全 文 ：正交试验优化养精种玉汤提取工艺的研究
马红霞1 , 王 岩2 * ,吴慧琳2 ,王 婴2
( 1 广州医学院第一附属医院,广东 广州 510120; 2 广东药学院, 广东 广州 510006)
摘 要:目的 优化养精种玉汤的提取工艺, 并考察合煎液和单煎液中马钱苷、芍药苷和阿魏酸的变化。方法 采
用正交试验法优选工艺,并在同一色谱条件下进行 3种成分的 HPLC 测定, 其中马钱苷、芍药苷的检测波长为 230
nm, 阿魏酸的检测波长为 316 nm。结果 最佳提取条件为用 6 倍量水提取 3 次, 每次 1 h。结论 优选工艺稳定
可行,合煎液中的马钱苷、芍药苷和阿魏酸量较单煎液均有不同程度的提高。
关键词:养精种玉汤; 提取工艺;正交试验
中图分类号: R284. 2; R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11180004
Optimization of extraction process of Yangjing Zhongyu Decoction by orthogonal test
MA Hongx ia1 , WANG Yan2 , WU Huilin2 , WANG Ying2
( 1 The Fir st A ffiliated H ospital of Guangzhou Medicine Colleg e, Guangzhou 510120, China;
2 Guangdong Pharmaceutical Univ ersity , Guangzhou 510006, China)
Abstract: Objective T o opt imize the ext ract ion pr ocess of Yang jing Zhongyu Decoct ion and invest i
gate the content change of log anin, paeonif lorin, and fer ulic acid in the mixed and seper ated decoctions
Methods Orthogonal design w as used to opt im ize the ex t ract ion process T he contents o f the thr ee com
ponents w er e determ ined under the same chromatog raphic condit ions by HPLC The detect ive w avelength
of log anin and paeonif lorin w as 230 nm, and the detective w avelength o f ferulic acid w as 316 nm Results
The opt imum ex tr act ion condit ion w as as fol low s: six t imes w ater, ex t ract ing three t imes, ev ery t ime fo r
an hour Conclusion The opt imum process is stable and feasible T he contents of the three components
ar e mor e impr oved in the m ixed decoct ion in varying degrees than single decoct ion
Key words: Yang jing Zhongyu Decoct ion; ext ract ion process; or thogonal test
养精种玉汤系中医经典名方, 始载于 傅青主女
科!, 为四物汤去川芎加山茱萸而成,即组方为白芍
15 g,山茱萸 15 g,当归 15 g,熟地黄 30 g,临床上多
用于女性身瘦血虚不孕证,疗效显著。芍药苷、马钱
苷、阿魏酸分别为白芍、山茱萸、当归的有效成分, 其
中芍药苷具有促进造血祖细胞增殖、调节免疫[ 1]、抗
抑郁作用[ 2] ,马钱苷能显著增强机体免疫功能[ 3] , 阿
魏酸具有抗血小板凝集、抗血栓、增强免疫等作
用[ 4]。本研究通过测定养精种玉汤配伍前后芍药
苷、马钱苷、阿魏酸变化, 旨在阐明配伍对各药味中
有效成分的影响,为深入研究养精种玉汤的配伍规
律提供依据。
1 仪器与试药
LC ∀ 10AT 高效液相色谱仪 ( 日本岛津 ) ;
KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司)。马钱苷(批号 111640200503)、芍药苷(批号
110736200732)、阿魏酸(批号 110773200611)对照
