全 文 ：黑骨藤多糖含量测定方法研究
孙　磊，乔善义，赵毅民
（军事医学科学院 毒物药物研究所，北京 １００８５０）
［摘要］　目的：对黑骨藤中的活性多糖进行含量测定方法研究。方法：以精制黑骨藤多糖测得黑骨藤多糖对葡萄糖的换
算因子；采用苯酚硫酸比色法测定黑骨藤粗多糖部位的多糖含量。结果：黑骨藤粗多糖部位的多糖含量为５４６８％（ＲＳＤ
３０％，ｎ＝６），平均加样回收率１０１７％（ＲＳＤ６０％，ｎ＝６）。结论：该方法简便，快速，测定结果更接近真实值。
［关键词］　黑骨藤；多糖；含量测定
［收稿日期］　２００８１２０９
［基金项目］　国家科技支撑计划（２００６ＢＡ１０８Ｂ０３０８）
［通信作者］　乔善义，Ｔｅｌ：（０１０）６６９３０６３４，Ｅｍａｉｌ：ｃｒｂｊ６１１２０２＠ｓｉ
ｎａ．ｃｏｍ
　　黑骨藤学名西南杠柳 ＰｅｒｉｐｌｏｃａｆｏｒｅｓｔｉＳｃｈｌｔｒ．，
是萝摩科Ａｓｃｌｅｐｉａｄａｃｅａｅ杠柳属ＰｅｒｉｐｌｏｃａＬ．植物，在
我国西南地区称之为黑骨藤。黑骨藤全株供药用，
具有通经络、祛风湿、活血、消炎等功效，用于治疗风
湿性关节炎、跌打损伤、胃痛、消化不良、闭经、痢疾
等症［１２］。本课题组研究发现，黑骨藤多糖提取物具
有良好的抗炎和免疫抑制活性，具有广阔的开发应
用前景，已经申请了中国发明专利 （专利号
ＣＮ２００７１０１８８０９９２）。为了开发利用黑骨藤多糖，
须建立一种比经典方法更可行和较为准确的多糖部
位中糖含量的测定方法。
多糖含量测定的经典方法是 Ｄｕｂｏｉｓ等提出的
苯酚硫酸比色法［３］。其原理是苯酚硫酸试剂与单
糖脱水形成的糠醛衍生物缩合成有色物质，在４９０
ｎｍ处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系［４］。
但是不同单糖与苯酚硫酸试剂显色情况不同，其标
准曲线的斜率也不同，因此单纯用葡萄糖作标准曲
线来计算多糖含量必然会存在较大误差。对于杂多
糖，分析结果必须根据各单糖的组成比及各单糖的
标准曲线的校正系数加以校正计算［４］，才能获得准
确的结果，操作比较繁琐。针对这个问题，有学者采
用测定换算因子的方法来消除单纯以葡萄糖作标准
曲线引起的误差［５８］。为保证测定换算因子方法的
准确性，本研究测定了精制黑骨藤多糖的１３ＣＮＭＲ
谱以及反映黑骨藤多糖精制前后单糖组成的 ＨＰＬＣ
谱，在证明精制黑骨藤多糖中基本不含其他杂质且
单糖组成与黑骨藤粗多糖基本相同的基础上，以精
制黑骨藤多糖测得黑骨藤多糖对葡萄糖的换算因
子，再以此校正采用苯酚硫酸比色法测定的黑骨藤
粗多糖部位的多糖含量。
１　材料
１．１　仪器
Ｌ２０００型液相色谱仪（日本Ｈｉｔａｃｈｉ公司）；ＵＶ／
ＶＩＳ２８０２型紫外可见分光光度计（美国 Ｕｎｉｃｏ公
司）；Ｎ１０００ＤＭＡ型旋转蒸发仪（日本 Ｅｙｅｌａ公司）；
ＬＸＪＩＢ型低速多管离心机（上海安亭科学仪器
厂）；电子天平（德国 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；ＳＨＺＤ型循环
水泵（河南省巩义市英峪予华仪器厂）。
１．２　试剂与试药
黑骨藤生药购自云南省大理州巍山县医药有限
责任公司，产地为云南大理，经本所马其云高级实验
师鉴定为Ｐ．ｆｏｒｅｓｔｉ。黑骨藤生药经碾碎后，备用。
苯酚为重蒸酚，购自北京鼎国生物技术有限责任公
司；１苯基３甲基５吡唑啉酮（ＰＭＰ）购自美国 Ｓｉｇ
ｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司；三氟乙酸（ＴＦＡ）购自美国 Ａｃｒｏｓ
Ｏｒｇａｎｉｃｓ公司；无水葡萄糖、甲醇、乙醇、浓硫酸、氢
