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白杨素提高肿瘤坏死因子
诱导肝癌细胞 HepG2 凋亡能力的研究
李
欣1 ,王剑宁2 ,熊习昆1 ,陈美芬1 ,古梅英1 , 杨
颖1 ,王凤岩1 ,杨杏芬1 ,黄俊明1 *
( 1
广东省疾病预防控制中心 毒理所, 广东 广州
510300; 2
中山大学光华口腔医学院
附属口腔医院 口腔颌面外科, 广东 广州
510055)
摘
要:目的
研究白杨素提高肿瘤坏死因子
( TNF
)诱导肝癌细胞 H epG2 凋亡的能力, 并对其分子机制进行
初步探讨。方法
白杨素以不同浓度 ( 10、20、40 mol/ L ) 单独或联合 T NF
( 10 ng/ mL ) 处理 H epG2 细胞后, 于
普通及荧光倒置显微镜下观察细胞形态变化,获得细胞死亡的定性资料; 流式细胞术检测 subG1 峰,分析峰值变
化规律,获得细胞死亡的定量资料; 并以 Western blotting 方法检测凋亡标志蛋白 caspase3、caspase8 和 PARP 原
蛋白和相应的裂解产物的变化情况及凋亡抑制蛋白 BclxL、cIAPs、x IAP、cFLIP 的时间效应变化规律。结果
形
态学观察可发现白杨素联合 TNF
处理 H epG2 细胞后, 与对照组比较细胞出现明显的死亡数量增加, 而单独白
杨素组、TNF
组与对照组比较则未观察到明显的细胞减少 (P> 0
05) ;流式细胞术分析 subG1 的定量资料也支
持这一结果,联合处理组 subG1 值随着白杨素剂量增加而增大,最高达到 ( 27
84 ! 0
54) % ,与对照组比较有显著
差异 ( P< 0
05) , H ochest 33342 荧光染色在联合处理组可观察到明显的核固缩细胞增加; Western blott ing 检测到
凋亡标志蛋白 caspase3、caspase8 和 PARP 原蛋白减少、相应的活化裂解片段出现;全 caspase 酶抑制剂 zVAD
fmk 可有效抑制联合处理组 H epG2 细胞死亡、subG1 峰消失比值减少, 阻止凋亡标志蛋白 caspase3、caspase8 和
PARP 的活化降解; TNF
引起的凋亡抑制蛋白 cFL IP1 表达量增加, 随联合处理时间延长而明显下调,与对照组
比较有明显差异, BclxL、x IAP 等其他凋亡抑制蛋白没有明显改变。结论
白杨素能够有效提高 T NF
诱导
HepG2 细胞凋亡的能力, NF B 调节的凋亡抑制蛋白 cFLIP1 表达减少是其重要的分子机制。
关键词:白杨素; 肿瘤坏死因子 ( T NF
) ; 细胞凋亡
中图分类号: R286
91


文献标识码: A


文章编号: 02532670( 2010) 11182807
Acceleration of chrysin on apoptosis of hepatoma cell lines HepG2 induced by TNF

LI Xin
1
, WANG Jianning2 , XIONG Xikun1 , CHEN M eifen1 , GU M eiying1 ,
YANG Ying
1
, WANG Fengyan1 , YANG Xingfen1 , HUANG Junming1
( 1
I nstit ute o f Tox icolog y, Center fo r D isease Contro l and Prevention of Guangdong Province, Guang zhou 510300, China;
2. Oral and Maxillofacial Sur ger y, Guanghua School of Stomatolog y, H ospital of Stomat olo g y,
Sun Yatsen Univ ersity , Guang zhou 510055, China)
Abstract: Objective
T o research whether chrysin can sensit ize the cell death of hepatoma ( HepG2)
cell lines induced by TNF
and explore the molecular mechanism of this sensit izat ion. Methods
HepG2
Cells w ere pret reated w ith designed dose of chry sin ( 10, 20, and 40 mo l/ L ) fo r 2 h, then fol low ed
TNF
( 10 ng/ mL) for 24 h, the morpholog ic changes w ere obser ved under inversed m icroscope and the
percentag e of subG1 was measured using f low cytometry , the proprotein and cleavage o f caspase3,
∀1828∀ 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100312





















