全 文 ：4 4 种间、产地间及不同采收期生物活性比较: 罗文
等[ 12] 为有效控制山楂(果实)药材质量, 建立了 10批
山楂药材的 HPLC指纹图谱。在本实验中,比较不同
山楂叶效价指纹峰的总效价值,可以更客观地反映中
药的质量。如表 3所示,山楂叶、山里红叶、野山楂
叶、单子山楂叶和云南山楂叶的总效价值分析为
1829、14 50、69 92、14 92和 1905。说明其抗 O2
活性大小为:野山楂叶> 云南山楂叶> 山楂叶> 单子
山楂叶山里红叶,结果与实验测得结果一致。
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北柴胡皂苷生物合成途径关键酶 IPPI的全长 cDNA克隆及其序列分析
隋 春1 ,战晴晴1, 2 ,魏建和1* , 陈怀琼1 , 杨成民1 ,郑亭亭1
( 1 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193; 2 东北林业大学生命科学学院,
黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要: 目的 克隆北柴胡皂苷生物合成途径关键酶异戊烯基焦磷酸异构酶( EC 5 3 3 2, isopentenyl dipho sphate
isomerase, IPPI)的全长 cDNA ,为研究柴胡皂苷的生物合成与基因调控奠定基础。方法 PCR 矩阵法快速筛选北
柴胡全长 cDNA 文库。结果 获得了北柴胡 IPPI 的全长 cDNA( GenBank No gq433719) , 其核苷酸序列长 1 117
bp,编码 319 个氨基酸的蛋白。NCBI Blastx 结果显示与胡萝卜 Daucus car ota subsp sativus ( abb52064)的 IPP I
氨基酸序列相似性最高, 一致性为 92% , 相似度为 97%。保守结构域搜索显示含有 IPPI 共有的催化活性位点、金
属结合位点及 Nudix 基序。TargetP1 1和 SignalP3 0 分析表明北柴胡 IPP I N 端含有长 26 bp 的叶绿体信号肽。
结论 首次克隆了北柴胡 IPPI的全长 cDNA , 将促进后续北柴胡 IPP I基因表达特性及其在柴胡皂苷合成代谢中
功能的研究。
关键词:北柴胡; 柴胡皂苷;异戊烯基焦磷酸异构酶( IPP I) ; cDNA 文库; PCR 矩阵法
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1178-07
Ful-l length cDNA cloning and sequence analysis of isopentenyl diphosphate isomerase
involved in saikosaponin biosynthesis pathway of Bup leurum chinense
SU I Chun
1
, ZH AN Qing-qing
1, 2
, WEI Jian-he
1
, CHEN H ua-i qiong
1
,
YANG Cheng-m in1 , ZHENG T ing- t ing 1
( 1 Institut e o f Medicinal P lant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,
Beijing 100193, China; 2 Co llege of L ife Science, Nor theast For estr y Univ ersity , H arbin 150040, China)
1178 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 09-18 基金项目:国家科技支撑计划重点项目( 2006BAI09B01) ;中央级院所长科研基金项目( YZ-1-10)作者简介:隋 春( 1976 ) ,女,吉林敦化人,博士,主要从事药用植物次生代谢方面的研究。
* 通讯作者 魏建和 T el: ( 010) 62818841 E- mai l: w jian h@ 263 net
Abstract: Objective T o clone the ful-l length cDNA encoding isopentenyl diphosphate isomerase gene
( IPPI) associated w ith saikosaponin biosynthesis pathw ay in Bup leur um chinense and to pr ovide the basis
