全 文 :陕西产秦艽质量变异与遗传多样性研究
石张燕1, 2, 3 ,陈千良1, 2, 3 * ,赵宇玮1, 2 ,孙文基2, 3 ,赵桂仿1, 2
( 1 西北大学 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069; 2 西北大学生命科学学院,
陕西 西安 710069; 3 西北大学 陕西省生物医药重点实验室, 陕西 西安 710069)
摘 要:目的 研究陕西省不同产地秦艽的质量差异, 对其遗传多样性进行检测, 探讨药材质量和其遗传基础的关
系。方法 采用 HPLC 法测定不同产区秦艽药材中的指标成分, 进行 HPLC 指纹图谱分析, 计算并比较相似度。
依据指纹图谱中的共有峰特征,对不同药材样品进行聚类分析。对药材中提取的总 DNA 进行RAPD分析, 计算遗
传距离并聚类。结果 陕西省不同产区秦艽药材的质量具有一定的差异, 不同产区秦艽药材也表现出一定的遗传
多样性。陕西省不同产区的秦艽药材质量变异与遗传多样性之间不具有明显的相关性, 而表现出与产地的相关
性。结论 产地对陕西秦艽药材质量的影响更为重要,提示道地秦艽质量的形成可能属于生境主导型。
关键词:秦艽; 质量变异;遗传多样性
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10170505
Studies on quality variance and genetic diversity of Gentianae Macrophyllae Radix
from different habitats in Shaanxi Province
SHI Zhangyan1, 2 , CHEN Qianliang 1, 2, 3 , ZHAO Yuwei1, 2 , SU N Wenji2, 3 , ZHAO Guifang1
( 1 Key Labor ator y o f Resource Bio lo gy and Modern Biotechno lo gy in Western China, M inistr y of Educat ion, Nor thwest
University, Xi an 710069, China; 2 College o f L ife Science, No rthwest Univ ersity , Xi an 710069, China;
3 Biomedical Key Labo rato ry of Shaanx i P ro vince, Nor thwest Univer sity, Xi an 710069, China)
Abstract: Objective The quality variance of Gentianae M acr ophy l lae Radix from dif ferent habitats of
Shaanx i Province w as studied, the genet ic diversity w as detected, and the r elat ionship betw een quality and
inheritance w as discussed Methods Using H PLC to measur e effect ive components of Gent ianae M acr o
phy l lae Radix f rom dif ferent habitats, analyze HPLC fingerprint , and calculate and compare the similari
ty Based on traits of common peaks in fingerprint , differ ent samples of Gentianae Macrophy l lae Radix
were clustered The to tal DNA from crude medicinal materials w as analyzed by RA PD, the genetic dis
tance w as calculated and dif ferent samples w ere clustered at the base of the genet ic distance Results
There w er e quality variance and genetic diversity at a certain degree with G ent ianae Macrop hy l lae Radix