氧化钠和盐酸均为分析纯。
２　方法与结果
２．１　粗多糖和精制多糖的制备
取经破碎的黑骨藤生药５００ｇ，９５％乙醇回流提
取２次。残渣挥干溶剂后，再以水回流提取２次，每
次２ｈ，合并水提液并浓缩。向黑骨藤水提液中加入
９５％乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为８０％，置４
℃冰箱中过夜，次日离心并将沉淀除醇后冷冻干燥，
即得黑骨藤粗多糖。将所得沉淀以水复溶，再次加
入９５％乙醇调整溶液中乙醇体积分数至８０％，放置
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过夜后离心、除醇、冷冻干燥。将所得沉淀配制成水
溶液，与等体积 ｓｅｖａｇ试剂（三氯甲烷正丁醇４∶１）
混合，充分振摇后静置，除去蛋白层，此过程反复多
次，直至多糖溶液在２８０ｎｍ处无紫外吸收。将多糖
溶液配制成２５％的溶液，加入体积分数７５％的过
氧化氢原液，用０５ｍｏｌ·Ｌ－１的氢氧化钠调整其ｐＨ
至８～９，４５℃水浴４ｈ，将多糖脱色液转入透析袋中
对流水透析１ｄ，再对蒸馏水透析３ｄ，将透析液过滤
后冷冻干燥得淡黄色固体［９］。将此淡黄色固体再
次８０％乙醇沉淀，并用无水乙醇、丙酮反复洗涤多
次后６０℃真空干燥，即得精制黑骨藤多糖。精制黑
骨藤多糖的１３ＣＮＭＲ图谱（溶剂为 Ｄ２Ｏ）见图１，化
学位移９８～１１０的信号为糖的端基碳信号，６５～８５
的为糖氧环的Ｃ２～Ｃ４信号，６０左右的为 Ｃ５或 Ｃ６信
号，１８～２０的为甲基五碳糖的 Ｃ６信号，除上述糖信
号外，未见其他信号，由此可判断精制的黑骨藤多糖
中基本不含其他杂质。
图１　精制黑骨藤多糖１３ＣＮＭＲ图
２．２　ＰＭＰ衍生化法测定粗多糖和精制多糖的单糖
组成［１０］
以精制黑骨藤多糖测定黑骨藤多糖对葡萄糖的
换算因子，前提是精制黑骨藤多糖与黑骨藤粗多糖
具有基本相同的单糖组成，且精制多糖中尽可能无
非糖类成分。为了检验精制过程是否对黑骨藤多糖
的单糖组成造成影响，采用ＰＭＰ衍生化法测定了黑
骨藤粗多糖和精制多糖的单糖组成。ＰＭＰ衍生化
法反应条件较温和，产物无立体异构，操作简便，灵
敏度较高，适用于多糖样品的单糖组成测定。同时，
根据精制黑骨藤多糖的１３ＣＮＭＲ图谱判断精制黑骨
藤多糖中基本不含其他杂质。
２．２．１　衍生化样品的制备　精密称定黑骨藤粗多
糖和精制黑骨藤多糖各５ｍｇ，分别加入２ｍｏｌ·Ｌ－１
三氟乙酸１ｍＬ于１００℃水浴６ｈ，从中取出２００μＬ
置具塞试管中，氮气吹干，吹的同时反复加入甲醇以
除净三氟乙酸。在水解样品中加５０μＬ０３ｍｏｌ·
Ｌ－１的氢氧化钠溶液和５０μＬ０３ｍｏｌ·Ｌ－１的 ＰＭＰ
甲醇溶液，混匀后于７０℃水浴１００ｍｉｎ，冷却至室温
后加５０μＬ０３ｍｏｌ·Ｌ－１的盐酸溶液中和，加水至１
ｍＬ，最后加入等体积三氯甲烷除去未反应的 ＰＭＰ。
水相减压浓缩至干后以 ３００μＬ水溶解并以 ０４５
μｍ滤膜过滤后备用。
２．２．２　 ＨＰＬＣ 条 件 　 Ｄｉａｍｏｎｄ Ｃ１８色 谱 柱
（０２５ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相１７％乙腈８３％
０１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸盐缓冲液（ｐＨ６７０）；紫外检测
器；检测波长２５０ｎｍ；流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量２０
μＬ。黑骨藤粗多糖和精制黑骨藤多糖的 ＰＭＰ衍生
物ＨＰＬＣ图分别见图２，３，由图可见，黑骨藤多糖精
