全 文 :TU NEL 检测均显示, 应用 GST T 后, 心肌组织损
伤减轻,心肌细胞凋亡率下降。揭示在再灌注的同
时外源性给予 GST T 可增强机体清除氧自由基的
能力,减轻细胞膜脂质过氧化损伤,提高机体的抗氧
化能力,从而发挥药物后处理的保护作用。
研究发现, 细胞因子参与了缺血再灌注损伤的
发生与发展。受损的心肌细胞会分泌 T 炎症性因
子,诱导心肌细胞凋亡,进一步加重细胞损伤。本实
验结果显示,缺血再灌后血清中 TNF、IL6 升高,
与文献报道一致[ 11]。而 GSTT 可显著抑制损伤心
肌细胞分泌 T NF、IL6, 减轻再灌注对细胞膜损
伤程度,进一步揭示了 GST T 后处理可抑制缺血再
灌注导致的心肌细胞凋亡。
综上所述, GST T 后处理对大鼠心肌缺血再灌
注损伤具有保护作用,能减少自由基生成,减少炎症
因子分泌, 抑制心肌细胞凋亡,其具体的作用机制有
待于进一步研究。
参考文献:
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龙须菜藻红蛋白对 H22荷瘤小鼠免疫功能的影响
陈美珍,杜 虹,徐本杰*
(汕头大学理学院 生物系, 广东 汕头 515063)
摘 要:目的 研究龙须菜藻红蛋白体内抑瘤效应与荷瘤小鼠机体免疫功能的关系, 探讨其抑瘤作用的细胞免疫
学机制。方法 建立小鼠 H22肝癌实体瘤模型,分别 ig 给予藻红蛋白高、中、低剂量。连续给药 7 d 后, 测定各组
小鼠肿瘤生长抑制率和腹腔巨噬细胞的吞噬指数,采用 MTT 法检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数、NK 细胞免疫
活性和肿瘤坏死因子 ( T NF) 的分泌。结果 高剂量藻红蛋白对小鼠 H 22肿瘤的生长抑制率明显高于模型组
( P< 0 05) ,抑瘤率为 30 23% ;与模型组比较, 藻红蛋白对荷瘤小鼠胸腺和脾脏有保护和修复作用, 具有显著提高
腹腔巨噬细胞的吞噬指数 (P< 0 05)、脾淋巴细胞增殖指数 ( P< 0 01)、NK 细胞对靶细胞的杀伤活性 ( P< 0 01)
和增加脾淋巴细胞分泌 TNF的作用 (P< 0 05)。结论 龙须菜藻红蛋白可明显提高 H22荷瘤小鼠细胞免疫功
能,这可能是其抗肿瘤效应机制之一。
关键词:龙须菜藻红蛋白; 抗肿瘤; 细胞免疫
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08132904
龙须菜 Gr acilar ia lemaneif ormis Webervan
Bosse 是江蓠属红藻。龙须菜在我国已经成为继海
带和紫菜之后的第三大重要养殖藻种, 资源十分丰
富。至今,龙须菜主要用于提取琼胶,民间多用于入
1329 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091203 基金项目:广东省科技计划项目 ( 2007A032600003) ; 汕头市科技计划项目 ( 2006 ! 149)作者简介:陈美珍( 1956 ! ) ,女,副教授,硕士生导师,主要研究方向为天然活性物质研究与开发。
T el: ( 0754) 82902540 Email: chenmz@ s tu. edu. cn
药,很少直接食用。藻红蛋白 ( phycoerythrin) 是
大量存在于龙须菜等红藻中的一种捕光色素蛋白,
由载体蛋白和藻红胆素 (发色团) 组成[ 1]。藻红蛋
白作为新型荧光探针和光敏剂用于生化检测和光动
力学治疗癌症在国内外已得到广泛关注 [ 24] ,但对其
生理活性的研究报道不多。前期研究发现龙须菜藻
红蛋白有体外清除自由基作用[ 5] , 能促使人宫颈癌
HeLa 细胞凋亡,对 HeLa 细胞生长抑制率达 70%