from different habitats o f Shaanx i Prov ince There was no appar ent co rrelat ion betw een quality v ariance
and genet ic diversity of G ent ianae M acr ophy llae Rad ix f rom dif ferent habitats o f Shaanx i Pro vince, but
there w as cor relat ion betw een quality variance and habitats Conclusion T he habitats ar e mor e impo rtant
fo r the quality o f Gentianae Macr op hy l lae R adix in Shaanxi Province T his suggests that the quality of
Gent ianae Macrop hy l lae Rad ix is mainly affected by the environment
Key words: Gent ianae Macr op hy l lae R adix f rom Shaanx i Pr ovince; quality variance; g enet ic div ersity
秦艽是我国重要的传统中药之一, 始载于!神农
本草经∀, 主寒热邪气,寒湿风痹,肢节痛、下水、利小
便。处于黄土高原腹地的陕西、甘肃两省是秦艽道
地产区[ 1]。在陕西省内, 关中西部靠近甘肃的宝鸡
地区陇县、太白县和凤县为秦艽的传统道地产区。
由于长期以来过度采挖, 秦艽野生资源急剧减少。
为解决供求矛盾, 秦艽的野生转家种研究已经开展
多年,并且取得了一定的成绩,栽培品在商品中的比
#1705#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20091220 基金项目:科技部∃ 重大新药创制%科技重大专项( 2008ZX091012106) ;陕西省教育厅专项科研计划项目( 06JK178) ;陕西省自然科学基金资助项目( S J08ZT024)作者简介:石张燕( 1975 & ) ,女,江苏如皋人,助理研究员,从事分子遗传学研究。
* 通讯作者 陈千良 T el: ( 029) 88302411 Email: cq1999@ nw u edu cn
例逐渐升高。目前秦艽药材商品除传统产区外, 有
一些引种栽培产区也形成了一定的产量。影响中药
材质量的因素较多,因此有必要对陕西省内不同地
区的秦艽药材的质量变异进行比较。
种质遗传因素是决定中药材质量的内在重要因
素。不同产区秦艽植物学上属于不同的居群, 其遗
传上应该具有一定的变异。随机扩增多态性 DNA
技术 ( random ly amplif ied polymorphic DNA,
RAPD)是目前广为应用的 DNA多态检测技术 [ 26] ,
在中药道地性研究中也广泛采用。本研究应用
RAPD技术对陕西省不同产区的 5个秦艽样品进行
遗传多样性研究, 从 DNA 水平上分析不同产地的
秦艽,结合药材质量变异的比较进行相关性分析。
研究结果可为秦艽种质的筛选提供依据, 并在探索
道地秦艽质量形成的基础上, 进一步为优质秦艽药
材的规范化生产以及秦艽的优良栽培品种育种积累
数据。
1 材料和仪器
1 1 药材样品及处理:不同产区秦艽药材样品来源
和时间见表 1。栽培秦艽药材在种植基地小区中、
野生秦艽样品在分布区内随机挖取,根鲜质量不少
于 1 kg。用湿润毛刷仔细刷净泥土, 低温烘干。对
于购买的干药材样品随机取出不少于 300 g。所有
干燥后的药材样品, 粉碎后过 3号筛,置于干燥器中
备用。所有样品经西北大学生命科学学院魏朔南教
授鉴定为龙胆科植物大叶秦艽 Gent iana macr o
p hy l la Pall 的干燥根, 标本存放于西北大学生命
科学学院陕西省生物医药重点实验室。
表 1 秦艽药材样品来源及采集时间
Table 1 Source and collection time of Gentianae
Macrophyllae Radix
编号 来 源 采集时间 备 注
1 凤县栽培秦艽 200807 购干药材, 基地已有十几年栽培史
2 陇县野生秦艽 200808 采集
3 陇县栽培秦艽 200808 基地采集, 基地已有近30年栽培史