基金项目:广东省自然科学基金资助项目 ( 9151030003000004) ; 广东省中医药强省科研立项资助项目 ( 2009431)作者简介:李
欣( 1973 # ) ,女,副主任医师,医学硕士,研究方向为天然产物的生物学活性。
* 通讯作者
黄俊明
T el: ( 020) 84452254
Email: lixinsm@ gmail. com
caspase8, and PARP, r eg ar ded as the protein mark of apoptosis induced by TNF
, w ere determined by
Wester n blo tt ing; After treat ing w ith chrysin for differ ent times, the t ime course of apoptosis inhibitory
pro tein, such as BclxL, and cIA Ps, xIAP, and cFLIP, w ere also detected using Wester n blot t ing. Results
The cell death increasing w as observed in the g roup w ith combinat ion of chry sin and TNF
, but no obvi
ous cell death could be found in chr ysin, T NF
alone, and control g roups. T he data of subG1 suppo rted
this result that, w ith the enhancement of pretreatment dose of chrysin, the percentage o f subG1 reached
( 27. 84 ! 0. 54 ) %. T here w as significant dif ference betw een the combined g roup and the contr ol one
( 1. 52 ! 0. 13) % ( P < 0
05) and obvious do sedependent ef fect could be found. But the percentages of
subG1 in chrysin and TNF
alone g roups w ere all under 5% , and there w ere no signif icant differences
compared to the contro l g roup ( P> 0
05) . Chromat in condensat ion w hich w as the indicat ion o f apoptosis
could be observed when the cells w ere stained by Hochest 33342; The proprotein of caspase3、caspase8,
and PARP deg raded, their cleavage appeared, and there were dosedependent effects; T he pancaspase
inhibitor zVADfmk could inhibit the apoptosis of HepG2 cells w hich w ere t reated w ith the combination of
chrysin and T NF
, acco rding to the percentag e of subG1 and the act ivat ion of caspase3, caspase8, and
PARP; The apoptosis inhibitory pr otein cFLIPL could be observ ed the downregulat ion compared to the
control gr oup in a t imedependent w ay. Other inhibitor y protein, such as BclxL , x IAP did not change to o
much. Conclusion
Chrysin could acceler ate the apopto sis induced by T NF
, the dow nr egulat ion of
apoptosis inhibitory protein cFLIPL, w hich is regulated by NF B and augmented by TNF
, and plays an
impo rtant ro le in the acceleration o f apoptosis.
Key words: chry sin; tumor necrosis factor ( T NF) ; apoptosis


肿瘤坏死因子 ( tumo r necrosis factor, T NF)
是具有广泛生物功能的前炎性细胞因子。T NF

与细胞膜表面受体 ( TNFR1) 结合后 TRADD
( TNFR1 associated death domain pro tein) 形成
TNFR1/ TRADD 复合体, 该复合体∃招募%一系列
相关蛋白,引发不同的下游信号通路: 招募 FADD
( fas associated death domain protein ) 激 活
caspase8 (属于 ICE/ CED3半胱氨酸蛋白酶家族) ,
进而活化 caspase3, 通过级联放大反应,诱导细胞
凋亡;另一方面招募 RIP ( r eceptorinter act ing pro
tein) 和 T RAF2 ( TNFR associated factor 2) 激活
核转录因子 ( NF B) , NF B 通过调节系列凋亡抑
制基因, 如 BclxL、cIAPs、xIAP、cFLIP[ 1] 表达凋
亡抑制蛋白来调控细胞凋亡[ 2]。所以 TNF
信号
途径既可促进细胞存活又可诱导细胞死亡, 十分复
杂。在大部分细胞, T NF
与受体结合后同时活化
两种途径,在细胞死亡与细胞存活间保持平衡,但多
以 NF B 调节的各种功能为主要表现 [ 23] , 所以并
不会出现明显增加的肿瘤细胞死亡。发挥 T NF

