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Technical condition of semi-bionic extraction in optimizing formula of Rhizoma Cyperi that had been extrscted by SFE-CO2 through homogeneous design

用均匀设计优选香附SFE-CO2萃取后药渣的半仿生法工艺条件



全 文 :用均匀设计优选香附 SFECO2萃取后药渣的
半仿生法工艺条件
孙秀梅1,时海燕1,张兆旺1,王英姿2
(1山东中医药大学,山东 济南 250355;2北京中医药大学 中药学院,北京 100102)
[摘要] 目的:优选香附经SFECO2萃取后药渣的半仿生法工艺条件。方法:将香附SFECO2萃取后的药渣,用均匀设计
UL(9
1×33)表,在煎提温度、煎提用水量、滤过、浓缩等条件相同的情况下,以相对分子质量≤1000提取物、HPLC总面积、干
浸膏为指标,综合评判,优选其提取的工艺条件。结果:3次煎提用水的 pH依次为20053,65082,89456,提取总时间为
39127h。结论:结合生产实际,确定3次煎提用水的pH依次为20,65,90,提取时间依次为20,10,10h。
[关键词] 香附;半仿生法;相对分子质量≤1000提取物;HPLC总面积;干浸膏
[收稿日期] 20090331
[基金项目]  国家自然科学基金课题(30672667)
[通信作者] 孙秀梅,教授,博士生导师,主要从事中药新药的开
发与中药炮制原理的研究,Tel:(0531)82628081,Email:sunxiumei8
@163com
  香附为莎草科植物莎草 CyperusrotundusL的
干燥根茎。具有行气解郁,调经止痛之功效[1]。香
附中挥发油为主要药效成分,其中 α香附酮又为挥
发油中主要成分,具有抗菌、松弛子宫平滑肌等药理
作用。
香附除含挥发油等非极性成分外,对其极性成
分的研究几乎是空白。据报道[2],香附醇提物对注
射酵母菌引起的大鼠发热有解热作用,对小鼠有安
定作用,使小鼠自发活动减少,迟缓;香附水提醇沉
物在低浓度时对离体及在体蛙、兔和猫心脏都具有
强心和减慢心率作用,高浓度皮下注射,可使蛙心心
跳停止于收缩期,其总生物碱、苷类、黄酮类和酚类
化合物的水溶液也都有强心和减慢心率的作用;王
明江等[3]发现香附水提液能明显抑制离体兔肠平
滑肌的收缩幅度与频率,同时也能拮抗乙酰胆碱和
氯化钡所致离体肠管平滑肌的兴奋作用;司金超
等[4]用不同浓度的香附水煎剂灌流大鼠离体脂肪
组织,发现香附水煎剂可促进脂肪组织释放游离脂
肪酸,并且存在剂量效应关系。可见,香附的极性部
位也有显著且广泛的药理作用。
本实验对香附经二氧化碳超临界流体萃取
(SFECO2)后的药渣,以相对分子质量≤1000提取
物、HPLC总面积、干浸膏为指标,用均匀设计法优
选其半仿生提取法的工艺条件。
1 材料
pH计(pHS2CA型,上海大中分析仪器厂);电
子分析天平(1/万,FA1104型,上海精科天平仪器
厂);紫外分析仪(UV3010型,日立公司);LC高效
液相色谱仪(SPD10A型,岛津制作所);医用超声
波清洗器(KQ250E型,昆山市超声仪器有限公
司);血清超滤器(DH系列,上海德宏生物医学科技
发展有限公司)。
香附饮片系莎草科植物莎草Crotundas的干燥
根茎在安徽沪谯中药饮片厂经炮制规范化研究加工
成的规范饮片用SFECO2萃取后的药渣。
乙腈、甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
21 SBE法提取工艺条件的优选 
将香附经 SFECO2萃取后的药渣,在煎提温度
(100℃)、煎提用水量(3次煎提加水量分别为药渣
质量的10,6,6倍)、滤过(提取液用4层纱布加100
目筛滤过)、离心(3000r·min-1,20min)浓缩等条
件相同的情况下,以相对分子质量≤1000提取物、
HPLC总面积、干浸膏为指标,确定考察因素与水
平,见表1,选用均匀设计法 UL(9
1×33)拟水平表
(中国航天工业总公司第三研究院提供)安排试验
方案,见表2。
22 样品液的制备
将香附SFECO2萃取后的药渣30g,按表2布点
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组合,常压下加热回流提取3次(加水量分别为药渣
重量的10,6,6倍;溶剂水的pH及提取时间按表2,
第1煎水的 pH用 HCl调整,第2,3煎水的 pH用
NaOH调整),提取液分别用4层纱布加100目筛滤
过,滤液依次定容至500,500,500mL,即得样品液。
表1 因素与水平
水平
第1煎水pH