4 太白县野生秦艽 200807 采集
5 柞水县栽培秦艽 200807 基地采集, 引种栽培近10年
1 2 仪器与试药: 高效液相系统为 HIT ACHI 高
效液相色谱仪(日本) , 7110高效液相色谱泵、7420
紫外可见光检测器; 指纹图谱用高效液相系统为
Waters Alliance高效液相色谱仪(美国) , 2695高效
液相色谱泵、2487 紫外可见光检测器; M illipo re 超
纯水机(美国) ; KQ & 500DE 型数控超声波清洗机
(昆山市超声仪器有限公司)。Mastercycler PCR扩
增仪(德国 Eppendorf ) , DYY & 6C 型电脉仪(北京
市六一仪器厂) , DYC 电泳槽 (北京六一仪器厂)
GelDoc 型凝胶扫描成像系统 (美国 BIORAD 公
司)。
龙胆苦苷对照品购自中国药品生物制品检定所
(批号 111607200301) , 其余几种环烯醚萜苷对照
品均为自制,经 MS、1HNMR和13 CNMR等波谱手
段鉴定。色谱纯甲醇和乙腈( T EDIA) , 其余试剂均
为分析纯 ( 西安化学试剂厂 )。蛋白酶 K、Gold
View I型核酸染色试剂、2 ∋ T aq PCR M asterM ix、
DNA 相对分子质量标准购自天根生化科技(北京)
有限公司,琼脂糖为西班牙 Biow est 公司原装, 随机
引物由上海英骏生物技术有限公司合成并分装。
2 方法与结果
2 1 药材中龙胆苦苷测定: 测定方法参见文献报
道[ 7 ]。陕西 5个产区秦艽药材中龙胆苦苷测定结果
见表 2。
表 2 不同产区秦艽药材中龙胆苦苷( x( s, n= 3)
Table 2 Gentiopicroside in Gentianae Macrophllae Radix
from different habitats ( x ( s, n= 3)
编号 样 品 龙胆苦苷/ %
1 凤县栽培秦艽 5 97 ( 0 121
2 陇县野生秦艽 8 64 ( 0 255
3 陇县栽培秦艽 7 58 ( 0 230
4 太白县野生秦艽 5 67 ( 0 034
5 柞水县栽培秦艽 5 60 ( 0 289
2 2 药材化学指纹图谱分析
2 2 1 色谱条件: 色谱柱为 Kromasil C18柱 ( 250
mm ∋ 4 6 mm, 5 m) ; 以乙腈0 2%冰醋酸水溶液
为流动相,梯度洗脱见表 3;体积流量 1 mL/ min;柱
温 25 ) 。
表 3 HPLC指纹图谱洗脱梯度
Table 3 Gradient elution of HPLC fingerprint
时间/ min 乙腈/ % 0 2%冰醋酸/ %
0 5 95
25 16 84
30 28 72
35 39 61
39 50 50
44 5 95
60 5 95
2 2 2 检测波长选择: 对比 214、254、270 nm 等几
个波长检测的色谱图,其中 254 nm 检测所得色谱
图信息最丰富。又因龙胆苦苷在秦艽中的量很高,
远高于其他成分, 在所考察的几个波长下其峰面积
均是最大。而在 254 nm 下, 其他成分的峰面积占
整个图谱的总面积的比重还是相对最大的,所以确
定检测波长为 254 nm。
#1706# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
2 2 3 对照品溶液的制备:同秦艽药材中龙胆苦苷
测定。
2 2 4 供试品溶液的制备:取药材粉末约0 5 g, 精
密称定,置 25 mL 量瓶中,加入甲醇近刻度,超声振
荡 30 min, 取出放至室温,用甲醇定容,摇匀, 静置。
微孔滤膜滤过作为供试品溶液。
225 测定:精密吸取供试品溶液各 5 L 注入液相
色谱仪测定。秦艽药材的高效液相色谱图见图 1。
t / min
图 1 陇县野生秦艽高效液相色谱图
Fig 1 HPLC Chromatogram of wild Gentianae
Macrophllae Radix from Long County
2 2 6 方法学考察
精密度试验:同一样品溶液连续 5 次指纹图谱
分析, 所得色谱图中各峰相对保留时间 RSD 为
0 1% ~ 0 3%。用相似度评价软件计算相似度, 5
次的色谱图与共有模板的相似度均为 0 999。
稳定性试验:同一样品溶液分别在 0、1、2、4、8、
12、24 h 进行指纹图谱分析, 所得色谱图直观观察
形貌完全一致。用相似度评价软件计算相似度, 与
共有模板的相似度分别为 1 000、1 000、1 000、