for fur ther studies on biosynthesis and regulat ion of saikosaponin Methods Matrix-based PCR method
w as used to r apidly screen a B chinense ful-l leng th cDN A library Results The ful-l length cDNA o f B
chinense IPPI w as obtained ( GenBank No gq433719) The length of nucleot ide sequence w as 1 117 bp and
an ORF w ith 319 amino acids w as deduced Blastx search show ed it had the highest sim ilarity to the co rre-
sponding protein from Daucus carota subsp sat iv us ( abb52064) w ith 92% ident ity and 97% sim ilar ity
Common conserv ed domains of IPPI w ere found in B chinense IPPI including act ive site, metal binding
site, and Nudix mo tif A 26 bp long chlo roplast signal peptide on the N terminal of the deduced am ino acid
sequence w as predicted by Targ et P 1 1 and Signal P 3 0 Conclusion The ful-l leng th cDNA of B
chinense IPPI is cloned and reported here for the first time T his w ork w ill pr omote the studies on the gene
expr ession pattern and regulatory functions of B chinense IPPI in saikosaponin bio synthesis
Key words: Bup leur um chinense DC ; saikosaponin; isopentenyl dipho sphate isomer ase ( IPPI) g ene;
cDNA librar y; matrix-based PCR method
北柴胡 Bup leur um chinense DC 是药用柴胡
的重要来源之一。具有和解表里, 疏肝, 升阳的功
能。用于感冒发热, 寒热往来,胸胁胀痛,月经不调,
子宫脱垂, 脱肛等疾病的治疗[ 1]。有关北柴胡植株
植物学性状、愈伤组织培养及快繁和种子萌发等方
面的研究较多[ 2~ 4] , 但关于柴胡主要有效成分柴胡
皂苷生物合成途径的分子基础研究比较匮乏, 目前
只有三岛柴胡 B f alcatum皂苷合成途径上游的鲨
烯合成酶 ( squalene synthetase, SS )全长 cDNA 和
其他几个酶的部分 cDNA 得到克隆 [ 5]。另外, 本实
验室也已克隆到了北柴胡皂苷合成途径上游 4个关
键酶的部分 cDNA: 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还
原酶 ( 3-hydro xy-3-methy lglutar yl co enzyme A re-
ductase, HMGR)、异戊烯基焦磷酸异构酶( isopen-
tenyl diphosphate isomerase, IPPI) )、法尼基焦磷酸
合酶 ( farnesyl diphosphate synthase, FPS )和 -香
树脂合酶( beta-amy rin synthase, -AS) [ 6]。
柴胡皂苷属于类异戊二烯化合物, 是由基本的
C5 单元 异戊烯基焦磷酸( isopentenyl dipho s-
phate, IPP)与其烯丙基异构体二甲丙烯基二磷酸
( dimethylallyl diphosphate, DMAPP)缩合后经一
系列催化反应而形成[ 7] 。其中, IPP 和 DMA PP 两
个异构体的相互转化由异戊烯基焦磷酸异构酶( EC
5 3 3 2, isopenteny l diphosphate isomerase, IPPI)
催化。IPPI是类异戊二烯化合物生物合成过程中
的核心酶[ 7] 。多数植物体内存在两种不同亚细胞定
位的 IPPI,是维持不同亚细胞部位 IPP 和 DMAPP
的适当水平所必须的 [ 8, 9]。沉默普通烟草 N icot i-
