全 文 ：大黄素对非酒精性脂肪肝大鼠脂质水平及肝脏脂质代谢基因表达的影响
刘
涛1 ,徐秋玲1 ,赵
岩2 ,李学军2 , 刘长勤2 ,杨叔禹2*
( 1
海南医学院, 海南 海口
571101; 2
福建医科大学附属厦门市第一医院 厦门市糖尿病研究所,福建 厦门
361003)
摘
要:目的
探讨大黄素 ( emodin) 对高脂喂养导致的非酒精性脂肪肝 ( NAFLD) 大鼠脂质水平和肝脏脂质代
谢基因表达的影响。方法
大鼠高脂饮食 6 周形成 NAFLD 模型,大黄素低、高剂量 ( 30、60 mg/ kg ) 干预 4 周, 肝
脏 HE 染色观察 NAFLD 模型大鼠肝脏病理改变, 检测血清和肝脏的甘油三酯 ( TG)、游离脂肪酸 ( FFA) 和转氨
酶 ( ALT、AST ) 水平;采用荧光实时定量 PCR 技术检测肝脏 X 受体 ( LXR)、固醇调节元件结合蛋白-1c ( SREBP-
1c)、脂肪酸合成酶 ( FAS)、二酰基甘油酰基转移酶 2 ( DGAT-2)、硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1 ( SCD-1)、脂酰辅酶 A
氧化酶 ( ACO)、肉毒碱棕榈酸转移酶-1 ( CPT-1) 和过氧化物酶体增殖物激活受体
( PPAR-
) 等脂质代谢基因表
达。结果
与模型组相比,大黄素低剂量组大鼠血清 FFA、T G、ALT 显著下降,肝脏 HE 染色显示脂质沉积减轻,
SCD-1 表达下降;高剂量组大鼠 ALT、AST ,血清和肝脏 TG、FFA 显著下降, 肝脏脂质沉积显著下降, 肝脏 FAS、
DGAT-2、SCD-1 表达降低, CPT-1 和 PPAR-
的表达显著增高。结论
大黄素剂量依赖性地改善 NAFLD ,其机
制可能与下调肝脏脂质合成基因和上调脂肪酸氧化基因的表达有关。
关键词:大黄素; 非酒精性脂肪肝; 脂质代谢; 荧光实时定量多聚酶链反应
中图分类号: R285


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1516-03


随着生活水平的提高,非酒精性脂肪肝 ( nona-l
coholic fat ty liver disease, NAFLD) 已成为目前最
常见的肝脏疾病之一, 被认为是代谢综合征在肝脏
的表现。NAFLD 以肝脏中性脂肪沉积为特点, 肝
脏的脂肪沉积与肝脏脂肪的摄取和分解的失衡有
关[ 1]。大黄素 ( emodin) 是蒽醌类物质,是大黄、何
首乌等中药的有效成分, 近期研究表明大黄素对肝
脏具有保护作用 [ 2] ,并且对代谢综合征某些组分具
有治疗作用[ 3-4]。本实验通过高脂喂养的方法建立
NAFLD 大鼠模型, 观察大黄素对 NAFLD 大鼠的
脂质水平及肝脏脂质代谢相关基因表达的影响。
1
材料与方法
1
1
实验动物及药物: Wistar 大鼠, 雄性, ( 180

20) g,动物合格证号为 SCXK (沪) : 2007-0005, 购
自上海斯莱克公司。按照随机数字表, 将大鼠随机
分为对照组、模型组、大黄素低剂量和高剂量组, 每
组各 8只。实验大鼠饲养在厦门市医药研究所实验
动物室, 室内温度和湿度分别保持在 22
和
50%。大黄素购自南京替斯艾么中药研究所, 质量
分数为 95%, 先融于 DMSO ( Sigma Chemical,
USA) ,再用双蒸水稀释成 3和 6 mg/ mL。
1
2
实验仪器: Automat ic analyzer, 7600
110 生
化分析仪,日本 Hitachi公司; UV
2450 紫外可见
分光光度计,日本 Shimadzu 公司; PCR 仪, Bio-Rad
M ycycler, 美国; 荧光定量 PCR 仪, Roche lightcy-
cler 480, 瑞士; RNA 提取试剂盒, T iangen Biotech
公司; PrimeScr iptT M RT regeant 和 SYBR Premix
ex T aqTM
, Takar a 宝生物(大连)工程有限公司;
游离脂肪酸 ( FFA) 试剂盒购自南京建成生物工程
研究所。
1
3
NAFLD 大鼠模型建立及给药:对照组由普通
饲料喂养,每 100 克普通饲料提供 1 364 kJ 热量。
NAFLD组大鼠由高脂饲料喂养, 高脂饲料由 20%
猪油、4% 白糖、2% 奶粉、1% 胆固醇、73% 普通饲
料组成,每 100 克高脂饲料提供 1 895 kJ 热量, 两
组均自由饮水。高脂喂养 6 周, 大黄素高、低剂量
组分别给予 30、60 mg/ ( kg
d) 大黄素, 对照和模
型组 ig 等体积双蒸水,给药时间为 4 周。
1
4
肝脏 HE 染色: 肝组织经石蜡切片, HE 染色
后,普通光镜下观察肝组织病理学变化。
1
5
脂质检测:血清脂质转氨酶 ( ALT、AST ) 通
过生化分析仪检测。取适量新鲜肝脏, 制成组织匀
浆,用抽提液甲醇-氯仿 ( 1
1) 抽提脂质,用分光光
度法测定甘油三酯 ( TG) 的量。FFA 的检测严格
按照 FFA 试剂盒的检测说明书操作。
1
6
肝脏 RNA 的提取和逆转录反应: 50 mg 肝组织
液氮中研磨,利用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA,在
波长 260 nm 处紫外检测 RNA 量,并计算浓度。将