0 999、0 999、0 999。
重现性试验:同一样品平行制备 5份样品溶液,
进行指纹图谱分析,所得色谱图直观观察形貌完全
一致。用相似度评价软件计算相似度, 与共有模板
的相似度分别为 0 998、0 999、0 998、0 998、
0 999、0 999,均大于或等于 0 998。
2 2 7 特征峰指认: 秦艽药材高效液相色谱图中,
单峰面积占总图谱面积 1%以上的较大色谱峰共有
6个(均为共有峰) , 分别是 6、12、13、14、15、24 号
峰。在指纹图谱的色谱条件下,测定 6 OD葡萄
糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷对
照品,并将它们的保留时间与指纹图谱中相应的色
谱峰对照,结果样品指纹图谱中共有峰中第 6、13、
14、15号峰分别与上述对照品吻合,故指纹图谱中
6、13、14、15 号峰依次为 6 OD葡萄糖基龙胆苦
苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷。
2 2 8 相似度分析:将色谱仪采集的样品指纹图谱
数据导入国家药典委员会指纹图谱相似度分析软件
( 2004A版) ,进行相似度分析。经相似度软件相似
度计算生成对照图谱。5个样品相似度最高为 1,最
低为 0 996。
2 2 9 指纹图谱数据聚类分析:将高效液相工作站
给出的数据导入指纹图谱相似度软件匹配后,得出
32个共有峰。从软件中获取 5 个样品的 32 个共有
峰的峰面积数据。将这些数据导入 SPSS15 0软件
形成 5 ∋ 32矩阵, 按照样品进行聚类分析,以欧氏距
离为测度,软件给出聚类图,见图 2。
图 2 成分指纹图谱聚类图
Fig 2 Dendrogram of HPLC fingerprint
2 3 秦艽 RAPD分析方法和结果
2 3 1 基因组总 DNA 的提取及检测: DNA 提取
在参考文献[ 5] 的基础上略加改进。称取 0 2 g 药材
样品粉末,加液氮进一步研成极细粉末;将粉末倒入
2 L Eppendorf 管, 加入 900 L 提取缓冲液( 100
mmol/ L Tr is #Cl、50 mmol/ L EDTA、500 mmo l/ L
NaCl、10 mmol/ L 巯基乙醇)和 10 L 蛋白酶 K
( 20 mg/ mL) , 55 ) 水浴 20 m in; 加入 160 L KAc
( 5 mol/ L ) , 置于 4 ) , 30 min, 12 000 ∋ g 离心 15
m in;取上清液, 加入等体积氯仿异戊醇( 24 ∗ 1) ,
8 000 ∋ g 离心 10 m in; 取上清液, 加入 2/ 3体积的
异丙醇,置- 20 ) , 30 min, 8 000 ∋ g 离心 10 min;
弃去上清液,将沉淀用吸水纸吸干, 并用 70%乙醇
洗涤; 8 000 ∋ g 离心 5 m in; 弃去上清液,将沉淀吸
干,加入 50 L TE 充分溶解, 置 4 ) 备用。提取出
的基因组 DNA 经紫外分光光度计检测并计算浓
度,用灭菌无离子水稀释成 10 ng/L。
2 3 2 PCR 扩增: 扩增体系为 25 L, 其中含 2 ∋
T aq PCR M aster Mix 12 5 L, 引物( 10 mol/ L )
2 0 L, DNA模板( 10 ng/L) 1 0 L, 用灭菌无离
子水补足反应体积。扩增程序: 94 ) 预变性 5 min,
然后进行45个循环,每一循环由 94 ) 变性 30 s, 37
) 复性 30 s和 72 ) 延伸 1 m in 组成,循环结束后在
72 ) 最后延伸 7 min。
2 3 3 扩增产物检测: PCR 结束后, DNA 扩增产
物用 1 0%琼脂糖胶(含 Gold View +型核酸染色
剂)进行电泳, 电泳电压 5 V/ cm, 45 min 后在凝胶
扫描成像仪上检测。
用 40 条随机引物对 5个产区的秦艽样品进行
RA PD实验,共有 9条引物的扩增谱带具有多态性
( 图3)。根据相对分子质量标准的迁移率, 统计同
#1707#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
1~ 5 泳道分别为凤县、陇县野生、陇县栽培、太白县和柞水样品;
引物序列为 5 GAGCCCT CCA3
1- 5 are samples f rom Feng Xian, Long Xian ( w ild) , Long
