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Protective mechanism on the vascular pathological process in diabetes mellitus rats by Rheum officeinale

大黄对糖尿病大鼠血管病变保护机制的研究



全 文 :大黄对糖尿病大鼠血管病变保护机制的研究
田风胜1,李振彬2,王元松1,苏秀海1,李文东1,王晓蕴1,李 烨1
(1.河北医科大学 附属沧州中西医结合医院 内分泌科,河北 沧州 061001;
2.白求恩国际和平医院 中西医结合内科,河北 石家庄 050023)
[摘要] 目的:探讨大黄对糖尿病血管病变的保护机制。方法:制备糖尿病大鼠模型,成模后,随机抽取24只
分为模型组(12只)及大黄煎剂组(12只),另取12只不造模大鼠为正常组。大黄煎剂组给予生药10g·kg-1灌
胃,其余两组每日给予同等容量纯净水灌胃。8周后,取血测定一氧化氮(NO)及内皮素1(ET1)。取胸主动脉环
观察不同累积浓度的乙酰胆碱(Ach)对去甲肾上腺素(NE)引起的血管收缩的抑制率。另留取一段胸主动脉制备
病理切片,SP法免疫组化染色,观察细胞间黏附分子1(ICAM1)及血管细胞间黏附分子1(VCAM1)的阳性表达。
结果:大黄煎剂组与模型组相比能明显抑制升高的血浆 ET1(P<0.05);升高 NO的水平(P<005);但均达不到
正常组的水平(P<005)。模型组血管环对NE的收缩反应明显强于正常组及大黄煎剂组(P<005),且大黄煎剂
组对NE的收缩反应亦强于正常组(P<005)。在相同Ach浓度下,模型组及大黄煎剂组胸主动脉环对 Ach的舒
张作用明显弱于正常组(P<005),而大黄煎剂组强于模型组(P<005)。大黄煎剂组能明显抑制糖尿病大鼠胸
主动脉ICAM1及VCAM1表达(P<005)。结论:大黄具有降低大鼠ET1及升高NO的作用,能够保护糖尿病大
鼠内皮依赖的血管舒张功能,且能够抑制ICAM1及VCAM1的表达,具有抗动脉硬化作用。
[关键词] 大黄;糖尿病模型;胸主动脉;内皮
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)06067204
[收稿日期] 20070520
[通讯作者] 田风胜,Tel:(0317)6987188,Email:cztianfsh@
sian.com
  糖尿病合并血管病变是糖尿病的慢性并发症之
一,是糖尿病致残致死的最主要原因。糖尿病会加
速动脉硬化的进程,而血管内皮细胞的损伤是动脉
粥样硬化发生的始环节[1]。免疫学证明动脉粥样
硬化(AS)是炎症性疾病[2]。多种炎性细胞因子的
过度释放是动脉粥样硬化形成的重要步骤已经被广
泛接受[3]。随着研究深入,发现清热类中药不仅仅
限于传统理论中的抗菌消炎作用,而涉及到了炎性
反应的多个环节,这就为清热类中药防治 AS提供
了药理学依据。
1 材料
1.1 动物
健康雄性清洁级 SD大鼠 50只,体重(180~
220)g,由河北医科大学实验动物中心提供,动物合
格证号DK05060023。
1.2 药物
药用大黄RheumoficeinaleBail.产于四川,由河
北省沧州中西医结合医院副主任中药师李烨鉴定。
试验用制大黄。药材加入10倍量水煎煮2次,每次
40min,过滤,滤液蒸发浓缩,终生药含量为 1g·
mL-1。
1.3 仪器
血管灌流装置(齐齐哈尔玻璃仪器厂);CS501
型超级恒温水浴(上海浦东荣丰科学仪器有限公
司);TGL-16G低温离心机(上海安亭科学仪器
厂);722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器
厂);罗康全活力型血糖仪(德国罗氏诊断有限公
司);RM6240B/C1.36生物信号采集系统(成都仪
器厂);JZ101肌肉张力换能器(高碑店新航机电设
备公司);HPIAS-1000彩色病理图文分析系统(同
济医科大学千屏影像公司)。
1.4 试剂