制前后其糖组成未见明显变化。
１．甘露糖；２．鼠李糖；３．半乳糖醛酸；４．葡萄糖；
５．半乳糖；６．木糖；７．阿拉伯糖（图３同）。
图２　黑骨藤粗多糖ＰＭＰ衍生物ＨＰＬＣ图
图３　精制黑骨藤多糖ＰＭＰ衍生物ＨＰＬＣ图
２．３　葡萄糖标准曲线的绘制
２．３．１　标准系列溶液的配制　精密称定１０５℃干
燥至恒重的无水葡萄糖２４８ｍｇ，定容至５０ｍＬ量
瓶中，配制成４９６ｍｇ·Ｌ－１的储备液。从储备液中
分别取出１０，２０，３０，４０，５０，６０ｍＬ置于６个
５０ｍＬ量瓶中，定容，配制成 １０，２０，３０，４０，５０，６０
ｍｇ·Ｌ－１的葡萄糖标准系列溶液。
２．３．２　苯酚溶液的配制　称定重蒸苯酚５０ｇ，用
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蒸馏水定容至１００ｍＬ棕色量瓶中，临用现配。
２．３．３　标准曲线的绘制　取葡萄糖标准系列溶液，
从中各精密吸取２０ｍＬ分别置于２５ｍＬ量瓶中，空
白取２０ｍＬ水，各加５％的苯酚１８ｍＬ后充分振
摇，再迅速加入７５ｍＬ浓硫酸，振摇，室温放置３０
ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测定其吸光度。以葡萄糖浓度
（Ｃ）对吸光度（Ａ）回归，得回归方程Ｃ＝７８４３４８Ａ＋
０２７４１，ｒ＝０９９９８。葡萄糖对照品在１０～６０ｍｇ·
Ｌ－１的线性关系良好。
２．４　换算因子的计算
精密称定精制黑骨藤多糖２４９ｍｇ，定容至２５
ｍＬ量瓶中，从中取出２５ｍＬ置于另一２５ｍＬ量瓶
中，定容，配制成１００ｍｇ·Ｌ－１的待测溶液。精密吸
取精制多糖待测液２０ｍＬ，按测定标准曲线的方法
测定其吸光度值，根据标准曲线计算其中多糖浓度。
按ｆ＝Ｗ／ＣＤ计算换算因子，其中 Ｗ为样品质量
（ｍｇ），Ｃ为多糖质量浓度（ｍｇ·Ｌ－１），Ｄ为样品溶
液的稀释倍数，测得ｆ＝３１５（ｎ＝３）。
２．５　粗多糖的含量测定
精密称定黑骨藤粗多糖２４９ｍｇ，定容至２５ｍＬ
量瓶中，从中取出２５ｍＬ置于另一２５ｍＬ量瓶中，
定容，配制成约为１００ｍｇ·Ｌ－１的待测溶液。精密
吸取粗多糖待测液２０ｍＬ，按测定标准曲线的方法
测定其吸光度值，计算多糖含量，多糖含量 ＝ＣＤｆ×
１００／Ｗ，测得黑骨藤粗多糖部位的多糖质量分数为
５４６８％，ＲＳＤ３０％（ｎ＝６）。
２．６　精密度试验
精密吸取黑骨藤粗多糖待测液２０ｍＬ，按测定
标准曲线的方法测定其吸光度值，平行测定６份，其
吸光度平均值０２０５，ＲＳＤ３０％，表明此方法精密
度良好。
２．７　稳定性试验
精密吸取黑骨藤粗多糖待测液 ２０ｍＬ，按测
定标准曲线的方法操作，每隔１ｈ测定其吸光度，
结果表明样品在 ４ｈ内显色稳定，ＲＳＤ０２２％
（ｎ＝５）。
２．８　加样回收率试验
精密吸取已知含量的黑骨藤粗多糖样品溶液
１０ｍＬ６份，分别置于６个２５ｍＬ量瓶中，分别加入
葡萄糖标准系列溶液１０ｍＬ，按测定标准曲线的方
法 操 作，按 下 式 计 算 加 样 回 收 率：Ｒ ＝
［（Ｍ－Ｐ）／Ａ］×１００％，式中Ｐ为１个已准确测定的
药量，Ｍ为（Ａ＋Ｐ）药量混合后进行回收实验所得测
定值的均值，Ａ为标准品加入量。测得平均加样回
收率为１０１７％，ＲＳＤ６０％，见表１。
表１　葡萄糖加样回收率
Ａ／ｍｇ·Ｌ－１ Ｍ／μｇ 回收率／％ 均值／％ ＲＳＤ／％
９９２ ２６４５ ９８７９ １０１７ ６０
１９８４ ３５００ ９２５１ 　 　
２９７６ ４９４６ １１０３０ 　 　
３９６８ ５７０８ １０１９０ 　 　
４９６０ ６９２１ １０６００ 　 　
５９５２ ７６５１ １００６０ 　 　