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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2010- 01-15





















基金项目:福建省卫生厅创新项目资助 ( 2007-CXB-10) ; 厦门市科技局项目资助 ( 3502Z20077050)作者简介:刘
涛( 1977
) ,男,博士后,辽宁省沈阳人。T el : 13959224685
E-mail: t angsong368@ 163. com
* 通讯作者
杨叔禹
T el: ( 0592) 2137558
RNA 通过逆转录反应合成 cDNA,其体系及反应为
PrimescriptTM Buffer 2
L、Prime Script TM RT Enzyme
Mix 0. 5
L、Oligo dTPrimer ( 50
mol/ L ) 0. 5
L、
Random 6 mers ( 100
mol/ L ) 0. 5
L、Total RNA 2

L、ddH 2O 4
L, 37
15 min (逆转录反应) , 85
5
s (反转录酶的失活反应)。
1
7
实时定量 PCR: 引物设计由 NCBI 网站
Primer-BLAST 软件设计, 由上海英俊生物有限公
司合成,具体引物序列见表 1。实时定量 PCR 混合
物体系总体积为 20
L, 其中包括 SYBR T aq
酶
10
L,引物各 0
6
L, cDNA 2
L, ddH 2O 6
8
L。
实时定量 PCR 扩增过程: 95
、5 s, 65
、1 min, 1
个循环,进行融解曲线分析。最终结果由目的基因
与自身 GADPH 的比值,再与目的阳性基因与自身
GADPH 比值进行相除的结果来表示。
表 1
引物序列
Table 1
Primer sequence
基因类别 基因名称 上游引物 (5
 3
) 下游引物( 5
 3
)
内参基因 GADPH TGGTGGACCT CAT GGCCT AC GCAACT GAGGGCCTCT CT
脂质合成 L
R TCAGCATCTT CT CTGCAGACCGG T CAT T AGCAT CCGTGGGAACA
SREBP-1c GCCATGGAT TGCACATT G T GT GT CT CCT GT CT CACCCC
FAS GGACATGGT CACAGACGAT GAC GGAGGCGTCGAACT TGGA
DGAT- 2 TCTT CCT ACCGGGAT GTCAAT C T CCCT GCAGACACAGCT T G
SCD- 1 CCT TAACCCT GAGATCCCGTAGA AGCCCATAAAAGATT T CTGCAAA
FFA氧化 ACO GAT TCAAGACAAAGCCGTCCAG T CCACCAGAGCAACAGCAT TG
CPT-1 AGCCAT GGAGGT TGTCTACG GGCT TGT CTCAAGTGCT TCC
PPAR-
CT CGT GCAGGTCAT CAAGAA CAGCCCT CTT CAT CTCCAAG
1
8
统计学处理:采用 SPSS 11
5软件,数据以 x
s
表示。组间差别应用 ANOVA 检验处理数据。
2
结果
2
1
肝脏病理染色: HE 染色显示,对照组肝细胞
排列整齐,肝小叶规则, 细胞呈多边形, 中央有大而
圆的核,细胞质均匀,肝细胞内无脂滴沉积。模型组
大鼠肝细胞肿胀, 胞质中出现大小不等的脂滴空泡,
以大泡性脂肪滴为主, 核居边,细胞界限不清。大黄
素低剂量组脂滴空泡有所减少, 高剂量组脂滴空泡
显著下降 (图 1)。
2
2
肝脏及血清脂质的检测: 模型组与对照组相
比,肝脏和血清 FFA、T G 显著增高 ( P< 0
05) (表
2)。与模型组相比, 大黄素低剂量组大鼠血清
FFA、T G、ALT 显著下降, 高剂量组大鼠 ALT、
AST ,血清和肝脏 TG、FFA 显著下降 (表 2)。
2
3
肝脏脂质代谢基因的表达:模型组与对照组相
比,固醇调节元件结合蛋白-1c ( SREBP-1c)、脂肪酸
合成酶 ( FAS)、二酰基甘油酰基转移酶 2 ( DGAT-
2)、硬脂酰辅酶 A去饱和酶 1 ( SCD-1)、脂酰辅酶 A
氧化酶 ( ACO )、肉毒碱棕榈酸转移酶-1 ( CPT-1)
和过氧化物酶体增殖物激活受体
( PPAR-
) 呈现
显著性增加 ( P< 0
05、0
01) ,肝脏
受体 ( L
R)
无显著变化。与模型组相比,大黄素剂量组 SCD-1
表达下降 ( P < 0
05) , 高剂量组 FAS、DGAT-2、
SCD-1 表达降低 ( P< 0
05) , CPT-1和 PPAR-
的
表达显著增高 ( P< 0
05) (表 3)。
图 1
肝脏 HE 染色
Fig. 1
Liver HE staining
表 2
脂质和转氨酶水平 (x
s, n= 8)
Table 2
Level of lipids and transaminase ( x
s, n= 8)
组
别 剂量/
( mg
kg- 1 )
肝
脏
TG/ ( mg
g- 1) FFA/ (
mol
L- 1 )
血
清
FFA/ (
mol
L- 1 ) TG/ ( mmol
L- 1 )
ALT/
( U
L- 1 )
A ST/
( U
L- 1 )
对照 - 15
22
3
72 72
25
13
73 349
67
110
33 0
27
0
04 44
22
6
88 162
86
21
68
模型 - 27
82
5
63* 106
48
11
38* 506
96
121
37* 0
55
0
15* 80
86
8
65* 195
71
37
77*
大黄素 30 22
85
4
96 100
16
16
42 465
17
64
53
0
32
0
05
68
42
10
18 187
14
27
91
60 19
61
4
77
92
26
8
22
442
45
118
80
0
27
0
09
61
83
5
25
142
33
18
19