ana tabacum IPPI 基因的表达会影响到质体内光合
色素的生物合成,导致植株白化[ 8 ]。拟南芥 Ar abi-
dop si s thal iana ( L ) Heynh 两种 IPPI 的缺失突
变体长日照条件下表现矮化和雄性不育, 连续光照
条件下色素的量降低, 单一 IPPI缺失突变体植株表
型正常[ 9] 。
本试验在实验室已构建了盛花期柴胡根的全长
富集 cDNA 文库基础上, 利用 PCR 矩阵法筛选文
库获得了 IPPI 全长 cDNA, 并进行了序列分析, 为
推进 IPPI 在柴胡皂苷生物合成途径中的功能研究
奠定基础。
1 材料与方法
1 1 材料:供筛选的文库为本实验室构建的盛花期
柴胡根全长富集 cDNA 质粒文库。文库采用
SMART 技术建成。连接产物保存于- 80 。经
分析文库库容 1 1 106 , 重组率 93 2%。载体
pBluescript SK, 长 3 0 kb, 插入片段平均长度
1 1 kb [ 10]。使用的大肠杆菌感受态细胞 T op10购
自北京博迈德公司; 96孔菌体培养板及其一次性封
板膜购自北京华大中生公司; PCR 反应使用北京博
迈德公司的 2 Taq PCR M astermix ; PCR仪为 B-i
ometra T GRADIENT96。电泳DNA M ar ker 为大
连宝生物公司的 DL2000。
1 2 方法
1 2 1 cDNA 文库构建连接产物的转化及其滴度
测定:取- 80 保存的 cDNA 文库构建的连接产物
200 L 热激转化大肠杆菌感受态细胞 T op10。每 5
L 连接产物转化 100 L 感受态细胞。混合转化后
的菌液加入到 60 mL LB 液体培养基 (含 60 g/
mL)氨苄青霉素中, 37 、200 r/ m in 摇培至对数生
1179中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
长期后测定其滴度。取培养的菌液进行 10- 4、
10- 5、10- 6、10- 7、10- 8倍数稀释,分别取稀释后的菌
液 200 L 涂布于 LB固体培养基(含 60 g/ mL 氨
苄青霉素)平板上, 37 ,倒置培养过夜。计数每个
平板上的菌落数,绘制菌落数随稀释度变化的曲线,
确定菌液滴度及用于 PCR矩阵筛选的菌液体积。
1 2 2 PCR 矩阵筛选 cDNA 文库: 参考 Munroe
等[ 11]及胡迎春等 [ 12]方法。取以上培养的菌液 4 mL
(相当于文库原始库容的 6倍左右)稀释于含氨苄青
霉素的 LB 液体培养基中, 使其终浓度约为 120 个
重组子/ 100 L 培养基。在 96孔菌体培养板上(每
板留出第 12 列和第 H 行)的 77个孔中各加入 100
L 稀释后的菌液, 37 培养过夜。然后按照每行
及每列从各孔中分别取 10 L 菌液置于对应行及列
的空孔中混匀。最后分别从 PCR板的第 12列和第
H 行各孔中取 10 L 菌液置于第 H12孔。从各板
的 H12孔取 1 L 菌液用于 PCR 扩增。根据扩增
结果从含有阳性克隆的 PCR板的 12列和第 H 行
的各孔中分别取 1 L 菌液再进行 PCR 扩增。有
PCR目标条带的行和列的交叉孔即为阳性克隆所
在的孔。取阳性克隆孔中的菌液进行梯度稀释后涂
布于含抗生素的LB平板, 37 培养过夜后, 选择菌
落分散好的平板,挑取单斑, PCR 扩增, 选择阳性克
隆。如果一定数量单斑的 PCR扩增没有阳性克隆,
可再按照上述方法进行矩阵排列, 重复进行 PCR 扩
增,最终得到阳性克隆单菌落。
1 2 3 PCR 引物设计与合成: 外侧引物为 Kim
等[ 5]发表的引物序列, 由上海生工北京合成部合成。
上游引物 1: 5- CAAATAT AAT TGTCAT CT-
GAT GGAA-3, 下 游 引物 2: 5-CCACCACT-
T VAWCAAGAAATT GTC-3; 内侧巢式 PCR 引
物及阳性对照(北柴胡 IPPI部分 cDNA 重组子)由
本实验室董乐萌提供。上游巢式引物: 5-AGGT-
GACAT TCCCTT TGGTG-3, 下游巢式引物: 5-
AGAAGCT TCCTCT GT GCAGC-3。外侧和内侧
引物扩增产物分别为 532 bp和 118 bp。
1 2 4 PCR扩增体系及其反应条件: PCR 扩增总
反应体系 25 L, 其中 2 PCR mix 12 5 L, 外侧
(或内侧巢式)上、下游引物 10 mol/ L 各 1 L, 菌
液 1 L, 重蒸超纯水 9 5 L。PCR反应条件为 95
预变性 5 min;然后 95 变性 30 s, 49 退火 30
s(巢式引物 PCR 为 55 退火 30 s) , 72 延伸 1
min, 35个循环;最后 72 延伸 10 min。PCR产物