　　注：Ｐ＝１６６５ｍｇ·Ｌ－１。
３　讨论
多糖含量的测定大多采用苯酚硫酸比色法。
该方法的原理是：多糖经浓硫酸水解，产生单糖，单
糖在浓硫酸加热作用下，失去３分子水，生成糠醛衍
生物，糠醛衍生物进一步与苯酚缩合成有色物质。
该有色物质在波长 ４９０ｎｍ处有紫外吸收，并在一
定浓度范围内，与糖的浓度呈线性关系，因此可用比
色法测定其含量。
对于匀多糖，可直接以其组成糖作标准曲线。
但植物多糖大多为杂多糖，对于这些由不同糖残基
构成的杂多糖，如使用某一种单糖作标准曲线，则会
造成很大误差，因为不同单糖的标准曲线的斜率不
同。如果采用与杂多糖组成相同的混合单糖制作标
准曲线，或者采用以葡萄糖为标准再经校正系数校
正的方法［１１］，则均需先测定多糖的糖组成及准确的
摩尔比，试验过程比较繁琐。本研究利用精制黑骨
藤多糖测得黑骨藤多糖对葡萄糖的换算因子，可以
消除单纯以葡萄糖为标准计算黑骨藤多糖含量带来
的误差，且操作简便、快速。
在采用换算因子来消除以葡萄糖为标准计算多
糖含量带来的误差的方法中，需要制备精制多糖，但
如何保证所制备的精制多糖最大程度去除了杂质，
又不至于使糖组成发生剧烈改变，是使用此方法测
定多糖含量的基础，也是一个亟待解决的问题。本
研究中首先测定了精制黑骨藤多糖的１３ＣＮＭＲ谱，
结果表明其中已基本不含其他杂质；其次，采用
ＰＭＰ衍生化，ＨＰＬＣ检测的方法测定了精制黑骨藤
多糖和黑骨藤粗多糖的单糖组成 ＨＰＬＣ谱，结果显
示黑骨藤多糖在精制前后其糖组成未见明显变化。
这２个结果可以充分保证以此方法来测定多糖含量
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其结果是准确可靠的。该方法对目前中药多糖类药
物研发中多糖的含量测定具有指导意义。
本研究还考察了试验过程中水浴对试验结果的
影响，结果表明加入浓硫酸后是否水浴对试验结果
无影响。对吸光度有较大影响的是反应液的温度，
当反应液较热时，单位体积的反应液中含有的溶质
的量较少，测得的吸光度较低。因此无论是室温放
置３０ｍｉｎ，还是反应后冷水浴，只要其充分冷却，即
可获得准确的吸光度和良好的重现性。
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ＳＵＮＬｅｉ，ＱＩＡＯＳｈａｎｙｉ，ＺＨＡＯＹｉｍｉｎ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＰｅｒｉｐｌｏｃａｆｏｒｅｓｔｉ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｏｆＰ．ｆｏｒｅｓｔｉ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｔｏｇｌｕｃｏｓｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｒｅｆｉｎｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｒｕｄｅ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｕｌｆｕｒｉｃｐｈｅｎｏｌｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｒｕｄｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎＰ．ｆｏｒｅｓｔｉ．ｗａｓ５４６８％
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