156 01 80
对照菌株 2340 —　 — —
液体培养基 —　 — —
　　—:未检出
—:undetected
成 GA 的 5 株重组酵母菌 96 h 培养液分别点样于
150 mm ×200 mm 的硅胶 GF254 层析板 ,以对照菌
株 96 h 培养液、甘草全株 75 %乙醇浸出液和未接种
的空白培养液为对照 ,每个样品的总计点样量为
200μL 。在石油醚2苯2醋酸乙酯2冰醋酸 (10 ∶20 ∶
7 ∶015) 的溶剂中展开 45 min。在可见光下 ,发现
重组菌株 N7059 的培养液中含一种红色组分 (图
2) ,其 Rf 值为 0151。在相同条件下 ,对照菌株、空
白培养液、甘草全株 75 %乙醇浸出液在 Rf 值为
0151 处 ,均没有该组分。由此推测 ,该红色组分为
重组菌株 N7059 的新的代谢产物。
A ,B2对照品　C ,D2重组菌株 N7059 T8 代 96 h 培养液
A , B2reference substances 　C , D2ext racellular solution of recombined st rain N7059 generation T8 cultured for 96 h
12甘草酸　2218α2甘草次酸　3218β2甘草次酸
12glycyrrhizic acid 　2218α2glycyrrhetic acid 　3218β2glycyrrhetic acid
图 1 　重组菌株 N7059 培养液中 GA和 GAs 的 RP2HPLC图
Fig11 　RP2HPLC Chromatograms of GA and GAs in extracellular solution of recombined strain N7059
12重组菌株 A1027 　22重组菌株 A2053 　32重组菌株 A2163 　42
甘草全株 75 %乙醇浸出液 　52重组菌株 A2474 　62重组菌株
N7059 　72对照菌株　82空白培养液
12st rain A1027 　22st rain A2053 　32st rain A2163 　42et hanol
ext ract f rom whole plant of G1 uralensis 　52st rain A2474 　62
st rain N7059 　72 H1 anomala 2340 as cont rol st rain 　82liquid
medium
图 2 　重组酵母菌株培养液在薄层色谱中的红色组分
Fig12 　TLC Analysis of red components in extracellular
solution of recombined yeast strains
3 　讨论
　　在 Ar + 注入介导甘草基因组 DNA 转化获得的
494 株重组酵母菌中 ,只有 4 株 (表 1 中的 A1027、
A2053、A2163 和 A2474)的培养液中检出了 GA 和
(或) GAs ,以 GA 为目标产物计算 ,甘草基因组
DNA 中与 GA 生物合成相关基因的转化率为
0181 %。N + 注入介导获得的 772 株重组酵母菌中 ,
只有 1 株 (表 1 中的 N7059) 的培养液中检出了 GA
和 GAs ,以 GA 为目标产物计算 ,甘草基因组 DNA
中与 GAs 生物合成相关基因的转化率仅为
0113 % ,大大低于 Ar + 注入介导的甘草基因组 DNA
转化。在离子注入过程中 ,非生物活性的 Ar + 不会
与生物靶组织发生化学反应 ,而以氩气的形式逸出
靶面 ,因此 ,在离子注入介导外源 DNA 大分子遗传
转化研究中 ,一般选用刻蚀效果好、化学性质稳定的
Ar + 作为注入离子 ,有利于提高外源 DNA 的转化
率和转化后代的稳定性[9 ] 。
许多参与次生代谢产物生物合成的多酶体系是
由单个分开的具有明显的功能区域组成的[10～13 ] ,在
重组菌株 N7059 的次生代谢产物中发现一种新的
红色组分 (图 2) ,是否是因为甘草基因组与酵母菌
基因组 DNA 之间的基因重组改变了次生代谢产物
·364·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
的生物合成途径而产生新的代谢旁路、形成新的化
合物 ,尚有待进一步研究。对重组菌株 N7059 产生
的红色组分的结构解析研究 ,将为甘草与酵母菌之
间的基因交流提供进一步的化学证据和分子证据。
离子注入介导外源 DNA 转化的最大特点是不
需要事先知道或克隆出目的 DNA 片段 ,因此在目
前没有 GA 生物合成相关的基因信息的情况下 ,仍
可采用离子注入介导甘草基因组 DNA 转化方法 ,
以 GA 为目标产物 ,筛选获得易于人工培养的产生
GA 的酵母工程菌株。通过对遗传稳定的生物合成
GA 的重组酵母菌的基因组学、蛋白质组学和代谢
组学的深入研究 ,将获得与 GA 生物合成相关的多
个基因及其调控信息。
致谢 :武宝山副教授和凌海秋副教授参与离子
注入工作 ,乔坤云高级实验师和周俊副研究员进行
GA 和 GAs 的 RP2HPL C 分析测试工作。
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马蹄香表达序列标签资源的 SSR信息分析
李 　珊1 ,周天华2 ,赵桂仿2 ,朱云国1 ,杨晓伶1 ,程 　舟1 3 ①
(11 同济大学生命科学与技术学院 ,上海 　200092 ;21 西北大学生命科学学院 ,陕西 西安 　710069)
摘 　要 :目的 　分析马蹄香 EST 资源的 SSR 信息 ,为开发 EST2SSR 标记奠定基础。方法 　从 GenBank 中获得马
蹄香 EST 序列 ,用 Sequencher 418 软件进行序列拼接得到 Uni2EST 序列 ,用 SciRo Ko314 软件对 Uni2EST 序列进
行 SSR 扫描 ,分析 EST2SSR 的分布频率和重复基元的类型特征。结果 　共获得 10 274 条马蹄香 EST 序列 ,通过
预处理共得到全长为 5111 ×106 bp 的无冗余 Uni2EST 6 643 条。在这些序列中共搜索出 1 408 个 SSR 位点 ,分布
在 1 232 条 Uni2EST 序列中 ,发生频率为 18155 % , EST2SSR 的平均长度为 22130 bp ,平均每 3163 kb 含 1 个 SSR
位点。单核苷酸重复在马蹄香 EST2SSR 中占主导地位 ,发生频率为 12124 % ,其次为二核苷酸重复 ,发生频率为
5101 %。在所有重复基元中 ,A/ T 基元出现频率最高 ,其次为 A G/ CT。结论 　马蹄香 EST 中 SSR 出现的频率较
高 ,并且类型较为丰富。
关键词 :马蹄香 ;表达序列标签 ; EST2SSR
中图分类号 :R28212 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320464205
Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from Sa ruma henryi
L I Shan1 , ZHOU Tian2hua2 , ZHAO Gui2fang2 , ZHU Yun2guo1 , YAN G Xiao2ling1 , CH EN G Zhou1
(11 School of Life Sciences and Technology , Tongji University , Shanghai 200092 , China ;
21 College of Life Sciences , Northwest University , Xi′an 710069 , China)
Abstract : Objective 　To analyze t he simple sequence repeat (SSR) information in expressed sequence
·464· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009206210　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30800087)
作者简介 :李　珊 (1976 —) ,女 ,陕西西安人 ,讲师 ,博士 ,主要从事资源植物学研究。
Tel :13916300269 　E2mail :lishanbio @yahoo1com1cn3 通讯作者　程　舟　Tel : (021) 65985185 　Fax : (021) 65985185 　E2mail :chengzhou @mail1 tongji1 edu1cn