用 1%和 1 5% (巢式引物 PCR)的琼脂糖凝胶电泳
检测。
1 2 5 全长克隆的生物信息学分析:阳性克隆由北
京三博远志公司测序。序列提交至 GenBank。ht-
tp: / / www ncbi nlm nih gov 网站上利用 Blastx
进行 Non-redundant protein sequences( nr)数据库
搜索。利用 DNAMAN 软件分析开放阅读框( Open
Reading Frame, ORF)、氨基酸序列多重比对及最
大似然法( M aximum Likelihood)构建植物 IPPI 分
子亲缘关系树, 同时对亲缘关系树进行 Bootst rap
验证(重复 1 000 次)。利用 T argetP1 1 和 Signal
P3 0[ 13]预测蛋白的亚细胞定位及信号肽序列。
2 结果与分析
2 1 PCR矩阵法筛选获得阳性克隆: 本试验利用
的 cDNA 文库库容 1 1 106 , 共 1 mL 连接产物。
试验中取了 200 L 转化大肠杆菌感受态细胞, 经培
养、滴度测定及稀释后取 1 100 mL 菌液进行矩阵。
首先完成了 15板的菌液排布(涵盖原始库容的 1/
50)。从每板的 H12孔中取菌液进行 PCR扩增,图
1-A和图 1-B分别为外侧和内侧引物扩增结果。可
以确定第 11板为阳性板。进而以此板的第 H 行和
第 12列的各孔菌液为模板, 进行 PCR筛选(图 2)。
其中第 D行和第 10列为阳性, 可以确定 D10孔为
阳性孔。将这一孔内菌液进行密度梯度稀释,从低
密度涂板中随机选择单菌落, PCR 扩增得到了阳性
单克隆。测序结果表明为 IPPI的全长 cDNA。
M-DL2000 DNA Marker 1~ 15-分别为来自 15个菌体培养板 H 12
孔的混合菌液 16-阳性对照
M-DL2000 DNA Marker 1 15-m ixed bacteria in H 12 cells
f rom each of 15 cell culture plates 16- posit ive cont rol
图 1 外侧引物(A)及内侧引物(B)PCR扩增筛选 15 个
菌体培养板结果
Fig 1 PCR Amplification of mixed bacteria from 15 cell
culture plates with outer primers ( A)
and inter nested primers ( B)
2 2 全长克隆的生物信息学分析:所得的阳性单克
隆经正反向测序及序列拼接后表明全长 1 117 bp。
将得到的 cDNA 序列提交至 GenBank。登录号为
gq433719。NCBI blastx 在线搜索显示与胡萝卜
Daucus car ota L subsp sat iv us ( Hof fm . ) Arcang
( abb52064)、番茄Solanum ly cop ersicum L( abx55779)
1180 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
M-DL2000 DNA Marker 1~ 7-分别为阳性板第 12列的 A~ G 孔混
合菌液 8~ 18-分别为阳性板第 H 行的 1~ 11孔混合菌液
19-阳性对照
M-DL2000 DNA Mark er 1 7-m ixed b acteria in A G cell s f rom
the 12th l ine of posit ive plate 8 18- mixed b acteria in 1 11 cell s
from H arrow of posit ive plate 19- posit ive cont rol
图 2 外侧引物( A)及内侧引物( B) PCR扩增筛选阳性
板第 12 列和第 H行每孔结果
Fig 2 PCR Amplification of mixed bacteria from
each cell of 12th arrow and H line in
positive plate with outer primers ( A)
and inter nested primers ( B)
和 葛 藤 Puerar ia montana var lobata ( Willd. )
M aeson& S. A lmeida ( aeq84167)的相似性比较高,
其中一致性分别为 92%、92%和 89%, 相似度分别
为 97%、96%和 94%。DNAMAN软件寻找最大阅
读框表明 cDNA 可翻译成 319个氨基酸的蛋白(图
3)。NCBI 保守域在线查找, 北柴胡 IPPI 含有保守
的催化活性位点、金属结合位点和 Nudix 基序 (图