链脲佐菌素(STZ)、乙酰胆碱(Ach)、去甲肾上
腺素(NE)、柠檬酸钠均为美国 Sigma公司产品;内
皮素1(ET1)试剂盒:北京东亚生物制品公司,批号
S10950212;一氧化氮(NO)试剂盒:南京聚力生物医
学工程研究所,批号 050912;细胞间黏附分子1
(ICAM1)及血管细胞间黏附分子1(VCAM1):武
汉博士德公司产品。
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2 方法
2.1 动物模型的建立
50只大鼠随机分为 2组,正常 12只,造模 38
只。造模大鼠禁食12h后按文献[4,5]方法略作改
进。根据每只大鼠体重,一次性腹腔注射STZ60mg
·kg-1(STZ临用前用01mol·L-1柠檬酸钠缓冲
液配成1%,pH42的溶液),正常组腹腔注射等量
的柠檬酸钠缓冲液。72h后尾静脉取血,测血糖≥
167mmol·L-1、尿糖~,确定为糖尿病大鼠。
2.2 分组及给药
成模后,随机抽取24只分为模型组(12只)及
大黄煎剂组(12只),不成模及未入组者弃去不用。
大黄煎剂组给予大黄煎剂(生药)10g·kg-1灌胃,
其余2组每日给予同等容量纯净水灌胃。
2.3 标本收集
实验期间,大鼠自由进食、进水,持续给药8周。
大鼠末次给药后禁食12h,以3%戊巴比妥(80mg
·kg-1)腹腔注射麻醉,迅速开腹,分离腹主动脉,从
腹主动脉采血,取2mL分离血清,测定 NO;同时在
含有EDTANa2:抑肽酶(30μL∶40μL)的试管中加
入全血3mL,低温离心机离心3000r·min-1,离心
10min,取血浆后用放免法测定ET1。
2.4 大鼠胸主动脉血管环张力测定
参照文献[6]大鼠取血后,迅速打开胸腔,切取
胸主动脉段,置于已通有95% O2+5%CO2混合气
体(至少30min)4℃的 Kreb液(NaCl113mmol·
L-1,KCl47mmol·L-1,CaCl225mmol·L
-1,
KH2PO412mmol·L
-1,NaHCO3 25mmol·L
-1,
MgSO4·7H2O12mmol·L
-1,Glucose111mmol·
L-1,pH74±005)的培养皿中,分离周围组织,剪
成长约3mm的动脉环。悬置于盛有5mLKrebs液
的血管浴槽内,恒温(37±05)℃,标本一端固定于
浴槽底部,另一端与连接 RM6240B/C136生物信
号软件分析系统的JZ101肌张力换能器连接。于浴
槽底部持续通入95% O2+5% CO2的混合气体,静
息负荷20g,平衡60min,每20min换液1次,实
验用10-6mol·L-1的Ach检测内皮完整性,选择能
抑制由 062×10-6mol·L-1NE引起血管收缩
30%以上的血管用于实验。以 062×10-6mol·
L-1NE引起血管最大收缩为100%,计算不同浓度
Ach对血管的舒张率。
2.5 石蜡切片与免疫组化测定
留取胸主动脉时,另留取一段以4%多聚甲醛
固定,洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、片厚 5
mm,SP法免疫组化染色,应用彩色病理图文分析系
统计算病理切片组织中阳性染色面积与视窗面积的
百分比。
2.6 统计学处理
数据以 珋x±s表示,应用 SPSS110统计软件系
统中方差分析,自身前后对照比较应用配对t检验。
组间多重比较,数据经 Levene检验方差不齐者,应
用Dunnet’sT3检验。
3 结果
3.1 血糖的变化
经灌胃治疗8周后,模型组与大黄煎剂组各死
亡2只,其中模型组1只死于继发性腹部感染(可能
为腹部注射链脲佐菌素导致),其余死因不详,考虑
有可能死于酮症酸中毒或高渗综合征。各组治疗前
后血糖无变化。
3.2 ET1及NO的变化
经过8周后,模型组及大黄煎剂组与正常组相
比血浆ET1明显升高,NO明显下降,其差别有统
计学意义(P<005);大黄煎剂组与模型组相比血
浆ET1明显下降,NO明显升高,其差别有统计学
意义(P<005),见表1。
表1 8周后大鼠血浆ET1,NO的变化(珋x±s)
组别
剂量