第2煎水pH

第3煎水pH

煎煮总时间/h

1 2.00 6.50 8.00 2.00
2 2.50 6.50 8.00 2.00
3 3.00 6.50 8.00 2.00
4 3.50 7.00 8.50 3.50
5 4.00 7.00 8.50 3.50
6 4.50 7.00 8.50 3.50
7 5.00 7.50 9.00 5.00
8 5.50 7.50 9.00 5.00
9 6.00 7.50 9.00 5.00
表2 UL(9
1×33)试验设计
No A B C D
1 2.00 7.00 9.00 5.00
2 4.00 6.50 9.00 2.00
3 2.50 6.50 8.00 3.50
4 3.00 7.50 8.50 2.00
5 5.50 7.00 8.00 2.00
6 3.50 7.00 8.00 5.00
7 4.50 7.50 9.00 3.50
8 5.00 7.50 8.50 3.50
9 6.00 6.50 8.50 5.00
  注:3煎总时间为20(10,05,05),35(15,10,10),50
(20,15,15)h。
23 供试液的制备
231 供试液A的制备 依次取22 项下样品
液250,250,250mL,分别离心(3000r·min-1,20
min),合并上清液,浓缩并定容至50mL,即得供试
液A1~9(香附药渣的质量浓度为300g·L
-1)。
232 供试液B的制备 精密吸取231项下样品
液A1~9各10mL,水浴蒸至近干,加硅藻土2g,拌
匀,烘干,研匀,转移至磨口三角瓶中,称重,加甲醇
20mL,超声提取(250W,40kHz)30min,放冷,用
甲醇补足失重,摇匀,抽滤,取续滤液,用 045μm
微孔滤膜滤过,即得供试液 B1~9(香附药渣的质量
浓度为150g·L-1)。
233 供试液C的制备 取22项下剩余样品液,
经预处理后用1000相对分子质量的中空纤维膜滤
过,合并3煎的滤液,水浴浓缩,用蒸馏水定容至50
mL,即得相对分子质量≤1000提取物的供试液
C1~9(香附药渣的质量浓度为300g·L
-1)。
24 HPLC总峰面积测定
241 液相色谱条件 AichromBond1C18色谱柱
(46mm ×250mm,5μm);流动相 水(A)乙腈
(B)。梯度洗脱0~10min,5%~10% B;10~17min,
10% B;17~40min,10% ~193% B;流速 1mL·
min-1;检测波长212nm;柱温 室温;进样量20μL。
242 精密度试验 精密吸取232项下供试液
B5,连续重复进样6次,按241项下液相色谱条
件,依法测定,见图1,表3。
243 稳定性试验 精密吸取232项下供试液
B5,按241项下液相色谱条件于0,4,6,12,24
h,各测定1次,见表4。
244 重复性试验 照供试液 B2制备方法,平行
制备6份供试液,按241项下液相色谱条件,依法
测定,见表5。
图1 香附SBEHPLC图
245 HPLC总峰面积测定 精密吸取 232项
下供试液B1~9,平行进3样3次,按241项下液相
色谱条件,依法测定。
25 相对分子质量≤1000提取物的测定
取233项下供试液C1~9各15mL,平行取3份,
置蒸发皿中,水浴蒸至近干,于105℃烘至恒重,计算
相对分子质量≤1000提取物的含量,结果见表3。
表3 相对分子质量≤1000提取物的质量分数(n=3)
供试品
质量分数/mg·g-1
1 2 3
RSD
/%
C1 46.66 46.40 45.83 0.92
C2 37.62 39.10 39.18 2.3
C3 36.52 37.09 37.85 1.8
C4 37.62 37.73 37.81 0.3
C5 30.44 31.73 31.81 0.4
C6 31.96 31.39 30.86 1.5
C7 36.75 37.24 37.81 1.4
C8 37.73 38.08 37.96 0.8
C9 23.94 24.66 24.32 1.5
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26 干浸膏得率的测定
取231项下供试液 A1~9(离心后溶液)各10
mL,每液取3份,置蒸发皿中,水浴蒸至近干,于105
℃烘至恒重,计算干浸膏质量分数。结果见表4。
表4 干浸膏量测定(n=3)
供试品
质量分数/mg·g-1
1 2 3
RSD
/%
A1 21593 21447 20677 232
A2 12483 12610 12790 122
A3 13927 13883 14037 06
A4 11977 12200 12083 092
A5 10683 10657 11057 21
A6 12340 12263 12143 08
A7 11917 12313 12577 27
A8 13910 13680 13883 09
A9 12053 11977 12013 03
27 综合评判优选工艺条件
将相对分子质量≤1000提取物、HPLC总面
积、干浸膏3个指标测定的数据按公式 Xij′=(Xij-
珔Xj)/Sj进行标准化处理。Xij′为标准化后的值,Xij为
样品液i中成分j的含量 珔Xj为样品中 i种成分 j的
平均值,Sj为成分j的标准差。根据各指标在提取工
艺选择中的主次地位,给予不同的加权系数,以标准
化后的值Xij加权后求和,即得综合评价 Y值,结果
见表5。
表5 综合各指标成分含量及标准化处理
No
相对分子质量≤1000
提取物/mg·g-1
HPLC
总面积
干浸膏
/mg·g-1