品(中国药品生物制品检定所) ; 甲醇为色谱纯, 水为
超纯水,其余试剂均为分析纯。白芍、山茱萸、当归、
熟地黄由广州中芝源中药有限公司提供, 经笔者鉴
定符合 中国药典!2005年版一部的规定。
2 方法与结果
2 1 正交试验设计:为了寻找养精种玉汤的最佳提
取条件,以马钱苷、芍药苷和阿魏酸的量为指标, 考
察加水量、提取时间和提取次数 3个因素对提取效
果的影响,每因素各取 3个水平, 选用 L 9 ( 34 )正交
表进行试验。结果处理采用综合平衡法, 先以各指
标单独进行直观分析和方差分析, 最后进行综合平
#1800# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100115 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30701119) ;中山市科技计划项目( 2009H 019) ;广东药学院师资队伍建设经费资助作者简介:马红霞( 1974 ∀ ) ,女,博士,主要从事生殖障碍性疾病防治及药物研究。
T el : 13682236586 Email: doctorm axia 1974@ yahoo com cn
* 通讯作者 王 岩 T el: ( 020) 39352169 Em ail : gdpuw y@ 126 com
衡,得出优选方案。因素水平见表 1。
表 1 因素与水平
Table 1 Factors and levels
水平 因 素
A 加水量/倍 B提取时间/ h C提取次数/次
1 6 0 5 1
2 8 1. 0 2
3 10 1 5 3
2 2 色谱条件: Gem ini C18色谱柱(柱号 4034316,
广州菲罗门科学仪器有限公司) ; 以乙腈0 1%磷酸
溶液( 13∃ 87)为流动相; 检测波长为 230、316 nm;
体积流量为 1 0 mL/ m in;柱温为 25 % 。
2 3 对照品溶液的制备:精密称取马钱苷、芍药苷、
阿魏酸对照品 4 04、6 02、12 57 mg,加甲醇分别制
成 161. 6、240. 8、125. 7 g/ mL 的溶液。精密量取
上述马钱苷对照品溶液 10 mL、芍药苷对照品溶液
5 mL、阿魏酸对照品溶液 5 mL,置 25 mL 量瓶中,
加甲醇稀释至刻度,摇匀, 即得 64 64、48 16、25 14
g/ mL 混合对照品溶液。
2 4 供试品溶液的制备:按处方称取山茱萸15 g、白
芍15 g、当归 15 g、熟地黄 30 g,采用回流提取法,按
正交表中规定条件进行试验,提取液合并, 60 % 减压
浓缩至 75 mL,浓缩液加乙醇至含醇量为 70%,静置
2 h,用70%乙醇定容至200 mL;精密量取溶液1 mL,
置10 mL 量瓶中,加 70%乙醇稀释至刻度,摇匀, 用
045 m微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2 5 方法学考察:
2 5 1 线性关系考察: 精密量取混合对照品溶液
1、2、4、6、8 mL, 置 10 mL 量瓶中,加甲醇稀释至刻
度,摇匀。精密吸取 20 L, 测定, 以峰面积为纵坐
标, 进样量为横坐标, 进行线性回归处理。结果表
明,马钱苷在 0 129 28 ~ 1 292 8 g、芍药苷在
0 096 32~ 0 963 2 g、阿魏酸在 0 050 28~ 0502 8
g 线性关系良好。回归方程为: Y= 1 391 5 X ( r=
0 999 8) ; Y = 1 175 0 X ( r = 0 999 8) ; Y = 396 48
X ( r= 0 999 6)。由于曲线过原点, 可采用外标一
点法进行测定。
2 5 2 专属性试验: 照供试品溶液的制备项下方
法,分别制备不含山茱萸、白芍、当归的阴性对照溶
液,按上述色谱条件同法进样测定。结果在与 3 种
对照品色谱相应位置上阴性对照无干扰, 表明本法
具有良好的专属性。
2 5 3 精密度试验:精密吸取 2号正交试验的供试
品溶液 20 L, 连续进样 6 次, 测定马钱苷、芍药苷
和阿魏酸的峰面积, 结果 RSD 分别为 1 95%、
2 58%、1 94%。
2 5 4 稳定性试验: 精密吸取上述供试品溶液 20
L,分别于 0、2、4、6、8、12 h进行测定,结果马钱苷、
芍药苷和阿魏酸峰面积的 RSD 分别为 2 95%、
2 86%、2 98%,表明供试品溶液在 12 h内稳定。
2 5 5 重现性试验: 取 2 号正交试验的水提浓缩
液,按供试品溶液的制备项下方法, 自&浓缩液加乙
醇∋∋(起, 平行制备 6份供试品溶液。精密吸取
20 L 分别进样测定, 结果马钱苷、芍药苷和阿魏酸
峰面积的 RSD分别为 2 50%、2 90%、2 91%。