抗肿瘤活性、提高 TN F
诱导细胞凋亡能力, 抑制
或阻断 NF B 信号途径是关键 [ 23]。
白杨素 ( chr ysin) 是黄芩、蜂蜜及蜂胶中的一
种黄酮类物质, 化学名 5, 7二羟黄酮 ( 5, 7
dihydr oxy flav one)。虽然分子机制尚不明确, 但近
年在动物试验和体外研究中均观察到白杨素及其衍
生物具有一定的肿瘤预防[ 4] 和抑制肿瘤细胞生长、
诱导肿瘤细胞凋亡的作用 [ 510]。近期在白杨素抗炎
作用研究中发现: 白杨素在拮抗脂多糖 ( LPS) 刺激
的炎性反应时抑制了 NF B 活性[ 910] 。如果将白
杨素以小剂量甚至食用量与 T NF
联合应用,发挥
白杨素抑制 NF B 途径的作用, 表现 T NF
促进
凋亡的作用,则既能保持白杨素天然优势,又可有效
增强 T NF
抗肿瘤活性,为中西医结合防治肿瘤开
拓新的思路。本研究拟在细胞和分子水平,探讨白
杨素能否辅助提高 T NF
诱导肝癌细胞 HepG2
凋亡的能力,并对其机制进行初步探讨。
1
材料
1
1
药物与试剂: 白杨素、荧光染料碘化丙啶
( P I )、二甲基亚砜 ( DMSO ) 和 RNase A 购于
Sigma 公司;人重组 TNF
购于 R& D 公司 (溶于
1% 牛血清白蛋白, 配成 100 g/ mL 的储存液待
用) ;全半胱氨酸蛋白酶 ( caspase) 抑制剂 zVAD
fmk 购于 Bio M ol 公司; 抗 caspase3 抗体购于
Calbio chem 公司; 抗 BclxL 抗体购于 Cell Signa
ling Technolo gy 公司; 抗 xIAP、抗 cIAP2 和抗
poly ( ADPr ibose) polymerase ( PARP) 抗体购于
BD公司 ( San Diego, CA) ; 抗 cIAP1和抗 tubulin
抗体购于 Santa Cruz 生物技术公司 ( Santa Cr uz,
CA) ;抗 cFILP 抗体购于 A lex is,抗 caspase8 抗体
购于 Pharmingen 公司; SDSPAGE、PVDF 膜购于
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第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
BioRad;化学显色试剂购于 Thermo Scient if ic。
1
2
主要仪器:奥林巴斯荧光倒置相差显微镜, 流
式细 胞仪, FACS 公司, Kodak Image Stat ion
440CF。
2
方法
2
1
细胞及培养条件: 人肝癌细胞 HepG2 来源于
美国 ATCC,细胞培养基 DMEM 购自 Sigma 公司,
10% 新生小牛血清 ( FBS) 和青、链霉素, 37 & 、5%
CO 2、饱和湿度条件下进行单层培养、传代, 取指数
生长期细胞进行实验。
2
2
样品制备及细胞处理:白杨素以 DMSO 配制
为 20 mmol/ L 储备液,使用时再以培养基稀释为应
用液,以 10、20、40 mol/ L 单独或提前 2 h 预处理
后联合 T NF
( 10 ng/ mL) 处理 HepG2,根据检测
需要收获细胞。
2
3
细胞形态学观察: 根据设计剂量以白杨素
( 10、20、40 mo l/ L ) 单独或联合 TNF