Xian ( cult ivated) , T aib ai Xian and Zhashui , respectively; p rim
er sequ ence is 5 GAGCCCTCCA3
图 3 5产区秦艽 RAPD图谱
Fig 3 RAPD Chromatogram of samples f rom five habitats
一位点的条带, 有带记为 1, 无带记为 0,清晰且稳定
的条带均记入统计结果。使用这 9条引物共扩增出
43条谱带, 即检测了秦艽基因组中的 43 个位点。
每条引物扩增出的谱带数在 4~ 6 条之间, 平均为
4 8 条; 多态性条带共计 32 条, 占总带数的
74 42%; 多态 比率 在 20 00% ~ 100% , 平 均
为 72 78%。
采用 Lynch 的方法计算,得到不同产区秦艽的
遗传相似性系数( F)。在相似性系数的基础上进一
步得到不同产区秦艽的遗传距离( D )矩阵,见表 4。
表 4 1~ 5 号秦艽样品的遗传距离
Table 4 Genetic distance of samples 1- 5
样品 1 2 3 4 5
1
2 0 389 8
3 0 151 5 0 333 3
4 0 448 3 0 302 3 0 440 0
5 0 242 4 0 254 9 0 172 4 0 360 0
根据遗传距离矩阵, 应用不加权算术平均组对
法( unveighted pair group method w ith ar itmet ic
mean, U PGMA)对不同产区秦艽之间的亲缘关系
进行聚类分析, 见图 4。
图 4 5产区秦艽的亲缘关系聚类图
Fig 4 Dendrogram of sample relationship
from five habitats
3 讨论
3 1 不同产区秦艽药材质量变异:从龙胆苦苷测定
结果可以看出, 不同产区的秦艽药材中龙胆苦苷的
量有一定的差别。并且陇且秦艽药材无论是栽培还
是野生,其量均明显高于其他产地药材。将陇县样
品与其他样品分为两组,进行方差分析,结果表明差
异达到显著水平, 说明陇县作为传统道地药材产区,
是得到指标成分量的证据支持的。而且在各产地
中,除陇县位于秦岭以北外, 其他产地均在秦岭南
坡。这提示药材龙胆苦苷的量与产地具有一定的相
关性。另外,陕西其他产地药材的龙胆苦苷的量虽
然低于陇县, 但仍然高于多数外省所产药材 [ 9]。!中
国药典∀2005年版中规定秦艽含龙胆苦苷应不低于
2%。因此, 陕西各产区药材的量均远远超过药典标
准。从有效成分的角度看,陕西产秦艽药材质量是
较优的。
在药材化学成分指纹图谱分析中, 所有样品化
学指纹图谱相似度均在 0 996以上,说明陕西不同
产区的秦艽药材化学成分的整体相似程度是非常高
的。单从相似度一个指标上不容易反映出彼此之间
的差异。这也说明陕西各产区药材化学成分有较大
程度的一致性。在指纹图谱数据聚类分析中可以看
出凤县、陇县和太白县的 4个样品( 1、2、3、4)与柞水
样品( 5)分为两大类。在本实验的几个产区中, 柞水
是近年来引种栽培的新产区,位于陕西关中的东部,
而陇县、太白和凤县均在关中西部接近甘肃的宝鸡
地区,是老产区。所以指纹图谱数据聚类的两大类
与产地关联很明显。进一步看, 在第一大类中陇县
野生和栽培样品( 2和 3)聚在一起,凤县和太白县样
品( 1和 4)聚在一起。这 3个产地中陇县在秦岭以
北,而聚在一起的太白和凤县则在秦岭南坡,所以在
老产区样品聚类中也体现出与地域的较强相关性。
3 2 遗传多样性分析: 陕西省 5 个产区秦艽的
RA PD标记具有一定的多态性,说明用 RAPD分析
来区分和鉴定不同产地的秦艽是可行的。不同省份
所产秦艽之间在 DNA 水平上的差异应当更为明
显。本实验的聚类分析最终将陇县人工栽培样品
( 3)、凤县栽培样品( 1)和柞水栽培样品( 5)聚在一
起,而将陇县野生样品( 2)和太白县野生样品( 4)聚
在一起,这是由于凤县、柞水两地的秦艽均是从陇县
人工栽培秦艽引种所致。但凤县、柞水与陇县栽培
样品三者之间的 RA PD图谱不尽相同,据此计算出
的遗传距离分别为: D陇县凤县 = 0 515 5, D陇县柞水 =
0 172 4, D凤县柞水 = 0 242 4, 提示秦艽在引种后, 在
栽培过程中由于留种, 人为地对群体进行了一定程
度的选择。因此, 经过一段时间发生了遗传上的分
化。陇县野生样品与太白县野生样品相似程度较
高,而与陇县人工栽培样品差异较大,提示秦艽在由
野生转为家栽的过程中, 也是由于人工选择等因素
#1708# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