2 5 6 加样回收率试验: 精密吸取 2号正交试验的
水提浓缩液 1 mL,置 25 mL 量瓶中,按 1 ∃1精密加
入混合对照品乙醇溶液1 mL(含马钱苷14 mg、芍药
苷 0 86 mg、阿魏酸 0 44 mg) , 加乙醇至含醇量为
70%,静置2 h,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,同法平
行制备 6份供试品溶液,进行测定,结果马钱苷、芍药
苷和阿魏酸的回收率分别为 99 82%、99 88%、
98 55%, RSD分别为 0 69%、1 10%、0 53%。
2 6 正交试验结果分析: 按照上述建立的测定方
法,分别测定 9份正交试验供试品溶液中马钱苷、芍
药苷和阿魏酸,各成分的质量分数以各单味药材投
料量计,如马钱苷质量分数= 马钱苷提出量( mg ) /
山茱萸投料量( g )。分别进行直观分析和方差分析,
结果见表 2、3。
表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test
样品号 A B C D(误差) 质量分数/ ( mg # g- 1 )马钱苷 芍药苷 阿魏酸
1 1 1 1 1 3 809 1 954 1 685
2 1 2 2 2 6 383 4 440 2 131
3 1 3 3 3 6 694 4 533 2 560
4 2 1 2 3 2 758 2 744 0 965
5 2 2 3 1 4 913 4 695 1 919
6 2 3 1 2 3 763 3 215 1 649
7 3 1 3 2 2 990 2 914 1 866
8 3 2 1 3 4 676 3 090 1 522
9 3 3 2 1 5 147 3 863 1 812
马 ) 5 629 3 186 4 083 4 623
钱 ∗ 3 811 5 324 4 763 4 379
苷 + 4 271 5 201 4 866 4 709
R1 1 818 2 138 0 783 0 330
芍 ) 3 642 2 537 2 753 3 504
药 ∗ 3 551 4 075 3 682 3 523
苷 + 3 289 3 870 4 047 3 456
R2 0 353 1 538 1 294 0 067
阿 ) 2 125 1 505 1 619 1 805
魏 ∗ 1 511 1 857 1 636 1 882
酸 + 1 733 2 007 2 115 1 682
R3 0 614 0 502 0 496 0 200
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表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
方差来源 离差平方和 F值 显著性
马钱苷 A 5 357 30 44 P < 0 05
B 8 650 49 15 P < 0 05
C 1 086 6 170
D(误差) 0 176
芍药苷 A 0 202 28 86 P < 0 05
B 4 183 597 6 P < 0 01
C 2 672 381 7 P < 0 01
D(误差) 0 007
阿魏酸 A 0 581 9 525
B 0 398 6 525
C 0 476 7 803
D(误差) 0 061
由直观分析可见, 各因素对马钱苷提取效果的
影响顺序为: B> A> C,优选水平组合为 A 1B2 C3 ;对
芍药苷提取效果的影响顺序为: B > C> A , 优选水
平组合为 A 1B2C3 ,与马钱苷一致; 对阿魏酸提取效
果的影响顺序为: A > B> C, 优选水平组合为
A 1B3 C3。方差分析结果表明, 因素 A 和 B 对马钱
苷的提取影响显著; 因素 A、B和 C 均对芍药苷的提
取影响显著;而各因素对阿魏酸的提取均无显著性
影响。综合以上分析, 确定最佳提取工艺为
A 1B2 C3 , 即加 6倍量水,提取 3次,每次 1 h。
2 7 样品测定:按处方称取 4味药材, 按照最佳工
艺进行提取,制得合煎供试品溶液;另分别称取以上
药材,同法制得山茱萸、白芍、当归单煎供试品溶液。
分别测定 3种成分, 结果见表 4, 色谱图见图 1~ 4。
表 4 配伍前后煎液中有效成分的对比(n= 3)
Table 4 Comparison of ef fective ingredients
before and after compatibility ( n= 3)
指标 养精种玉汤/
( mg # g- 1 ) RSD/%
单煎液/
( mg # g- 1 ) RSD/%
马钱苷 7 024 0 53 4 511 1 74
芍药苷 4. 782 1. 19 4. 057 1. 64
阿魏酸 2. 597 1. 56 2. 254 0. 81