( 5、10、20
ng / mL) 处理细胞 24 h 后,于普通倒置显微镜下进
行观察,根据形态改变筛选白杨素和 TNF
单独作
用不出现明显的细胞死亡, 而联合使用后细胞数量
明显减少、死亡细胞明显增加的联合剂量组; 在试验
观察终点以 H ochest 33342 荧光染料 ( 50 g/ mL)
对细胞染色,荧光倒置显微镜下初步分析细胞死亡
类型,获得定性资料并作为以下机制研究的基础。
2
4
流式细胞术检测:收集经不同处理的试验组和
未做任何处理组 H epG2 细胞,离心 ( 1 000 r/ m in,
10 min) , 弃上清, 冷 PBS ( pH 7. 0~ 7. 4) 漂洗 2
次,离心 ( 1 000 r/ min, 5 min) ,以去除细胞碎片, 加
0
5 mL PBS 充分吹打,细胞数调整在 1 ∋ 109 / L, 直
接加入 0
5 mL 冰冷的 70% 乙醇中, 4 & 冰箱保存
(可保存 1~ 2 周)。将制备好的单细胞悬液固定液
弃去 ( 1 000 r/ min, 10 min) , 冷 PBS 漂洗 2 次
( 10 000 r/ min, 5 min) ,调整细胞为 1 ∋ 109 / L ,加入
PI染液 1
0 mL ( 0. 1% Triton X100, RNase A 0. 2
mg/ mL, PI 20 g/ mL) ,置于 4 & 冰箱,染色 30 min
后,流式细胞仪进行分析,数据由 Cell Quest 软件收
集、贮存和分析,获得 subG1细胞死亡的定量资料。
2
5
Western blot ting 分析蛋白表达: 收集经不同
处理的试验组和未做任何处理组 HepG2 细胞, 以
蛋白裂解液[ 50 mmol/ L TrisHCl, pH 7. 4, 1%
NP40, 0. 25% sodium deoxycholate, 150 mmol/ L
NaCl, 1 mmol/ L EGTA, 1 mmo l/ L PM SF, 1
mmo l/ L Na3VO 4 , 1 mmol/ L NaF 和 protease in
hibito r cocktail ( Roche) ]提取蛋白质,定量后 SDS
PAGE 分离。转膜后先后与 1% 脱脂奶粉、一抗、
过氧化物酶偶联的二抗孵育,化学发光试剂曝光,用
Kodak 图 像 分 析 系 统 对 PARP、caspase8、
caspase3、cFLIP、cIAP1、cIAP2、xIAP、BclxL 进
行比较分析,实验重复 3次。
2
6
统计学处理:采用 SPSS 11
0 统计分析软件,
组间两两比较采用 oneway ANOVA 方法进行分
析,结果用 x ! s 表示。
3
结果
3
1
白杨素对 T NF
诱导 HepG2 细胞死亡的
影响
3
1
1
形态学观察: 结果见图 1。以白杨素 ( 10、
20、40 mol/ L ) 单独或联合 TNF
( 5、10、20、40
ng/ mL) 处理 HepG2 细胞,在普通倒置显微镜下观
察细胞形态变化和死亡情况,初步筛选 TNF
单独
作用不出现明显细胞死亡的最大剂量 10 ng/ mL 作
为以下各试验中 T NF
的使用剂量。各种质量浓
度白杨素预处理 2 h 后联合 TNF
共同处理 24 h
后,观察到白杨素 40 mol/ L 联合 10 ng/ mL TNF

