全 文 ：当归苦参丸方药固体发酵前后
２种水提取液的成分比较
王英姿１，韩春超２，张兆旺２，孙秀梅２
（１北京中医药大学 中药学院，北京 １００１０２；２山东中医药大学 药学院，山东 济南 ２５０３５５）
［摘要］ 目的：探讨固体发酵技术对中药成分提取的影响。方法：以当归苦参丸为例，对该方药作固体发酵前后２种水
提取液的阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏４个指标成分的综合比较。结果：综合评价 Ｙ值的顺序为 Ｙ发酵 ＞Ｙ未发酵。结论：当
归苦参丸方药经固体发酵后有利于药物成分的提取。
［关键词］ 当归苦参丸；固体发酵；水提取液；成分比较
［收稿日期］ ２００９０９１７
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０７０１１１０）
［通信作者］ 王英姿，Ｔｅｌ：（０１０）８４７３８６１５，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｚｉ＠ｓｉ
ｎａｃｏｍ
当归苦参丸源自《古今医鉴》中的参归丸，由当
归和苦参２味药组成。其功效主要为活血化瘀，清
热除湿，杀虫止痒。主要用于血燥湿热引起的头面
生疮，粉刺疙瘩，湿疹刺痒，酒糟鼻赤等。
固体发酵技术（ｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）是生物技术的一种，是指某些生长需水很少的微
生物利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行
的发酵。中药复方用固体发酵技术提取的主要理论
依据有：微生物及其代谢过程中产生丰富的酶类，能
降解大量中药植物纤维素，降低淀粉等高分子对中
药成分的包裹作用，利于有效成分溶出［１３］。用固体
发酵技术提取中药可以使某些在体内不能直接被利
用的药物有效活性组分，在体外消解得以完成而被
直接利用，并能除去大分子杂质，迅速发挥应有效
能。本文以当归苦参丸为例，对该方药作固体发酵
前后２种水提取液的阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干
浸膏４个指标成分的综合比较，探讨固体发酵技术
对中药成分提取的影响。
１ 材料
１１ 动物
昆明种小鼠，雄性，（２０±２）ｇ（北京维通利华实
验动物技术有限公司），动物饲养合格证号 ＳＣＸＫ
（京）２００２００３。
１２ 试药与试剂
药材购自济南建联药店，经山东中医药大学张
兆旺教授鉴定，当归为伞形科植物当归 Ａｎｇｅｌｉｃａ
ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｏｌｉｖ）Ｄｉｅｌｓ的干燥根经加工制成的饮片，苦
参为豆科植物苦参ＳｏｐｈｏｒａｆｌａｖｅｓｃｅｎａＡｉｔ的干燥根
经加工制成的饮片，均符合《中国药典》２００５年版
（一部）该药材项下的有关规定。鸡腿菇菌种购自
山东省农科院。阿魏酸、苦参碱对照品（中国药品
生物制品检定所，批号分别为 １１０７７３２００６１１，
１１０８０５２００５０７）；甲醇、乙腈为色谱纯（天津四友公
司）；水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。
１３ 仪器
精密ｐＨ计（ｐＨＳ３Ｃ型，上海雷磁仪器厂）；高效
液相色谱仪（ＨＰ１１００系列，美国 Ａｇｉｌｅｎｔ公司），电子
天平（ＹＰ６０１Ｎ型，上海精密科学仪器有限公司），离
心沉淀机（ＬＸＪⅡ型，上海医疗器械三厂），超声波清洗
器（ＫＱ１００Ｂ型，昆山市超声仪器有限公司）。
２ 方法与结果
２１ 样品液的制备
２１１ 未发酵方药（ＷＦＪ）提取液的制备［４］ 按处
方比例称取未发酵当归、苦参（１０～２０目）粗粉７５
ｇ，混匀，用“双提法”在常压下加热回流提取３次（３
煎加水量依次为方药重的１０，６，６倍，提取时间依次
为３０，１０，０５ｈ），提取液用４层纱布分别滤过，离
心（３０００ｒ·ｍｉｎ－１，１５ｍｉｎ），合并上清液，浓缩并定
容至１００ｍＬ，即得样品液ＷＦＪ（方药质量浓度为０７５
ｇ·ｍＬ－１）。挥发油另器保存。
２１２ 发酵后方药（ＦＪ）提取液的制备 按处方比
例称取未发酵当归、苦参粗粉（１０～２０目），用鸡腿
菇作菌种进行接种培养，以固体发酵菌丝体重为指
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标，考察药材量、生长温度、发酵时间及培养基添加
的麸皮量４个因素，以 Ｌ９（３