以上[ 6] ;能诱导乳腺癌 MCF7 细胞凋亡 [ 7] , 能提高
实验小鼠机体抗肿瘤、抗氧化、抗突变和免疫能
力[ 89]。为了进一步了解龙须菜藻红蛋白抗肿瘤作
用机制,本实验以 H22荷瘤小鼠为模型, 对藻红蛋白
的抑瘤作用与免疫作用的关系进行研究, 探讨其抗
肿瘤作用的免疫机制, 以期为龙须菜藻红蛋白的开
发应用提供理论依据。
1 材料
1 1 药品与试剂:注射用环磷酰胺 ( CT X, 上海华
联制药有限公司产品) ; RPM I 1640 培养液 ( Gibco
产品)、MTT ( Sangon 产品) ; 小牛血清 (杭州四季
青生物工程材料有限公司产品) ;台盼蓝 ( Sigma 产
品) ; 其余试剂为国产 AR 级。
1 2 细胞株: H22瘤株 (厦门大学抗癌研究中心) ,
L929小鼠成纤维细胞和 HeLa 细胞 (中国科学院
上海生物细胞研究所)。
1 3 实验动物: 昆明种小鼠, 体质量 18~ 22 g , 雌
雄各半 (厦门大学实验动物中心, 合格证号: SCXK
闽 20040001)。
1 4 主要仪器: 5417R 台式高速冷冻离心机 ( Ep
pendorf 公司) ; Shel Lab CO2培养箱; T hermo Lab
systems 酶标仪 ( T hermo 公司) ; SS ! 325全自动灭
菌柜 ( T omy 公司) ; Air T ech 趋净工作台; UV
mini ! 1240 紫外/可见光分光光度计 (岛津公司)。
2 方法
2 1 样品的制备:新鲜龙须菜 (采集于广东汕头南
澳县沿海, KF981 品系, 由汕头大学海洋生物重点
实验室陈伟洲高级工程师鉴定)清洗后切碎, 组织捣
碎机捣碎, 加适量蒸馏水在 4 ∀ 下避光浸泡 2 d, 离
心 ( 3 500 r/ min, 15 min, 4 ∀ ) , 取粉红色上清液,
边搅拌边缓慢加入硫酸铵至终浓度为 45% ,置 4 ∀
下盐析 4 h 后离心, 取沉淀物溶于少量蒸馏水中透
析 48 h 以上,然后低温冷冻干燥,得龙须菜藻红蛋
白样品。
2 2 体内抗肿瘤实验: H 22瘤株在小鼠体内腹水传
代 3次,每次 7 d。在无菌条件下抽取最后 1 次腹
水,用预冷的无菌生理盐水调整细胞浓度至 1 4 #
107 / mL 细胞悬液。小鼠随机分为 6 组, 每组 12
只,分别为龙须菜藻红蛋白低、中、高剂量 ( 100、
200、300 mg/ kg ) 组, CT X ( 20 mg/ kg ) 阳性对照
组,模型组和对照组 (同体积生理盐水)。除对照组
外,各组小鼠右上肢皮下注射 0 2 mL 细胞悬液。
接种 24 h 后开始 ig 给药 ( CTX 组 ip 给药) ,连续
给药 7 d 后处死小鼠,无菌条件下剥取瘤块及脾脏、
胸腺称质量, 计算抑瘤率、脏器指数。
抑瘤率= (模型组瘤质量- 给药组瘤质量 ) /模型组瘤
质量# 100%
脏器指数= 各器官质量/体质量
2 3 对荷瘤小鼠免疫功能的影响
2 3 1 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定:实验小鼠接
种 H 22细胞,并分组给药 7 d (按 2 2方法进行) ,末
次给药后,每只小鼠 ip 5% 鸡红细胞生理盐水悬液
0 5 mL,以文献方法 [ 10]检测荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞
吞噬率。
2 3 2 脾淋巴细胞增殖活性的测定[ 11] :采用 MTT
法测定各组小鼠脾淋巴细胞转化指数。按 2 2方法
分组、造模及给药。给药 7 d 后各组小鼠脱颈椎处
死,无菌取脾, 常规制备脾细胞。将细胞溶于含有
10% 小牛血清的 RPM I 1640 培养液中,调整细胞