4)。T ar getP1 1和 SignalP3 0 亚细胞定位和信号
肽序列分析显示 N 端的 1~ 26个氨基酸为蛋白定
位于叶绿体的信号肽(图 3)。氨基酸序列同源性比
较中可以看出不同植物来源的 IPPI N 端有很大差
异,催化部位相似性很高(图 4)。依据 IPPI 氨基酸
序列构建 34种植物 47条蛋白序列(其中 13种植物
中两个 IPPI均有序列可查)的分子亲缘关系树(图
5) 可以看出, 北柴胡 IPPI 与同科植物胡萝卜
( abb 52 06 4) 的IPPI亲缘关系最近, 其次是茶树
图 3 北柴胡 IPPI cDNA序列及其编码蛋白氨基酸序列( TargetP1 1 和 SignalP3 0预测的叶绿体信号肽有下划线
标记; 5-和 3-端非翻译区用小写字母表示)
Fig 3 cDNA Sequence of B chinense IPPI and its deduced amino acid sequence (Chloroplast signal peptide predicted
by Target P1 1 and Signal P3 0 is underlined; 5- and 3-untranslated regions are shown in normal letters)
1181中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
图 4 7种植物 IPPI氨基酸序列比对(催化活性位点、金属结合位点和 Nudix基序分别由# 、* 和 标记出)
Fig 4 Alignment of IPPI amino acid sequences f rom seven plants ( active site, metal binding site,
and Nudix motif are labeled by # , * , and )
Melaleuca al ternif ol ia ( M aiden& Betche ) Cheel
( aa191980)、Clar kia brew eri ( A Gray ) Gr eene
( caa57947)、白杨 Pop ulus tr ichocarp aT orr. & A.
Gray ( xp 002325469)、蓖麻 Ricinus communisL.
( eef47402)及橡胶树 H evea br asi l iensis Mll. A rg
( baf98286和 baf98287)的 IPPI。不同植物来源的
IPPI 长度也有很大差异,主要存在于蛋白的 N 端。
同一种植物的两个 IPPI的亲缘关系表现不同,有些
植物的两个 IPPI相距较近,如橡胶树、拟南芥、玉米
Zea may s L. 及水稻 Or y z a sativa L. 等; 而有些植
物的两个 IPPI相距较远, 如番茄 C br ew er i。这可
能与不同植物中两个 IPPI 的亚细胞定位及功能差
异大小有关。
3 讨论
本试验首次得到了北柴胡皂苷生物合成途径关
键酶 IPPI的全长 cDNA ( gq4 337 19 )。GenBank序
1182 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
图 5 植物 IPPI 分子亲缘关系树(标尺表示遗传距离,数字表示大于 50%的置信度,植物学名后为 GenBank序列号
及序列的氨基酸数目)
Fig 5 Genetic relationship tree of plants IPPI based on amino acid sequences ( ruler represents genetic distance;
Numbers represent conf idence level above 50%; GenBank accession numbers and amino acid numbers are
listed after plants scientific names)
列查询表明目前已登录的柴胡属植物 IPPI 基因序
列只有三岛柴胡和北柴胡的部分 cDNA ( aba01560
及 aby90138) , 分别为 530 bp 和 532 bp[ 5, 6] 。与本
试验得到的北柴胡 IPPI 的核苷酸序列一致性分别
为 98%和 97% ,氨基酸序列一致性分别为 98 87%
和 98 86%, 即都有两个氨基酸的差异, 差异位点均
为 142 位 ( aba01560 及 aby90138 是 丝 氨酸;
gq433719是苏氨酸)和 295 位( aba01560 是甲硫氨
酸; aby90138是异亮氨酸; gq433719是酪氨酸)。由
于多数植物体内存在两种不同亚细胞定位的 IPPI,