４）正交表进行设计试
验，优选当归苦参丸方药固体发酵条件。将发酵后
方药按２１１项下方法提取，依法制得样品液ＦＪ。
２２ 对照液的制备
２２１ 阿魏酸对照液的制备 精密称取阿魏酸对
照品６２５ｍｇ，置２５ｍＬ量瓶中，用甲醇溶解并定容
到刻度，摇匀，制成对照液 Ａ（每 １ｍＬ含阿魏酸
０２５０ｍｇ）。分别吸取对照液 Ａ０１，０２，０４，０６，
０８ｍＬ，用甲醇定容至５ｍＬ，即得对照液Ａ１～Ａ５。
２２２ 苦参碱对照液的制备 精密称取苦参碱对
照品３５０ｍｇ，用乙腈无水乙醇（８０∶２０）溶解并定
容至５ｍＬ，摇匀，制成对照液 Ｂ（每１ｍＬ含苦参碱
０７０ｍｇ）。分别吸取对照液 Ｂ１０，２０，４０，６０，
８０，１２０ｍＬ，用乙腈无水乙醇（８０∶２０）定容至 ５
ｍＬ，即得对照液Ｂ１～Ｂ６。
２３ 供试液制备
２３１ 阿魏酸供试液的制备［５］ 取２１项下样品
液ＷＦＪ和样品液ＦＪ各５０ｍＬ，于蒸发皿中蒸至近干，加
硅藻土 １５ｇ，搅匀，烘干，研细，以醋酸乙酯甲酸
（１９∶１）１００ｍＬ索氏提取２ｈ后，回收溶剂，残渣以
甲醇定容至１０ｍＬ，摇匀，即得供试液ＡＷＦＪ，ＡＦＪ。
２３２ 苦参碱供试液的制备［６］ 精密量取２１项
下样品液ＷＦＪ和样品液ＦＪ各１０ｍＬ，加氨水调 ｐＨ９～
１０，用氯仿萃取（２０ｍＬ×６），合并萃取液，回收溶
剂至干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至２５ｍＬ
量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试液
ＢＷＦＪ，ＢＦＪ。
２４ 阿魏酸的含量测定
２４１ 色谱条件 ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８色谱柱 （４６ｍｍ ×
２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相甲醇１％冰醋酸（２５∶７５）；检
测波长３２０ｎｍ；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量２０μＬ；
柱温２５℃。
２４２ 线性关系考察 精密称取２２１项下对照
液Ａ１～Ａ５，按２４１项下色谱条件，进样测定。以
峰面积（Ｙ）对样品浓度（Ｘ）进行回归，得回归方程
为 Ｙ ＝１０３７９７Ｘ＋４５３５７，ｒ＝０９９９８，表明在
０００５～００４ｇ·Ｌ－１线性关系良好。
２４３ 精密度试验 准确吸取２２１项下阿魏酸
对照液０２ｍＬ，按２４１项下色谱条件，重复进样６
次，测定阿魏酸吸收峰面积，ＲＳＤ１０％，表明精密
度良好。
２４４ 稳定性试验 准确吸取２３１项下供试液
ＡＦＪ０２ｍＬ，按２４１项下色谱条件，于０，２，４，６，８，
１０ｈ分别测定阿魏酸峰面积，ＲＳＤ１３％。表明供
试品溶液在１０ｈ内稳定。
２４５ 重复性试验 按照供试液 ＡＦＪ制备方法，平
行制备６份供试液，按２４１项下液相色谱条件，依
法测定，结果ＲＳＤ１２％。表明本方法重复性良好。
２４６ 加样回收试验 精密称取６份已知阿魏酸
含量的样品，分别加入一定量的阿魏酸对照品，按
２３１项下方法制备成供试液，测定阿魏酸含量，计
算回收率，结果平均回收率为９９４３％，ＲＳＤ１７％。
２４７ 含量测定 吸取２３１项下供试液 ＡＷＦＪ和
ＡＦＪ，按 ２４１项下色谱条件，进样测定，结果见
表１，图１。
表１ ２种供试液中各指标成分的含量测定值及标准化处理
供试液类别 阿魏酸／ｇ·Ｌ－１ 苦参碱 ／ｇ·Ｌ－１ 苦参总碱／ｍｇ·ｇ－１ 干浸膏／ｇ·ｇ－１ Ｙ
发酵后 ００２７０５２） ０５１２７１） １３２８０ ０３２９７２） ０７０７１
（０７０７１） （０７０７１） （０７０７１） （０７０７１）
未发酵 ００１０３２ ０４２２５ １２０３１ ０２０８２ －０７０７１
（－０７０７１） （－０７０７１） （－０７０７１） （－０７０７１）
注：括号内为标准化处理后数值；１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１。
２５ 苦参碱含量测定
２５１ 色谱条件 ＬａｎｂｏＮＨ２柱（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）；流动相乙腈无水乙醇３％磷酸溶液
（８０∶１０∶１０）；流速 １０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长 ２２０
ｎｍ；柱温３０℃；进样量２０μＬ。
