全 文 ：秦艽细胞悬浮培养研究(
)
齐香君,陈如意,王  薇
(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西 西安  710021)
摘  要:目的  研究碳源、氮源和金属离子对秦艽悬浮细胞生长及龙胆苦苷积累的影响。方法  测定不同浓度蔗
糖和葡萄糖、不同 NH4 + / NO3 - 比及 Ca2+ 、Zn2+ 影响因素下细胞干质量和龙胆苦苷量。结果  有利于秦艽悬浮细
胞生长及龙胆苦苷积累的培养条件为: 3% 蔗糖, NH 4+ / NO 3- 为 20/ 40, 3 mmol/ L Ca2+ , 0
007 49 mmol/ L Zn2+ 。
结论  不同碳源及其浓度对细胞生长及龙胆苦苷积累都有显著影响, 高糖不利于龙胆苦苷的合成。NO3 - 对细胞
生长来说,是一种比 NH 4+ 更好的氮源。Ca2+ 对细胞生长和龙胆苦苷的量都有显著影响, Zn2+ 对细胞生长影响不
明显,对龙胆苦苷量影响显著。
关键词:秦艽; 龙胆苦苷; 悬浮培养; 影响因素
中图分类号: R282
1    文献标识码: A    文章编号: 02532670( 2010) 04063603
Cell suspension culture of Gentiana macrophy lla (
)
Q I Xiangjun, CHEN Ruyi, WANG Wei
( Co lleg e of L ife Science, Shaanx i Univ ersity of Science & Techno log y, Xi!an 710021, China)
Abstract: Objective  To investig ate the effects of carbohydrate and its concentrat ion, nit rog en source,
and metal ions on suspension cell g row th of Gentiana macr ophy lla and gent iopicroside accumulat ion.
Methods  T he cell dry w eight and gent iopicro side content w ere measured under factor s o f dif ferent carbo
hydrate, NH 4 + / NO3 - , Ca2+ , and Zn2+ at various concentrat ion. Results  The opt imum culture condi
t ions are as fol low s: 3% sucrose, NH 4
+
/ NO 3
-
o f 20/ 40, 3 mmol/ L Ca
2+
, 0. 007 49 mmo l/ L Zn
2+
.
Conclusion  Differ ent carbohydrates and their concentr at ion have signif icant effects on cell grow th and
gent iopicroside accumulation w hile high concentr at ion of carbohydrates does not have such ef fect. NO 3 - is
bet ter than NH 4
+
for the cell gr ow th. Ca
2+
Remarkably inf luences bo th cell gr ow th and gent iopicroside
accumulat ion w hile Zn2+ contributes only to g ent iopicr oside content .
Key words: Gentiana macrophy l la Pall. ; g ent iopicroside; suspension culture; inf luential factor