(46.30)
1.7108
(2990131.59)
1.9911
(212.39)
2.54
18.4925

(38.63)
0.4641
(1751214.33)
-0.7686
(126.2778)
-0.2679
1.4488

(37.16)
0.2230
(2457812.81)0
.8053
(139.49)
0.1621
3.3313

(37.73)
0.3157
(2123668.35)
0.0610
(120.87)
-0.4440
1.8861

(31.83)
-0.6425
(1566215.69)
-0.8580
(107.99)
-0.8632
-7.0768

(30.89)
-0.7949
(1884290.06)
-0.4722
(122.49)
-0.3912
-6.8959

(37.27)
0.2416
(2003206.43)
-0.2073
(122.69)
-0.3847
0.8942

(37.92)
0.3487
(2676008.96)
-1.1807
(138.24)
0.1216
0.1959

(24.31)
-1.8665
(2378802.64)
0.6294
(120.14)
-0.4675
-12.2760
注:括号中的数据为原始数据;Y=相对分子质量≤1000提取物 ×7
+HPLC总面积×2+干浸膏×1。
将表2中的数值及表5中的 Y值用 JYSYSJ软
件经二次多项式逐步回归统计处理,得回归方程
F=33018462013638B+8153064C+0983
5541A2 +1259419B2 +2788087C2 +6562
716AB6837388AC,r=0999858,F=5022434。
查F值表 F005(7,1)=2368,F005(7,1)<F,P<
005,回归方程有意义。再将方程在计算机上进行
优化处理,得出优化结果A=20053,B=65082,C
=89456,D=39127。结合生产实际,确定3煎
用水的 pH依次为 20,65,90;提取时间依次为
20,10,10h。
28 工艺条件的验证试验
按照27项下优选出的工艺条件,依21~26
项下各指标的测定方法,依法试验,按27项下方法
依法数据处理,即得综合评价Y′值,见表6。结果表
明,验证试验提取液的综合评价Y′值为241086接
近预测值(Y=262954)。
表6 验证试验提取液中各指标成分含量的
标准化值及综合评价值 珋x±s,n=3
No
相对分子质量≤1000
提取物/mg·g-1
HPLC总面积
干浸膏
/mg·g-1
1 52.91 2651572.39 213.97
2 52.11 2629353.91 216.27
3 53.20 2514030.78 209.10
RSD/% 1.07 2.84 1.72
Y 241086
3 小结与讨论
将香附规范化饮片 SFECO2萃取后的药渣,以
相对分子质量≤1000提取物、HPLC总面积、干浸
膏为综合评判指标,优选除挥发油等脂溶性成分之
外的药效物质半仿生法提取工艺参数为 A=
20053,B=65082,C=89456,D=39127,结合
生产实际,确定半仿生法3次煎提用水的 pH依次
为 20,65,90;提取时间依次为 20,10,10h。
实验结果是根据半仿生法理论,确定各个指标
的加权系数及综合评判Y值的关系式Y=相对分子
质量≤1000提取物 ×7+HPLC总面积 ×2+干浸
膏×1。针对各个指标的单位和量纲不同,先对各数
值进行标准化处理,然后根据各指标在工艺选择中
的主次,确定不同的加权系数。以标准化处理加权
求和后的Y值为综合评判指标,优选出半仿生法较
佳工艺条件,这样较将各指标数值直接相加更科学
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合理。
据作者的调研分析,中药药效物质中绝大多数
单体化合物的相对分子质量≤1000。以相对分子
质量≤1000的提取物量为指标,能体现中药整体、
综合、客观、模糊的特点。本研究为中药研究中选择
指标成分提供了一种新思路,即使对单体成分一无
所知的中药,也可以用相对分子质量≤1000的提取
物量为指标,选择提取工艺和控制其质量,这对中药
现代化研究是很有借鉴意义的。
[参考文献]
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Technicalconditionofsemibionicextractioninoptimizingformulaof
RhizomaCyperithathadbeenextrsctedbySFECO2through
homogeneousdesign
SUNXiumei1,SHIHaiyan1,ZHANGZhaowang1,WANGYingzi2
(1ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;
2BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100102,China)
[Abstract] Objective:TooptimizetheextractioncondtionsinthemodificationofRhizomaCyperi,whichhadbeenextrsctedby
thetechniqueofsupercriticalCO2extractionMethod:Thesemibionicextraction(SBE)conditionswereoptimizedthroughhomogene
ousdesignwhiletheextracts(≤1000),thetotalareaofHPLCanddryextractswereadoptedasmarkersResult:TheoptimizedSBE
extractionconditionsarethefolowing:PHinfirstextractionwasadjustedto20053AndthenPHinsecondandthirdextractionad
justedto65082and89456,timeofthewholeextractedprocesswas39127hConclusion:Combinethefactionofproduction,we
makesuretheconclusionis:pHinfirstextractionwas200,pHinsecondandthirdextractionadjustedto650and900,durationof
runwas20h,10hand10h,respectively
[Keywords] RhizomaCyperi;semibionicextraction;extracts(≤1000);totalareaofHPLC;dr
[责任编辑 周驰]
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