/g·kg-1

ET1
/pg·mL-1
NO
/μmol·L-1
正常   - 12 9690±996 7560±489
模型   - 10 12342±10191) 5344±3771)
大黄煎剂 10 10 10933±9681,2) 6625±3961,2)
  注:与正常组相比1)P<005;与模型组相比2)P<005(表2同)
3.3 血管环在 NE刺激下的最大收缩坪值及血管
内皮依赖的舒张效应
3.3.1 大鼠胸主动脉环在用062×10-6mol·L-1
NE刺激下收缩,约2min后,血管环收缩张力达峰
值,模型组对 NE收缩反应明显强于正常组及大黄
煎剂组(P<005),且大黄煎剂组对NE的收缩反应
亦强于正常组(P<005)。
3.3.2 当各组收缩达坪值后,然后按递增浓度给药
法分别给予 Ach(10-8~10-5)。结果显示,各组胸
主动脉环呈浓度依赖性抑制 NE引起的血管收缩。
在相同Ach累积浓度下,模型组及大黄煎剂组对胸
主动脉环的舒张作用明显弱于正常组(P<005),
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模型组对胸主动脉环的舒张作用亦明显弱于大黄煎 剂组(P<005)。见表2。
表2 胸主动脉环在NE刺激下的最大收缩坪值及血管内皮对Ach浓度依赖的舒张效应(珋x±s)
组别
剂量
/g·kg-1

不同Ach浓度下舒张效应/%
10-8 10-7 10-6 10-5 NE最大收缩坪值
正常   - 12 1780±335 2744±290 4175±354 5841±487 9817±1137
模型   - 10 547±1131) 1065±3771) 2153±4661) 3171±5261) 12390±9991)
大黄煎剂 10 10 891±1751,2) 1758±2801,2) 3076±4511,2) 4387±3901,2) 11310±6661,2)
3.4 胸主动脉ICAM1,VCAM1的表达
正常组仅见较少的棕黄色颗粒状阳性物质表
达;模型组可见大量的棕黄色颗粒状阳性物质表达,
部分融合成片,阳性染色百分比明显高于正常组
(P<001);大黄煎剂组棕黄色颗粒状阳性物质表
达明显低于模型组(P<005),但高于正常组(P<
005),见图1,2。
4 讨论
图1 各组大鼠胸主动脉ICAM1的表达(×400)
A.正常组;B.模型组;C.大黄煎剂组
图2 各组大鼠胸主动脉VCAM1的表达(×400)
A.正常组;B.模型组;C.大黄煎剂组
  血管是由内皮细胞,平滑肌细胞和成纤维细胞
组成的活跃而完整的一个器官,多种细胞藕联在一
起,通过复杂的自分泌和旁分泌作用而相互调节。
其可以分泌 ET1,NO等来调节血管的收缩和舒张
平衡,任何偏离这种平衡状态的现象都被认为内皮
功能障碍。近年来内皮功能不全被认为是动脉粥样
硬化形成的早期特征。研究表明,高血糖、蛋白非酶
糖基化、氧化应激等在糖尿病血管病变中发挥了重
要作用。ET1与 NO的平衡失调介导了血管内皮
的损伤并导致血流动力学紊乱。而血流动力学及血
液流变学异常及内皮细胞损伤是各种糖尿病血管并
发症的共同病理表现及重要原因[7]。有专家指出,
糖尿病不仅是一个高血糖的疾病,还是一种血管性
疾病,也是一种炎症性疾病,已被视为与冠心病具有
同等危险的冠心病等危症[8]。且研究表明,动脉粥
样硬化的发生发展与 ICAM1及 VCAM1等黏附分
子的过度表达有关[9]。
本研究结果表明,大黄组大鼠血浆内皮素1分
泌较正常组大鼠显著升高,较糖尿病对照组显著降
低,其差别均有显著意义;大黄组大鼠血清一氧化氮
分泌较正常组大鼠显著降低,较糖尿病对照组显著
升高,其差别均有显著意义。表明大黄在抑制糖尿
病大鼠ET1的升高的同时,还可以升高血清一氧化
氮的水平,从而保护血管内皮功能。但是对糖尿病
大鼠ET1及NO作用仍不能达到正常大鼠水平。
由于内皮细胞功能的受损,导致 ET1及 NO的
分泌失衡。使8周末糖尿病大鼠胸主动脉环对肾上
腺素能受体激动剂 NE呈收缩增强,与正常组大鼠