组 HepG2细胞死亡数量明显增加,而对照组、白杨素
和 TNF
单独作用组没有明显的细胞死亡现象。
图 1
形态学观察白杨素预处理对 TNF
诱导的
HepG2 细胞死亡的影响
Fig. 1
Inf luence of chrysin pretreatment on HepG2
cell death induced by TNF

3
1
2
流式细胞术检测 subG1 改变: 以不同浓度
白杨素 ( 10、20、40 mol/ L) 单独或联合 TNF
10
ng/ mL 处理 HepG2 细胞, 于 24 h 收获细胞,流式
细胞术检测在 DNA 的 G 1峰前的亚二倍体峰 ( sub
G1 峰 )。白杨素 ( 40 mol/ L ) 预处理 2 h 后
T NF
( 10 ng/ mL) 处理 24 h 后 HepG2细胞 sub
G1明显增高,而对照组、白杨素和 T NF
单独处理
组则没有明显改变 (图 2A)。同时对 subG1 峰进
行定量分析表明, 白杨素与 T NF
联合处理组随着
白杨素浓度增加, subG1 峰比例显著增加, 有明显
的剂量反应关系; 当白杨素达到 40 mol/ L 时,
T NF
诱导的 HepG2 细胞 subG1 峰比例已达到
( 27
84 ! 0
54) % ,而对照组仅为 ( 1
52 ! 0
13) %,
差异有统计学意义 ( P< 0
05) (图 2B)。
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3
2
白杨素增强 TNF
诱导的 HepG2 细胞死亡
为细胞凋亡
3
2
1
白杨素联合 TNF
处理 HepG2 细胞后细
胞形态的改变: 凋亡中晚期染色质在局部区域凝集,
固缩,继而核碎裂出现凋亡小体。在 Hoechst 染色
下,细胞核或者凋亡小体内的 DNA 会呈现蓝色的
致密浓染或者碎块状致密浓染,白杨素 40 mol/ L
预处理 2 h 后联合 TN F
10 ng/ mL 共同处理 24
h 后,可见联合处理组浓染的凋亡细胞明显增加,而
对照组和单独的白杨素、TNF
组未见明显改变
(图 3A)。计数 200 个细胞中的凋亡细胞数,计算
凋亡细胞率,联合处理组的细胞凋亡率达 ( 55
50 !
4
50) % ,对照组为 ( 3
00 ! 1
32) %, 差异有统计学
意义 (图 3B)。
与对照组比较: * P < 0
05
* P < 0
05 v s cont rol group
图 2
流式细胞术检测 subG1 结果
Fig. 2
Results of subG1 detected by flow cytometry
与对照组比较: * P < 0
05
* P < 0
05 v s cont rol group
图 3
Hochest 33342 染色后荧光显微镜下观察白杨素预处理对 TNF
诱导的 HepG2 细胞凋亡的影响
Fig. 3
After staining by Hochest 33342 influences of chrysin pretreatment on apoptosis of HepG2 induced by TNF

3
2
2
白杨素联合 TNF
处理 HepG2 细胞对凋
亡标志蛋白的影响: 对 caspase3、caspase8 和
PARP 原蛋白及其裂解产物进行 Western blot ting
检测分析, TNF
( 10 ng/ mL) 固定剂量下, 可观察
到随着预处理白杨素剂量 ( 10、20、40 mol/ L ) 的
增加, PARP ( 116 000 )、caspase8 ( 57 000 ) 和
caspase3 ( 30 000) 原蛋白逐渐减少,而相应的降解产
物 PARP ( 87 000)、caspase8 ( 43 000、41 000、17 000)
明显增加,并有一定的剂量依赖性。Caspase3 的降
解产物难于观察, tubulin 作为内参。对照组和单独
的白杨素、TNF
组未见明显改变(图 4)。
图 4
联合白杨素和 TNF
处理 HepG2 细胞对
凋亡标志蛋白的影响
Fig. 4
Ef fects of combination of chrysin and TNF