因此 aby90138和 gq433719可能分别为北柴胡两个
不同的 IPPI cDNA, 其亚细胞定位及功能还有待进
一步的试验分析。
柴胡皂苷生物合成途径研究是进行柴胡代谢调
控研究与应用的理论基础。IPPI 是合成途径中的
关键酶之一, IPPI 全长 cDNA 的克隆及其生物信息
学分析为后续基因功能研究奠定了基础。本试验筛
选柴胡 cDNA 文库采用的 PCR矩阵法具有快速灵
敏、特异及高效等优点[ 11, 12] , 能为获得其他柴胡功
能基因的 cDNA 序列提供方法学借鉴,也可为其他
药材药效成分合成途径的酶基因克隆提供参考。
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no acid sequence [ J] J Mol B iol , 2000, 300: 1005-1016
披针叶黄华种子中金雀花碱的定性和定量分析
周军辉1 ,李 静2 ,李 静1 ,王答祺1 ,李思锋1*
( 1 陕西省西安植物园 陕西省植物研究所,陕西 西安 710061; 2 陕西省生物医药重点实验室, 陕西 西安 710069)
摘 要:目的 应用 H PLC 和 T LC 建立披针叶黄华种子中金雀花碱的定量和定性分析方法。方法 采用超声提
取的方法获得样品,分别采用 TLC 和 H PLC 对披针叶黄华种子中的金雀花碱进行定性鉴别和定量测定。结果
TLC 采用碱性硅胶为固定相,以苯-丙酮-醋酸乙酯-甲醇( 4 2 1 1)为展开剂, 可清晰检出金雀花碱斑点; H PLC
分析中,金雀花碱在 0 04~ 1 2 mg/ mL 与峰面积呈良好的线性关系。结论 本方法样品处理快速简便, 定性与定
量分析分离效果好,准确、快速、干扰少, 可用于披针叶黄华种子原料和金雀花碱产品的质量控制。
关键词:披针叶黄华种子; 金雀花碱; T LC; H PLC;超声提取
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1184-03
披针叶黄华 T hermop si s lanceolata RBr 又
名牧马豆、野决明,系豆科( Legumino seae)野决明属
( T hermop si s RBr )多年生草本植物, 分布于中国
东北、华北及西北等广大地区,资源丰富。据资料记
载,本种为有毒植物,其主要有效成分金雀花碱( cy-
t isine)对呼吸系统的作用类似烟碱, 能反射性地兴
奋呼吸,是一种临床上用于抗心律失常的生物碱类
药物。近年来, 金雀花碱作为疗效确切的戒烟制剂
原料引起国际医药界的关注, 研究表明, 以金雀花碱
的酒石酸盐为主要成分的戒烟制剂的一年期戒烟有
效率可达 22%,具有可观的发展前景[ 1] 。我国学者
从 20 世纪 70 年代已开始对其化学成分进行研
究[ 2, 3] ,其定量测定有紫外吸收法[ 4] 、原子吸收法 [ 5]
及酸碱滴定法 [ 6] , 本实验采用 TLC 法和 HPLC 法
进行金雀花碱的定性和定量分析,为相关的生产及
检验工作提供实验依据。
1 仪器、药材与试剂
1 1 仪器: Waters 515高效液相色谱仪(包括 Wa-
ter s 515泵, Waters 2487检测器等) , N2000 色谱工
作站; Beckman高效液相色谱系统( 125泵, 168PDA
二极管阵列检测器, 32Kar at 工作站, 美国) , Beck-
man 508自动进样器。天津东康 DS6150 超声波清
洗机(频率为 40 kHz, 功率为 150 W)。
1 2 药材与试剂: 药材共 10 批次, 于 2007 年和
2008年分别在宁夏盐池, 内蒙古自治区阿拉善左
旗、右旗、前旗,新疆哈密、塔城、阿勒泰,陕西榆林,
青海门源、互助彩集成熟的披针叶黄华的种子, 由陕
西省植物研究所王答祺副研究员鉴定, 样本保存于
陕西省植物研究所; 所用金雀花碱对照品购自 Sig-
ma公司, 质量分数在 99% 以上, 药材粉碎后过 40
目筛, 60 干燥 3 h, 密封保存, 待用。HPLC 用甲
醇为色谱纯, 其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2 1 T LC定性鉴别:取披针叶黄华种子药材粉末 2
1184 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 12-13 基金项目:陕西省科学院项目( 2008K-13)作者简介:周军辉( 1978 ) ,男,助理研究员,主要从事天然药物化学分离与分析研究。
T el: ( 029) 85251515 E-mail: zh ou junhui@ sohu com
* 通讯作者 李思锋 T el: ( 029) 85212196 E- mai l: lisf60@ sina com