3 讨论
中国药典!2005年版一部山茱萸、白芍、当归药
材项下马钱苷、芍药苷、阿魏酸的 HPLC 检测波长分
别为 240、230、316 nm。由于马钱苷与芍药苷的紫外
最大吸收波长接近,可考虑在同一波长下测定。经过
比较发现,马钱苷在 230~ 240 nm 吸光度差异不大,
而两成分在 230 nm的分离度较其他波长更理想,故
检测波长确定为 230 nm。阿魏酸因为在此波长下无
吸收,故仍采用 316 nm波长进行测定。
养精种玉汤由山茱萸、白芍、当归和熟地黄组
成,熟地黄有效成分的测定并未涉及。目前一般认
为地黄的有效成分是以梓醇为代表的环烯醚萜苷
a合煎液 b马钱苷对照品 c山茱萸单煎液
d芍药苷对照品 e白芍单煎液
am ixed decoct ion b logan in reference sub stan ce cseperated
decoct ion of Corni Fr uctus dpaeonif lorin reference sub stan ce
es eperated decoct ion of Paeoniae A lba Rad ix
图 1 合煎液与山茱萸、白芍单煎液 HPLC图 ( 230 nm)
Fig. 1 HPLCChromatograms of mixed and seperated
decoctions of Corni Fructus and Paeoniae
Alba Radix ( 230 nm)
a合煎液 b阿魏酸对照品 c当归单煎液
amix ed decoction bf eru lic acid r eference substance
cseperated decoct ion of A ng el ic ae Sinensi s R adix
图 2 合煎液与当归单煎液 HPLC图( 316 nm)
Fig. 2 HPLC Chromatograms of mixed
and seperated decoctions of Angelicae
Sinensis Radix ( 316 nm)
a合煎液 b缺山茱萸阴性 c缺白芍阴性
amixed decoct ion bnegat ive sample w ithout Corni F ruc tus
cnegat ive sample w ithout Paeoniae A lba Rad ix
图 3 缺山茱萸、缺白芍阴性对照 HPLC图( 230 nm)
Fig. 3 HPLCChromatograms of negatives sample without
Corni Fructus and Paeoniae Alba Radix ( 230 nm)
类,但该类成分遇热极不稳定,经蒸制成熟地黄后仅
剩余 1/ 20,再加上提取过程中的破坏, 导致水提液
中该成分不能被检出 [ 5] ,笔者在研究中也得出了相
同的结论。熟地黄中有效成分的确认及其量变规律
有待进一步的研究、探讨。
实验结果可知,与山茱萸,白芍和当归各单煎液
相比较,养精种玉汤合煎液中的马钱苷,芍药苷和阿
魏酸均有不同程度的提高, 表明该汤剂的组方配伍
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a合煎液 b缺当归阴性
amix ed decoct ion bn egative sam ple
w ithout A ng el ic ae Sinensi s R adix
图 4 缺当归阴性对照 HPLC图( 316 nm)
Fig. 4 HPLCChromatograms of negative sample
without Angelicae Sinensis Radix ( 316 nm)
在煎煮过程中更有利于 3种有效成分的溶出,实验
结果从主要成分变化的角度支持了养精种玉汤配伍
合煎的合理性,并为其物质基础的阐明提供了一定
的实验依据。
参考文献:
[ 1] 胡 南,许惠玉,陈志伟, 等 芍药苷的药理学研究进展[ J]
齐齐哈尔医学院学报, 2007, 28( 9) : 10931095
[ 2] 崔广智 芍药苷抗抑郁作用的实验研究[ J] 现代药物与临
床, 2009, 24( 4) : 131233
[ 3] 潘 莹,郭小龙,陈 勇,等 HPLC法测定杞菊地黄丸中马钱
苷、芍药苷和丹皮酚的含量[ J ] 中国药科大学学报, 2007, 38
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[ 4] 胡益勇,徐晓玉 阿魏酸的化学和药理研究进展[ J] 中成药,
2006, 28( 2) : 253255
[ 5] 王太霞,李景原,胡正海 地黄的形态结构与化学成分研究进
展[ J] 中草药, 2004, 35( 5) : 585587