２５２ 线性关系考察 精密称取２２２项下对照
液Ｂ１～Ｂ６，按２５１项下色谱条件，进样测定。以
峰面积（Ｙ）对样品浓度（Ｘ）进行回归，得回归方程
Ｙ＝３５８３３Ｘ－３５９４，ｒ＝０９９９９，表明在 ０１４～
１６８ｇ·Ｌ－１苦参碱线性关系良好。
２５３ 精密度试验 取２２２项下苦参碱对照液
Ｂ０８４ｇ·Ｌ－１，按２５１项下色谱条件，重复进样
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ａ对照品；ｂ方药发酵后；ｃ方药发酵前；１阿魏酸。
图１ 对照品、供试液ＨＰＬＣ图
６次，测定苦参碱峰面积，ＲＳＤ０４７％，表明精密度
良好。
２５４ 稳定性试验 取２３２项下供试液，按２５１
项下色谱条件，于０，２，４，６，８ｈ分别测定峰面积，结果
ＲＳＤ０４８％，表明供试品溶液在８ｈ内稳定。
２５５ 重复性试验 按照供试液 ＢＦＪ制备方法，平
行制备５份供试液，按２５１项下液相色谱条件，依
法测定，结果苦参碱 ＲＳＤ１２％。表明本方法重复
性良好。
２５６ 加样回收试验 精密称取６份已知苦参碱含
量的样品，分别加入一定量的苦参碱对照品，按
２３１项下方法制备成供试液，测定苦参碱含量，计
算回收率，结果平均回收率为９９２０％，ＲＳＤ２３％。
２５７ 含量测定 取 ２３２项下供试液 ＢＷＦＪ和
ＢＦＪ，按２５１项下色谱条件，进样测定，结果见表１，
图２。
ａ对照品；ｂ方药发酵后；ｃ方药发酵前；１苦参碱。
图２ 苦参碱对照品液ＨＰＬＣ图谱
２６ 苦参总碱含量测定
取２３２项下供试液１５ｍＬ（相当于苦参 ４５
ｇ），置于三角瓶中，水浴蒸干，残渣加乙醚５ｍＬ使
溶解。精密加００１ｍｏＬ·Ｌ－１硫酸液１０ｍＬ，摇匀 ，
水浴加热使残渣完全溶解，并除尽乙醚后放冷。加
新沸过的冷蒸馏水１５ｍＬ甲基红指示液 ２滴 ，用
００２０８４ｍｏＬ·Ｌ－１氢氧化钠试液滴定至黄色 ，即
得。以乙醇１５ｍＬ和００１ｍｏＬ·Ｌ－１硫酸液１０ｍＬ
作空白对照。按下式计算苦参碱的质量分数（ｍｇ·
ｇ－１），结果见表１（ｎ＝３）。苦参总碱质量分数（ｍｇ
·ｇ－１）＝Ｃ×（Ｖ０－Ｖ）２４８／４５。
式中 ，Ｃ为氢氧化钠滴定液摩尔浓度；Ｖ０为空
白消耗氢氧化钠滴定液毫升数；Ｖ为供试液消耗氢
氧化钠滴定液毫升数；苦参碱 Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ相对分子
质量为２４８。
２７ 干浸膏量的测定
按照《中国药典》２００５年版一部附录 ＸＡ浸出
物测定法，精密吸取２１项下样品液ＷＦＪ和样品液ＦＪ
各１０ｍＬ，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，
于１０５℃烘３ｈ，移至干燥器中，冷却３０ｍｉｎ，即刻精
密称重，计算干浸膏量。结果见表１。
２８ 试验结果的处理
将阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏４个指标
测定的数据按公式 Ｘｉｊ′＝（Ｘｉｊ－珋ｘｊ）／Ｓ进行标准化处
理。Ｘｉｊ′为标准化后的值，Ｘｉｊ为样品液 ｉ中成分 ｊ的
含量，珋ｘｊ为样品中 ｉ种成分 ｊ的平均值，Ｓｊ为成分 ｊ
的标准差。根据各指标在提取工艺选择中的主次地
位，给予不同的加权系数，以标准化后的值 Ｘｉｊ加权
后求和，即得综合评价 Ｙ值，其关系式：Ｙ＝
（阿魏酸＋苦参碱＋苦参总碱）／３×０７＋干浸膏 ×
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０３，结果见表１。
２９ 急性毒性试验
将体重（２０±２）ｇ小鼠，随机分成 ３组（发酵
前、发酵后、空白），每组１０只，试验前１２ｈ禁食不
禁水，第２日于８∶００，１２∶００，１６∶００时，将发酵前、后
的方药提取液（质量浓度为０７５ｇ·ｍＬ－１）分别灌
胃给药，每只 ０８ｍＬ／次，对照组灌胃等容量蒸馏
水，连续观察７ｄ，小鼠体重、行为活动无异常变化，
无１例死亡。
３ 小结与讨论
本实验以阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏为
综合评判指标，对当归苦参丸的方药作固体发酵前
后２种水提取液的比较，结果综合评价 Ｙ值的顺序
为Ｙ发酵 ＞Ｙ未发酵，表明当归苦参丸方药经固体发酵后
有利于药物成分的提取。
从当归苦参丸方药发酵前后指标成分的 ＨＰＬＣ
图谱看，发酵后供试液中阿魏酸ＨＰＬＣ图谱上多出一
峰，供试液中苦参碱ＨＰＬＣ图谱未见新成分产生。中
药成分复杂，微生物及其代谢过程中产生的酶，与中