浓度为 2 # 106 / mL, 加入 96 孔培养板中, 每孔 200
∀L,再加入 5 ∀L 200 mg/ L ConA 溶液,对照孔加 5
∀L 培养基代替,均设 4个复孔。置 37 ∀ 、5% CO2
培养箱培养 72 h,培养结束前 4 h 取出, 每孔吸出
100 ∀L 上清液, 加入 5 mg/ mL 的 MT T 溶液 20
∀L,继续培养 4 h, 离心弃上清, 每孔加入 150 ∀L,
37 ∀ 预温的 DMSO, 振荡 10 m in,酶标仪测定吸光
度 ( A ) 值, 测定波长 570 nm, 参考波长 630 nm。
计算淋巴细胞增殖率。
增殖率= (给药组 A 值- 对照组 A 值) /对照组 A 值 #
100%
2 3 3 NK 细胞杀伤活性测定[ 1112] : 采用 MT T 法
检测 NK 细胞杀伤活性。同 2 3 2 的方法分组、给
药和制备脾细胞。用 10% 小牛血清的 RPMI 1640
培养液调整细胞浓度至 5 # 107 / mL 作为效应细胞。
取传代培养的 H eLa 细胞作为靶细胞 (调整其细胞
浓度为 1 # 106 / mL)。取靶细胞悬液加入 96 孔板,
每孔 100 ∀L,提前培养 8 h。然后加入 100 ∀L 效应
细胞,效靶比为 50∃ 1,同时设靶细胞对照孔和效应
细胞对照孔, 均设 4 个复孔。置 37 ∀ 、5% CO2培
养箱中培养 4 h,取出后吸去上清液 100 ∀L,再向每
1330 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
孔加入 MT T ( 5 mg/ mL) 20 ∀L 继续孵育 3 h。离
心弃上清, 每孔加入 100 ∀L DMSO, 同 2 3 2 的方
法测定 A 值,计算 NK 细胞杀伤率。
NK 细胞杀伤率= ( A 靶细胞 - A 实验 + A效应细胞 ) / A靶细胞 #
100%
2 3 4 肿瘤坏死因子( TNF)活性的检测 [ 1013] :
利用对 T NF敏感的 L929 细胞作靶细胞, 采用
MT T 法间接检测 TNF的生成量。同 2 3 2 方
法分组、给药和制备脾细胞。以 2 5 g/ L 胰蛋白酶
消化对数生长期的 L929 细胞,收集细胞并用含有
10% 小牛血清的 RPMI 1640 培养基调细胞密度为
1 # 104 / mL, 加入 96孔板中 (每孔 100 ∀L) , 并加入
1 # 106 / mL 效应细胞 100 ∀L,使效靶比为 100∃ 1,
同时设靶细胞和效应细胞对照孔, 均设 4 个复孔。
每孔加入 4 ∀g/ mL 放线菌素 D 溶液 5 ∀L。置
37 ∀ 、CO 2孵箱内继续培养 24 h。弃上清, 用完全
培养基洗涤 3 次, 每孔各加入 20 ∀L 5 mg / mL
MT T 溶液 ( PBS 配制,滤过除菌) , 继续培养 4 h。
培养结束后取出培养板, 吸出液体, 每孔加入 150
∀L DMSO, 同 2 3 2 的方法测定 A 值, 计算杀伤
率,以杀伤率间接表示 TNF活性。
杀伤率= ( A 靶细胞 - A实验 + A效应细胞 ) / A 靶细胞 # 100%
2 4 数据处理: 采用 SPSS 11 0 统计软件进行单
因素方差分析, 数据用 x % s 表示, 组间比较采用 t
检验。
3 结果与分析
3 1 对 H 22荷瘤小鼠肿瘤生长和免疫器官的影响:
在 100~ 300 mg / kg 龙须菜藻红蛋白对小鼠 H 22肿
瘤均有一定的抑制作用 (表 1) , 其中高剂量组对
H22肿瘤的抑效率达到 30 23% ,与模型组比较差异
显著 ( P< 0 05) ,其抑瘤效果与 20 mg/ kg CTX 效
果接近, 但CTX组的胸腺指数和脾脏指数极显著