  秦艽 Gentiana macr ophy l la Pall. 主要有效成
分龙胆苦苷具有良好的保肝、健胃、利胆、抗炎、抗菌
等作用 [ 1~ 3]。近年对龙胆苦苷的分析已有报道 [ 4, 5] ,
目前已被开发为滴丸及胶丸等新药上市。但野生秦
艽由于过度采挖临近濒危状态, 栽培品种也因产量
有限,远不能满足市场所需[ 6] 。植物细胞工程是实
现中药资源可持续发展及药用成分工业化生产的有
效手段。目前秦艽细胞及组织培养研究主要集中在
快繁技术[ 7] 、愈伤组织及毛状根诱导 [ 8] ,关于秦艽细
胞的悬浮培养研究还未有报道。本实验在悬浮培养
体系建立基础上,通过秦艽细胞悬浮培养影响因素
研究,优化培养条件,为秦艽细胞悬浮培养工业化生
产龙胆苦苷奠定基础。
1  材料与方法
1
1  试验材料:秦艽细胞系以秦艽叶片诱导的愈伤
组织为原料,通过小细胞团法筛选而得到的细胞系。
龙胆苦苷对照品购自中国药品生物制品检定所, 批
号: 110770200510。
1
2  培养方法:将愈伤组织定量转接到附加 2, 4D
1
0 mg/ L + 6BA 0. 5 mg/ L 的 MS 液体培养基
( MS0 ) 中,于 25 ∀ , 110 r/ min条件下摇床暗培养, 12
d 后筛选生长迅速、较均一的小细胞团定量 ( 4 g/ 100
mL 湿质量) 接种至装有 50 mL 新鲜液体培养基的
100 mL 三角瓶中, 110 r/ min, 25 ∀ 暗培养 28 d。
1
3  悬浮细胞生长的测定: 培养液于 3 850 r/ min
转速下离心 30 min,收集沉淀的细胞,于 100 ∀ 灭
酶 30 min 后 60 ∀ 干燥至恒重, 冷却后称质量,以
每升培养液中细胞干质量为细胞生长的依据, 取 3
#636# 中草药  Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
收稿日期: 20090720                     基金项目:西安市科技局项目 ( YF07118)作者简介:齐香君( 1957 ∃ ) ,女,河南博爱人,陕西科技大学生命科学与工程学院院长,教授,长期从事生物制药, 发酵代谢调控方向的教学、科研工作。T el: ( 029) 86168590  13991368065  Fax : ( 029) 86168293  Em ail: qixj@ su st . edu. cn
次重复的平均值。
1
4  龙胆苦苷定量的测定:精密称取研细的干细胞
1
000 g , 70% 乙醇回流提取 60 min, 滤过,放冷, 定
容至 25 mL, 摇匀, 即得秦艽细胞粗提物, 以 0
45

m 微孔滤膜过滤后用 HPLC 法测定, 采用 SY
4000K (德国 KNAU ER) 高效液相色谱仪, 色谱
柱:化学键合型十八烷基柱 ( SciC18 ) ; 流动相:甲醇
水 ( 20% 80) ; 检测波长: 270 nm;柱温: 室温; 体积流
量: 1 mL/ m in。龙胆苦苷产量以细胞干质量与龙胆
苦苷量的乘积计算, 取 3 次重复的平均值, 单位为
mg/ L。龙胆苦苷对照品和秦艽悬浮细胞提取液色
谱图,见图 1。
图 1 龙胆苦苷对照品 ( A) 和秦艽悬浮细胞提取液 (B)
色谱图
Fig. 1  Chromatograms of gentiopicroside reference
substance ( A) and extracts of suspension
cells (B) of G. macrop hy lla
2  结果
2
1  不同碳源及其质量浓度对秦艽悬浮细胞生长
及龙胆苦苷积累的影响: 本试验考察了 2%、3%、
4%、5% 的蔗糖和葡萄糖两种碳源对秦艽悬浮细胞
生长及龙胆苦苷积累的影响, 结果见图 2。蔗糖为
碳源时细胞生长量都明显高于葡萄糖, 且蔗糖质量
浓度为 4% 时细胞生物量 ( 10
97 g/ L ) 最大。对
于龙胆苦苷量, 2% 的蔗糖和葡萄糖相当, 其余质量