药中的成分可能会发生反应，产生一些新成分或影响
某些成分的含量。本课题研究的重点是探讨固体发
酵技术在中药提取中的可行性和优越性，对成分的转
化及化合物结构的鉴定等，有待进一步列项研究。
为考察该方药经固体发酵后的安全性，对方药
发酵前后的水提取液作小鼠急性毒性试验，１ｄ的
最大给药量（９０ｇ· ｋｇ－１）相当于成人 （６０ｋｇ）每天
用药量（０３ｇ·ｋｇ－１）的３００倍，在观察期内，小鼠
的体重及行为活动无异常变化，无１例死亡。表明
该方药经固体发酵后与发酵前一样，急性试验未显
示毒性反应，在规定剂量范围内使用安全。
植物性中药材富含纤维素，以此为发酵基质，不
仅有利于药物成分的提取，利于生物循环，而且工业
化生产时环境污染小［８］。将固体发酵技术引入中
药提取工艺的研究，有一定的发展前景。本研究成
果为对当归苦参丸方药的固体发酵作进一步的化学
成分系统研究及药理学研究打下了基础。
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ａｇｏｏｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｓ？［Ｊ］Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ
Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，９３（３）：２６１
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ
ｏｆＤａｎｇｇｕｉＫｕｓｈｅｎｐｉｌｓｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＷＡＮＧＹｉｎｇｚｉ１，ＨＡＮＣｈｕｎｃｈａｏ２，ＺＨＡＮＧＺｈａｏｗａｎｇ２，ＳＵＮＸｉｕｍｅｉ２
（１ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０２，Ｃｈｉｎａ
２ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ２５０３５５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｈｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆｔｒａｄｉ
ｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）Ｍｅｔｈｏｄ：ＵｓｉｎｇＤａｎｇｇｕｉＫｕｓｈｅｎｐｉｌｓａｓａｎｅｘａｍｐｌｅ，ｆｏｕｒｉｎｄｅｘｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ，ｍａｔｒｉｎｅ，
ｍａｔｒｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｓａｎｄｄｒｙｅｘｔｒａｃｔｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙ，ａｎｄｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔｅｄ
ｐｉｌｓａｎｄｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｐｉｌｓｗａｓｅｖａｌｕｅｄＲｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｅｖａｌｕａｔｅｄｒｅｓｕｌｔｗａｓｔｈａｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔｅｄｐｉｌｓｗａｓｂｅｔｅｒ
ｔｈａｎｔｈａｔｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｓｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆＤａｎｇｇｕｉＫｕｓｈｅｎｐｉｌｓ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＤａｎｇｇｕｉＫｕｓｈｅｎｐｉｌｓ；ｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１００８０７ ［责任编辑 周驰］
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