表 1 龙须菜藻红蛋白对小鼠 H22肿瘤的抑制作用
和免疫器官的影响 (x % s, n= 12)
Table 1 Effect of PE on H22 bearing mice tumor
growth and immune organ (x % s, n= 12)
组 别 剂量/
( mg kg- 1)
肿瘤质量/
g
抑瘤率/
%
胸腺指数/
( mg g- 1)
脾脏指数/
( mg g- 1 )
对照 - - - 3 445 % 1 80 6 077 % 4 81
模型 - 1 32 % 0 17 - 1 853 % 2 40 5 263 % 8 83
龙须菜藻红蛋白 100 1 17 % 0 34 11 94 1 917 % 4 50 5 280 % 6 09
200 1 06 % 0 17 19 79 2 106 % 4 70 5 890 % 7 37
300 0 92 % 0 20* 30 23 2 146 % 6 41 6 099 % 6 22
CTX 20 0 91 % 0 16* 31 10 1 020 % 4 02* * 2 901 % 3 46* *
与模型组比较: * P< 0 05 * * P< 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 vs model gr ou p
减少。虽然各给药组的胸腺指数和脾脏指数增加,
与模型组比较差异不显著, 但均高于模型组,而且高
剂量组的脾脏指数已达到正常水平, 说明龙须菜藻
红蛋白对小鼠荷瘤所引起的免疫器官抑制有保护和
改善作用。
3 2 对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响:见
表 2。与模型组比较, 不同剂量龙须菜藻红蛋白均
能显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞
噬率 ( P< 0 05) ,说明龙须菜藻红蛋白可以促进荷
瘤小鼠巨噬细胞的吞噬活性, 增强机体的非特异性
免疫能力。本实验结果与前期研究的龙须菜藻红蛋
白能极显著地提高正常小鼠巨噬细胞的吞噬率的结
果[ 7] 一致。
表 2 龙须菜藻红蛋白对 H22小鼠细胞免疫功能
及 TNF活性的影响 ( x% s, n= 4)
Table 2 The effect of GPE on H22 bearing mice
cellular immunity and TNF activity
(x % s, n= 4)
组 别
剂量/
( mg kg- 1 )
吞噬率/
%
增殖率 /
%
NK细胞杀伤率/
%
TNF活性/
%
对照 - 38 17 % 365 95 03 % 1123 3805% 12 88 27 84 % 654
模型 - 27 70 % 457 46 95 % 1476 3531% 10 24 30 63 % 796
龙须菜藻红蛋白 100 31 80 % 470* 55 06 % 1506 4738% 13 16* 38 41 % 1025
200 32 11 % 400* 69 79 % 1391* 4786% 6 78* *41 00 % 1279*
300 34 20 % 436* 73 89 % 1269* * 5226% 12 09* *41 18 % 924*
CT X 20 19 20 % 379* 42 05 % 682 3195% 6 39 29 48 % 1033
与模型组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s m odel group
3 3 对脾淋巴细胞增殖能力的影响:给予龙须菜藻
红蛋白的各实验组脾细胞增殖率均明显高于模型组