与对照组比较: * P< 0
05;
与模型组比较:
P < 0
05


* P< 0
05 v s con tr ol group;
P < 0
05 v s model group

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Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
表 3
肝脏脂质代谢相关基因的表达 ( x
s, n= 8)
Table 3
Related gene expression of lipid metablism in liver ( x
s, n= 8)
组
别 剂量/ ( mg
kg- 1) L
R SREBP-1c FAS DGAT-2 SCD-1 ACO CPT-1 PPAR-

对照 - 2
06
1
16 0
45
0
21 1
08
0
36 1
22
1
05 1
04
0
16 0
99
0
44 1
21
0
44 0
99
0
42
模型 - 2
17
1
36 7
06
3
18* * 2
27
0
35* 2
97
1
28* 7
44
2
82 * * 6
22
2
25* * 8
04
2
40* * 1
95
0
32*
大黄素 30 1
80
1
01 6
40
2
74 2
47
1
10 1
93
0
60 2
09
0
96
4
20
3
31 7
72
2
21 1
73
0
72
60 1
87
1
25 5
30
1
09 1
52
0
84
1
03
0
75
1
59
1
01
3
63
2
90 16
68
4
54
3
40
1
44



与对照组比较: * P< 0
05
* * P< 0
01;
与模型组比较:
P < 0
05


* P< 0
05
* * P < 0
01 v s cont rol group;
P < 0
05 v s model group
3
讨论


NAFLD 是目前最常见的肝脏疾病之一, 目前
控制饮食和运动是 NAFLD 的治疗方法。肝脏脂
肪沉积是 NAFLD 的主要病理改变, 其实质为肝脏
脂质摄入和分解的失衡。Higuchi 等 [ 5] 研究证实,
L
R 与 SREBP-1c是 NAFLD 脂质合成的主要调
控因素。Stefanovic-Racic和 Yeon [ 6-7]研究表明, 脂
肪酸氧化相关的 CPT-1 过表达的肥胖大鼠肝脏的
甘油三酯显著下降, PPAR-
的低表达是 NAFLD
发病的重要原因,说明促进脂肪酸氧化相关基因的
高表达能够减轻 NA FLD 的肝脏脂肪沉积。
大黄素是大黄等中药的有效成分, 具有抗肿
瘤[ 8]、免疫抑制[ 9] 等作用。近期研究表明大黄素对
肝脏具有保护作用[ 2] ,并且对代谢综合征某些组分
具有治疗作用[ 3-4]。本实验通过高脂喂养建立
NAFLD 模型,观察大黄素对 NAFLD 的药效,结果
显示大黄素高剂量组 ( 60 mg/ kg ) 大鼠肝脏的脂肪
沉积显著降低, 血清和肝脏的脂质及转氨酶水平显
著下降,而大黄素低剂量组 ( 30 mg / kg) 大鼠虽然
与 NAFLD 组相比,肝脏脂肪沉积和脂质及转氨酶
水平有所改善, 但改善程度远不如高剂量组, 说明大
黄素对 NAFLD 的治疗作用呈现剂量依赖性。通
过对肝脏脂质代谢基因表达的分析, NAFLD 大鼠
脂质合成与脂肪酸氧化基因的表达均显著增高, 而
大黄素高剂量组抑制脂质合成的基因 FAS、DGAT-
2 和 SCD-1 的表达,上调了 FFA 氧化的基因 CPT-
1 和 PPAR-
的表达。以上实验说明,大黄素治疗
NAFLD呈剂量依赖性, 机制可能与抑制肝脏脂质
合成和促进 FFA 氧化有关。
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药物评价研究
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