浓度都以蔗糖为碳源时龙胆苦苷量高, 当蔗糖为
3% 时量达到最高,为 0
492 mg / g。以龙胆苦苷产
量为指标, 3% 的蔗糖是本试验体系的最佳蔗糖质
量浓度。两种碳源下,高糖都对细胞生长有利,但抑
制龙胆苦苷合成。可能一方面高的糖质量浓度能供
给细胞足够的能量, 促进细胞的生长,但另一方面高
糖引起高渗透压,影响细胞对培养液中其他营养成
分的吸收,高渗环境还能引起细胞中含水量的降低,
从而影响某些代谢功能的正常作用。蔗糖与葡萄糖
对秦艽悬浮细胞生长及龙胆苦苷积累的显著差异可
能还与细胞利用糖的方式有关, 此结果提示有必要
深入探索糖对龙胆苦苷代谢的影响。
2
2  不同 NH 4 + / NO 3 - 比对秦艽悬浮细胞生长的
影响:植物细胞中的含氮化合物都直接或间接来源
* P < 0
05  * * P < 0
01
图 2  不同碳源及浓度对秦艽悬浮细胞生长及龙胆苦苷
积累的影响
Fig. 2  Effects of dif ferent carbohydrates and their concen
tration on cell growth and gentiopicroside accumu
lation in suspension cell of G. macrophylla
于培养基中的氮源, 且由于植物细胞对铵态氮和硝
态氮的耐受性和吸收机制不同, 它们对植物细胞影
响是不同的。本试验在保持培养基中总氮源为 60
mmol/ L 不变的情况下, 调整铵态氮 ( NH 4 + )、硝态
氮 ( NO 3 - ) 比例分别为 60/ 0、30/ 30、20/ 40、15/ 45、
0/ 60 后,研究了其对细胞生长的影响, 结果见图 3。
不同的 NH 4 + / NO 3 - 对细胞的生长影响是极显著
的 ( P< 0
01)。硝态氮 ( N O3 - ) 对秦艽悬浮细胞
生长来说, 是一种远比铵态氮 ( NH 4 + ) 要好的氮
源。当 NH 4 + / NO 3 - 为 20/ 40、15/ 45、0/ 60 时, 秦
艽细胞的生长量显著高于其他比例的,其中以 20/
40时生物量最高为 10
65 g/ L。秦艽悬浮细胞在高
NH 4 + 浓度的培养基中生长缓慢, 而在高 NO 3 - 浓
度下均生长较好。在侯学文 [ 9]玫瑰茄的悬浮培养中
也有类似现象。植物吸收的硝酸盐必须同化为氨态
氮后才能被利用,而植物吸收的氨态氮 (或由硝酸
盐还原产生的氨态氮) 必须迅速同化为有机物。因
高浓度的氨态氮能使光合磷酸化或氧化碳酸化解偶
联,并能抑制光合作用中水的光解, 对植物是有害
的[ 1 0, 11]。本试验中 NH 4 + / NO 3 - 为 60/ 0、20/ 40、0/
60 比较,可知在秦艽悬浮细胞中,硝态氮的同化过
程可能对氨态氮的同化有一定的协调作用,能促进
其转化为有机物或是一定程度地解除了其毒害作
用,而使细胞生长较好。
2
3  金属离子对秦艽悬浮细胞生长及龙胆苦苷积
累的影响
2
3
1  钙离子的影响: 本试验在保持 MS0培养基
中其他成分不变时,分别调节钙离子浓度为 0、1
5、
3、6、9 mmol/ L ,研究其对细胞生长及龙胆苦苷积累
#637#中草药  Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
图 3 不同 NH4 + / NO3- 比对秦艽细胞生长的影响
Fig. 3 Effects of different ratios of NH4 + / NO3-
on cell growth of G. macrophylla
的影响, 结果见表 1。Ca2+ 浓度对秦艽细胞的生长
和龙胆苦苷量都具有非常显著 ( P< 0
01) 影响, 当
Ca2+ 浓度为 6 mmol/ L 时,细胞生长量最大, 但是龙
胆苦苷的量却在 Ca2+ 浓度为 3 mmo l/ L (与 MS 培
养基同浓度) 时最高。从龙胆苦苷的产量来看, 3
mmo l/ L 是最适合的 Ca2 + 浓度,在其处理下龙胆苦