而逐渐产生了一定的变异。综上所述, 笔者认为
RAPD聚类结果与不同产地秦艽的实际亲缘关系
是比较吻合的。
3 3 秦艽药材质量变异与遗传多样性和产地的关
系:目前对药材质量的评价一般是在对其有效成分
或指标成分进行分析的基础上做出的。此类成分基
本上都是药用植物的次生代谢产物。它们的合成与
积累不仅与遗传有关,而且与环境有关,这是由于调
控次生代谢的基因在表达时要受到环境的影响。本
实验中陕西不同产区秦艽药材质量的变异情况与其
遗传变异之间未显示出比较明显的关联, 而与产地
有较强的相关性。在几个产区中,环境条件差异较
大,药材之间质量差异也较大,环境条件差异较小则
质量比较接近。这些反映出与秦艽药材质量相关的
基因在表达时可能受到不同产地环境的影响。在对
道地药材质量形成机制的研究中,有学者认为主要
的机制有:种质主导型、生境主导型、技术主导型、传
媒主导型和多因子关联决定型 [ 9]。从本实验的研究
结果看,陕西产秦艽药材的质量影响因素中,环境条
件应当是一个重要的因素,提示陕西产道地秦艽质
量的形成机制可能属于生境主导型。
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中药杂志, 1995, 20( 6) : 323326
黄芪皂苷成分与环境因子的灰色关联度分析
王宗权,贾继明* ,宋 剑
(河北以岭医药研究院, 河北 石家庄 050035)
摘 要:目的 通过灰色关联度分析方法系统研究了黄芪皂苷成分与环境因子之间的关系。方法 采用 H PLC
ELSD测定了黄芪药材中的黄芪甲苷、黄芪皂苷+和黄芪皂苷, , 应用灰色关联度公式进行数据分析。结果 灰色
关联度分析表明影响黄芪甲苷的主导环境因子是年平均气温, 而影响黄芪皂苷+和黄芪皂苷,的主导环境因子是
年平均无霜期。结论 为道地药材黄芪引种提供科学依据。
关键词:黄芪; 皂苷;环境因子; 灰色关联度分析
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10170904
Analysis of grey correlation between saponins and environmental factors in Astragali Radix
WANG Zongquan, JIA Jiming, SONG Jian
( Hebei Y iling Medicine Institue, Shijiazhuang 050035, China)
Abstract: Objective T o analyze the r elat ionship betw een saponins of A str agal i R adix and env iron
mental factors by using gr ey correlation analy sis Methods T o establish an HPLCELSD method fo r the
determ inat ion of the ast ragaloside −, astrag aloside + , and ast ragaloside , in A str agal i Rad ix f rom vari
ous habitats, the data w ere analyzed by using grey co rrelat ion Results Grey cor relat ion analysis show ed
the annual average temperature w as the dominant climat ic factor on the content of ast ragaloside − Annual
#1709#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100303 基金项目: ∃ 十一五%国家科技支撑计划项目( 2006BAI08B0409) ;国际科技合作计划项目( 2008DFA30810) ; ∃ 重大新药创新%科技重大专项
( 2009ZX09102140)作者简介:王宗权( 1977- ) ,男,黑龙江省双城人,工程师,硕士,长期从事中药创新药物开发工作。
T el : ( 0311)85901304 Email: w zq03yjs@ 163 com
* 通讯作者 贾继明 T el: ( 0311) 85901304 Email: jjm_0451@ 163 com