on protein marks of apoptosis in HepG2 cells
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3
2
3
caspase 抑制剂 zVADfmk 对白杨素联合
TNF
诱导的 H epG2 细胞凋亡的影响: 作为全
caspase 酶的抑制剂 zVADfmk 能阻止包括
caspase3、caspase8 在内的所有 caspase 家族的活
化裂解, 从而阻断凋亡的信号途径, 抑制凋亡。
zVADfmk ( 50 mol/ L) 预处理 30 min可观察到白
杨素 ( 40 mol/ L ) 联合 TNF
( 10 ng/ mL) 处理引起
的细胞凋亡明显受到抑制, subG1峰显著降低 (图 5
A) ,使用 zVADfmk 后联合处理组的 subG1 峰比
例有显著差异 ( P< 0
05) (图 5B) ; Western blotting
检测 PARP、caspase8和 caspase3原蛋白不再降解,
PARP、caspase8没有裂解产物的出现 (图 4)。
3
3
白杨素联合 T NF
处理 H epG2 细胞对凋亡
抑制蛋白表达的影响: 以白杨素 ( 40 mol/ L ) 预处
理细胞 2 h 后联合 T NF
( 10 ng / mL) 再分别处理
细胞 6、12、18、24 h 后分别收集细胞, 提取蛋白,
Western blot t ing 检测 NF B调节的系列凋亡抑制
蛋白: BclxL、cIAPs、xIAP、cFLIP 的表达变化情
况。在 T NF
单独处理组各种凋亡抑制蛋白在各
个时间点均出现明显的表达量增加; 而白杨素预处
理后, T NF
引起的凋亡抑制蛋白 cFLIP1 和
cIAP2 的高表达明显受到抑制,联合处理时间越长
下调作用越明显, 并有可重复性。BclxL、x IAP 等
其他凋亡抑制蛋白没有明显的改变(图 6)。
与白杨素联合 T NF
组比较: # P < 0
05
# P< 0
05 v s combinat ion of chrysin and TNF
group
图 5
全 caspase 酶抑制剂 zVADfmk对白杨素联合 TNF
诱导的 HepG2 细胞死亡的影响
Fig. 5
Inf luences of pancapase inhibitor, zVADfmk, on apoptosis of HepG2 cells induced
by combination of chrysin and TNF

图6
白杨素预处理后对 NF B调控的凋亡抑制蛋白表达影响
Fig. 6
Inf luences of chrysin pretreatment on expression
of antiapoptotic protein regulated by NF B
4
讨论


肝脏肿瘤是常见的恶性肿瘤,各种形式的化疗
在肝癌的综合治疗中都有广泛应用,但全身化疗的
疗效并不理想, 不良反应大, 单药有效率< 20% ;原
发性肝癌先天性高表达多药耐药基因, 对化疗不敏
感,所以目前对肝癌的化疗多提倡联合用药。本研
究选择肝癌细胞 HepG2 为研究对象, 探讨中药活
性成分白杨素是否能够提高 T NF
诱导 HepG2
细胞凋亡的能力,辅助提高 T NF
抗肿瘤作用, 并
初步分析其分子机制, 希望为肝肿瘤的联合化疗提
供新思路。
黄酮是一种天然多酚类物质,广泛分布于水果、
蔬菜等植物中。近年研究已发现槲皮素、茶多酚、木
犀草素[ 1112] 等多种黄酮类物质具有化疗增敏作用,
在抗肿瘤药的临床研究中,可作为一种潜在的辅助
治疗药[ 13] 。食物中的天然成分用于肿瘤辅助治疗,
既传承了祖国医学食疗的理念, 又因来源丰富、安全
健康、应用方便等优势成为发掘新的化疗增敏剂的
∀1832∀ 中草药
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第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
理想来源。本研究明显观察到白杨素可增加
TNF
诱导的 HepG2 细胞死亡数量, 流式细胞术
分析可见 40 mol/ L 白杨素处理后联合 T NF