知母皂苷 B∗对照品的快速制备研究
冀 旭1, 2 , 吴智宇1 , 陈千良1 * ,孙文基1
( 1 西北大学生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069;
2.西北大学 国家微检测工程技术中心, 陕西 西安 710069)
摘 要:目的 从知母药材中快速分离制备知母皂苷 B∗对照品。方法 知母药材粗粉用 80%乙醇提取, 经大孔
树脂 D101 柱吸附 ,以 30%乙醇洗脱, 得到知母总皂苷。用制备 RPH PLC 对总皂苷进行分离纯化, 采用柱后分
流, ELSD 同时检测,收集含高质量分数知母皂苷 B∗的组分。结果 制备产品经化学方法和13 CNMR 鉴定;
HPLCELSD检测,质量分数大于 99%。结论 该制备方法简单,重复性好, 效率较高, 所得化合物质量分数高, 可
用于知母皂苷 B∗对照品的制备。
关键词:知母皂苷 B∗ ;分离; 纯化;制备高效液相色谱
中图分类号: R284. 2; R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11180304
Rapid preparation of timosaponin B∗ reference substance
JI Xu
1, 2
, WU Zhiyu1 , CHEN Qianliang1 , SU N Wenji1
( 1 Key Labo rato ry o f Resource Biolog y and Biotechno lo gy in Western China, College o f L ife Sciences, Nor thwest Univer sity ,
Xi,an 710069, China; 2 National Eng ineering Resea rch Center fo r M iniatur ize Detect ion System,
Nor thw est Univer sity, Xi,an 710069, China)
Abstract: Objective T o establish a method to isolate and prepare timosaponin B∗ reference substance
from A nemar rhenae R hiz oma Methods Raw mater ial of A nemarr henae R hiz oma was ex tr acted with 80%
ethano l T he concentrated cr ude ext ract w as separ ated on a D101 macroporous r esin column, by elut ing
the macroporous resin co lumn w ith 30% ethanol, total saponins w ere collected The t imosaponin B ∗ was
separated by prepar at ive rev er sedphase high per formance liquid chromatogr aphy ( RPHPLC) coupled w ith
ELSD and co llected according to the chr omatogr aphy Results T he prepar ed product w as ident ified by
nuclear magnet ic resonance and chem ical method T he purity of t imosaponin B ∗ was > 99% assayed by
analyt ical HPLCELSD Conclusion T he preparation method is simple and rapid, and it can be used fo r
prepar at ion of timo saponin B ∗ reference substance
Key words: t imosaponin B∗; separat ion; purif icat ion; preparative HPLC
#1803#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100307 基金项目:国家药典委员会 2010版一部标准研究项目( YZ196~ 198) ;西北大学科研启动基金资助项目( OKYQDF159)作者简介:冀 旭( 1987 ∀ ) ,男,硕士研究生,中药学专业。
* 通讯作者 陈千良 T el: ( 029) 88304569 Email: cql999@ hotmail com