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相比有显著性差异,与文献[10]研究一致。对浓度
依赖的Ach舒张反应下降,而应用大黄的糖尿病大
鼠,经过8周后表明可降低收缩增强趋势,且其对浓
度依赖的Ach的舒张反应提高,但对 Ach的舒张反
应未能达到正常组的水平。表明其对血管内皮细胞
具有保护作用。
笔者还发现糖尿病大鼠胸主动脉高度表达
ICAM1及 VCAM1,而大黄可以明显抑制血管
ICAM1及VCAM1的表达,但达不到正常大鼠的水
平。表明ICAM1及VCAM1在糖尿病大鼠动脉硬
化的发生、发展中扮演了重要角色,而大黄通过抑制
血管 ICAM1及 VCAM1的表达,而具有防治糖尿
病性动脉粥样硬化的作用。
本研究表明,大黄无降低血糖的作用,故而推断
其对内皮细胞的保护作用是非降低血糖依赖的,其
抗动脉硬化作用是多层次、多角度的。
[参考文献]
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University,Cangzhou061001,China;
2MedicalDepartmentofintegratedTCMWM,InternationalPeaceHospitalofBethun,Shijiazhuang050023,China)
[Abstract] Objective:Toexploretheprotectivemechanismofoficeihaleonthevascularpathologicalprocessindiabetesmel
litus(DM)rats.Method:AftertheDMratmodelwasestablished,24DMratswererandomlydividedintomodelgroup(12DMrats)
andRheumoficeinalegroup(12DMrats).Rheumoficeinalewasoralygivenin10g·kg-1perday,andtheothertwogroupswere
givenequalpurewater.8weekslater,bloodsampleswerecolectedtodeterminethelevelofnitricoxide(NO)andendothelin1(ET
1).ThoracicaorticringswaspreparedtoobservetheinhibitingefectofAchwithdiferentconcentrationoncontractioncausedbyNE.
AnotherpartofaortawasmadetoobservetheexpressionofICAM1andVCAM1bymethodofSPimmunohistochemistrystaining,Re
sult:RheumoficeinalegroupobviouslydecreasedthelevelofET1andincreasedtheNOcomparedwithmodelgroup(P<0.05
#

TheexpressionofICAM1andVCAM1couldbeobviouslyinhibitedinRheumoficeinalegroupcomparedwithmodelgroup.(P<0.
05).Conclusion:RheumoficeinalecoulddecreasethelevelofET1withincreasedtheNOindiabetesrats,andinhibittheexpres
sionofICAM1andVCAM1,whichmaybemechanismsofprotectingtheendotheliumofvesselindiabetesrats.
[Keywords] Rheumoficeinale;diabeticmodel;thoracicaorta;endothelium
[责任编辑 古云侠]
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