组, subG1 峰可达到 ( 27
84 ! 0
54) %, 而对照组
仅为 ( 1
52 ! 0
13) % ,并有明显的剂量效应关系;
而单独的白杨素和 T NF
并未引起 HepG2 细胞
死亡数量增加。有研究认为 TNF
引起的细胞死
亡根据细胞种类的不同可以是凋亡也可以是坏
死[ 14] , 而流式细胞术检测的 subG1 峰所代表的细
胞死亡既可以是凋亡又可以是坏死 [ 15] , 所以为明确
白杨素联合 TNF
诱导的细胞死亡的性质,首先以
荧光染色识别凋亡细胞标志性的核固缩浓染, 获得
HepG2 细胞凋亡的初步的形态学证据, 然后用
Wester n blo tt ing 技术在分子水平进一步寻找支
持。Western blo tt ing 蛋白分析 caspase3 活化降
解、PARP 原蛋白减少出现裂解产物, 这一结果证明
白杨素增强的 TNF
诱导的细胞死亡是 caspase
依赖的细胞凋亡;对 caspase8的 Western blot ting 分
析结果可观察到明显的 caspase8 蛋白活化降解,裂
解产物增加,由此判断调节这一细胞凋亡的主要信号
途径是 TNF
激活的死亡受体途径,即 caspase8 启
动的外源受体凋亡途径。本研究在细胞和分子水平
证明了白杨素可以有效提高 TNF
诱导肝肿瘤细胞
凋亡的能力,证明了其作为化疗增敏剂的价值。
如前所述白杨素可通过抑制 NF B 活性发挥
抗炎作用[ 910] ;促进凋亡作用研究中也发现白杨素
可下调 NF B 调控的凋亡抑制基因 Bcl2 和 x IAP
的表达;这些均提示白杨素可通过 NF B 信号通路
调控肿瘤细胞凋亡等生物学功能。而 T NF
激活
NF B 促进炎性反应、促进凋亡抑制蛋白表达是其
产生不良反应, 影响抗肿瘤疗效的主要原因。为了
明确白杨素对 T NF
化疗增敏作用是否也是通过
抑制 NF B 的活性实现的, 对 NF B 调节的凋亡
抑制蛋白进行了分析,发现 TNF
引起以 cFLIPL
和 cIAP2为主的凋亡抑制蛋白增加, 而在白杨素
预处理后明显的随时间延长升高的凋亡抑制蛋白
cFLIPL 和 cIAP2 表达减少。cIAP2 在 T NF

诱导凋亡中的作用尚不清楚, 研究认为 T NF
与受
体结合后, cIA P2 与 cIA P1 共同促进 NF B 的活
化[ 16] , 但本研究仅观察到 cIAP1 的轻微改变,所以
在白杨素促进 T NF
诱导的 HepG2 凋亡过程中
cIAP2 发挥的作用仍需深入的研究。而 cFLIP 则
被认为是 caspase8 的抑制剂, 它包括 cFLIPL 和
cFLIPs, 均 为 caspase8 的 结 构 类 似 物, 与
caspase8 竞争结合 T RADD, 抑制细胞凋亡[ 3, 17]。
白杨素预处理细胞后, 可抑制 TNF
引起的
cFLIPL 高表达, 使更多的 caspase8 结合到 T N
FR1/ T RADD/ FADD 死亡复合体上,促进肿瘤细胞
凋亡。BclxL、xIAP 主要是影响内源线粒体凋亡
途径的凋亡抑制蛋白 [ 3] ,在本研究中并未观察到明
显的变化, 也和前面的结果相一致, 即白杨素联合
T NF
诱导的 HepG2 细胞凋亡是通过 caspase8
启动的外源死亡受体信号途径实现的。所以通过本
研究发现白杨素可以增强 TNF
诱导肝癌细胞
HepG2 凋亡的能力, 抑制 NF B 活性下调凋亡抑
制蛋白 cFLIPL 的表达是其重要的分子机制。
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黄芪总苷对地塞米松和 !淀粉样蛋白联合诱导大鼠
海马神经元损伤的影响
吴庆四1 ,刘东梅2 ,徐东芳1 ,姚余有1 * ,李卫平2
( 1
安徽医科大学 检验医学系,安徽 合肥
230032; 2
安徽医科大学 药理学教研室, 安徽 合肥
230032)
摘
要:目的
探讨黄芪总苷 ( astrag alo sides) 对地塞米松 ( Dexamethasone, DEX) 与!淀粉样蛋白 ( Amy lo id!
peptide pr otein, A!) 联合诱导大鼠海马神经元损伤的影响。方法
通过检测海马神经元细胞活性, 探讨黄芪总苷
能否抑制 A!和 DEX 引起海马神经元活力下降;通过检测海马神经元胞内 Ca2+ 浓度 ( [ Ca2+ ] i) ,探讨黄芪总苷是
否通过降低 [ Ca2+ ] i抑制海马神经元凋亡;通过检测 PtauThr231 蛋白水平, 进一步探讨黄芪总苷抗 A!和 DEX
引起的海马神经元毒性机制。结果
黄芪总苷 ( 10、20、40 g/ mL ) 对体外 DEX ( 10 mo/ L) + A!2535 ( 5 mol/ L )
引起胎鼠海马神经元的损伤有保护作用 (P < 0
01) ;黄芪总苷能明显降低 DEX ( 10 mol/ L ) + A!2535 ( 5 mol/ L )
升高的海马神经元[ Ca2+ ] i、Ptau 蛋白水平 ( P< 0
05)。结论
黄芪总苷对 A!和 DEX 诱导的大鼠海马神经元损
伤有一定的保护作用。
关键词:黄芪总苷; !淀粉样蛋白; 地塞米松; 海马神经元
中图分类号: R285
5