(表 2) ,其中中剂量组差异显著 ( P< 0 05) ,高剂量
组差异非常显著 ( P< 0 01) ,表明龙须菜藻红蛋白
能够有效促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖活性。
3 4 对 NK 细胞杀伤活性的影响: 由表 2可见,各
实验组 NK 细胞杀伤活性明显高于对照组, 与模型
组比较,中、高剂量组 NK 细胞杀伤活性差异非常
显著 ( P< 0 01) , 低剂量组差异显著 ( P< 0 05) ,说
明龙须菜藻红蛋白具有明显提高荷瘤小鼠 NK 细
胞对靶细胞的细胞毒活性, 增进机体免疫功能。
3 5 对脾淋巴细胞 TNF活性的诱导作用:从表
2中可见, 中、高剂量组 TNF对 L929细胞的杀伤
率明显高于模型组 ( P< 0 05) , 提示龙须菜藻红蛋
白能激活荷瘤小鼠脾细胞分泌 TNF,增强机体对
肿瘤的杀伤力。
4 讨论
机体的免疫与肿瘤的发生、发展密切相关, 当肿
1331 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
瘤细胞侵入机体时, 机体的细胞免疫是重要防御因
素。巨噬细胞的吞噬功能是衡量机体细胞免疫水平
的一个重要标志,是机体细胞免疫清除突变细胞、抑
瘤抗瘤的重要因素。T 淋巴细胞是介导机体细胞免
疫的免疫活性细胞, 在免疫应答全过程中起着重要
的调节、效应作用。但淋巴细胞只有转化为淋巴母
细胞才能发挥免疫调节作用, T 淋巴细胞转化率(增
殖指数)的高低直接反映机体细胞免疫的水平。NK
细胞是细胞免疫中的非特异性成分,不需预先活化
即可直接杀伤肿瘤细胞, 在机体肿瘤非特异免疫中
具有重要作用。TNF则具有直接抑制和杀伤肿
瘤细胞的功能, 且可诱导肿瘤细胞凋亡。因此,研究
上述 3种细胞的活性, 可较好地揭示机体细胞免疫
能力的变化。
在本实验中当小鼠接种了 H 22肿瘤细胞后, 胸
腺指数、脾脏指数、腹腔巨噬细胞的吞噬功能、脾淋
巴细胞的增殖指数均显著低于对照组小鼠。这是因
为小鼠接种肿瘤细胞后, 机体的免疫系统对外来抗
原物质出现应答,但是随着肿瘤的进行性生长,肿瘤
细胞不断的分泌免疫抑制因子, 抑制机体的免疫应
答。同时, 胸腺和脾脏等免疫器官呈现萎缩现象, 免
疫功能受到不同程度的抑制, 使肿瘤细胞能够逃避
机体免疫系统对其的杀伤作用, 有利于肿瘤的发生
和发展,并且随免疫抑制和器官萎缩程度、时间而逐
渐加剧,直至机体死亡。本实验中阳性对照物 CT X
在杀伤肿瘤细胞的同时, 对正常细胞也有很大的毒
性,使荷瘤机体整体免疫功能更加低下, 这将会对肿
瘤的后期治疗造成不利影响。而龙须菜藻红蛋白在
抑制 H 22肿瘤的同时,对荷瘤小鼠脾脏、胸腺具有保
护作用,能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,
对荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖有显著促进作用, 甚
至可使 NK 细胞杀伤活性超过正常小鼠水平, 并能
提高荷瘤小鼠分泌 TN F的能力,增强机体对肿瘤
的杀伤力。本研究结果说明龙须菜藻红蛋白可通过
增强机体的细胞免疫活性和活化免疫细胞分泌细胞
因子而激发 NK 细胞、巨噬细胞或直接刺激巨噬细
胞活化,促进这些细胞对肿瘤细胞的杀伤作用, 这可
能是龙须菜藻红蛋白抗肿瘤效应机制之一。
据报道, 螺旋藻藻蓝蛋白能被肿瘤细胞选择性
吸收到细胞膜中 [ 14]。至于龙须菜藻红蛋白在小鼠
肠道中是否被水解,是以小肽或多肽形式, 还是以整
体分子被选择性吸收到细胞中发挥抑瘤作用和调节
细胞免疫功能,尚需进一步研究。
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