苷产量为 4
264 mg / L ,是不加 Ca2+ 时的 1
6倍, 此
结果显示 Ca2+ 对龙胆苦苷的积累有积极的作用, 但
过高的 Ca2+ 浓度对龙胆苦苷的生产不利。
表 1  钙离子对秦艽悬浮细胞生长及龙胆苦苷积累的影响
(n= 3)
Table 1 Effects of Ca2+ on cell growth and gentio
picroside accumulation in suspension cell
of G. macrophylla ( n= 3)
Ca2+ 浓度/
( mmol# L - 1)
细胞干质量/
( g # L- 1 )
龙胆苦苷量/
( & 10- 2 mg # g- 1 )
龙胆苦苷产量/
( & 10- 1 mg # L- 1 )
0 7
26 ∋ 0
16 36
71 ∋ 1
06 26
66∋ 1
11
1
5 7
98 ∋ 0
25 35
41 ∋ 1
04 28
25∋ 0
92
3 8
67 ∋ 0
48 49
20 ∋ 0
91 42
64∋ 1
82
6 9
65 ∋ 0
36 40
82 ∋ 0
97 39
38∋ 0
53
9 5
39 ∋ 0
28 47
80 ∋ 0
96 25
76∋ 1
63
2
3
2  锌离子的影响:分别将秦艽细胞接种到锌离
子浓度为 0、7
49、15
0、22
5、30
0
mol/ L 的 MS0
液体培养基中, 28 d 后收获,其结果见表 2。
  由表中数据单因素方差分析可知, Zn2+ 浓度对
细胞生长影响不明显, 对龙胆苦苷量影响较显著
( P< 0
01)。细胞中龙胆苦苷量在 Zn2+ 浓度为
7
49
mo l/ L 时达到最高, 为 0
249 mg/ g , 此后随
Zn2+ 浓度升高, 龙胆苦苷量逐渐下降,这可能与锌离
子参与细胞某些代谢活动有关,其对龙胆苦苷积累的
调节机制还需进一步研究。从龙胆苦苷产量来看,
Zn2+ 浓度为 7
49
mol/ L 时最大,为 2
905 mg/ L。
表 2 锌离子对秦艽悬浮细胞生长及龙胆苦苷积累的影响
( n= 3)
Table 2  Ef fects of Zn2+ on cell growth and gentiopi
croside accumulation in suspension cell of G.
macrophylla ( n= 3)
Zn2+ 浓度/
(
mol# L- 1 )
细胞干质量/
( g# L - 1)
龙胆苦苷量/
( & 10- 2 mg# g - 1)
龙胆苦苷产量/
( & 10- 1 mg# L - 1)
0 10
88 ∋ 0
64 22
89∋ 1
05 24
90 ∋ 2
26
7
49 11
69 ∋ 0
38 24
86∋ 1
02 29
05 ∋ 2
09
15
0 11
42 ∋ 0
35 24
80∋ 1
00 28
33 ∋ 1
13
22
50 12
20 ∋ 0
41 22
61∋ 1
04 27
17 ∋ 1
14
30
00 11
68 ∋ 0
28 19
19∋ 0
30 22
41 ∋ 0
87
3  讨论
  在秦艽细胞悬浮培养中,不同碳源及其浓度对
细胞生长及龙胆苦苷积累都有显著影响, 高糖不利
于龙胆苦苷的合成, 3% 蔗糖是较优的碳源。硝态
氮 ( N O3 - ) 对细胞生长来说, 是一种比铵态氮
( NH 4
+
) 更好的氮源, 最优 NH 4 + / NO 3 - 比为 20/
40。Ca2+ 对细胞生长和龙胆苦苷量都有显著影响,
Zn2+ 对细胞生长影响不明显,对龙胆苦苷量影响显
著,较优浓度分别为 3 mmol/ L 和 7
49
mol/ L。
在试验过程中还发现秦艽悬浮细胞随在液体培养基
中继代次数的增加,龙胆苦苷积累逐渐降低,连续 4
次继代后几乎检测不到龙胆苦苷的量, 提示需对秦
艽悬浮细胞中龙胆苦苷稳定性及细胞遗传稳定性作
深入研究。
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