文献标识码: A


文章编号: 02532670( 2010) 11183405
Neuroprotective effects of astragalosides against amyloid!protein and DEXinduced neurotoxicity
in rat hippocampal neurons
WU Qingsi1 , L IU Dongmei2 , XU Dongfang1 , YAO Yuyou1 , L I Weiping 2
( 1
Department of Labor ator y Medicine, Anhui Medical Universit y, Hefei 230032, China;
2. Department of Pharmacolog y, Anhui Medical Univer sity , H efei 230032, China)
Abstract: Objective
T o study the ef fect of ast rag aloside ( AST) on the injur y induced by amyloid !
pro tein ( A!) plus Dexamethasone ( DEX) in rat hippocampal neurons. Methods
I n v it ro , the ef fects of
AST on hippocampal neurons cel l death w ith A! plus DEX were detected by M TT assay and int racellular
calcium ( [ Ca2+ ] i ) ; T he effects o f AST on phosphotau ( Ptau) protein w er e analyzed to explor e the mech
anisms r esponsible for DEX enhanced A!induced cel l death in hippocampal neurons. Results
AST ( 10,
20, and 40 g / mL) could pro tect hippocampal neurons against DEX ( 10 mo l/ L) plus A!2535 ( 5 mol/ L ) 
induced hippocampal neuronal injury o f felal rat in v it ro ( P< 0
01) . AST could inhibit the incr eased lev els
of [ Ca2+ ] i and Ptau pr otein level induced by DEX ( 10 mo l/ L ) plus A!2535 ( 5 mol/ L ) ( P < 0
05) .
Conclusion
AST could protect hippocampal neuron against synergist ic neurotox icity of A! and DEX.
Key words: ast ragalosides ( AST ) ; amyloid !pro tein ( A!) ; Dexamethasone ( DEX) ; hippocampal
neurons


随着世界人口的老龄化, 阿尔茨海默病
( Alzheimer(s disease, AD) 已成为引起人类死亡的
第四大疾病。AD 主要病理特征是选择性的突触和
神经元损伤、神经纤维缠绕、胶质细胞激活和老年
∀1834∀ 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100312





















基金项目:安徽省高校省学术带头人科学研究资助项目 ( 2005hbz18) ;安徽省教育厅高等学校优秀青年人才基金资助项目 ( 2009SQRZ050)作者简介:吴庆四( 1977 # ) ,男,安徽省淮南市人,讲师,硕士,主要从事神经药理学的研究。
T el : ( 0551) 3869174
Em ail: qsw u1977@ 163. com
* 通讯作者
姚余有
T el: ( 0551) 3869174
Email: yaoanqi71@ yah oo. com