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Vol.34，Issue 3
February，2009
第 34 卷第 3 期
2009 年 2 月
夏枯草种质资源遗传多样性的 AFLP 分析
沈宇峰 1,2，孙乙铭 2,3，沈晓霞 2*，江建铭 2，王志安 2，俞旭平 2
（1. 浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310029；
2. 浙江省中药研究所，浙江 杭州 310023；3. 浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）
[摘要] 目的：通过对 8 份夏枯草种质资源的 AFLP 分析，探求各种质间的遗传多样性。方法：采用扩增片段长度多态
性(AFLP)标记，在 DNA 水平上进行遗传多样性研究，筛选了 32 对选择性扩增引物，将扩增出的条带作为原始矩阵，用
NTSYS-PC 软件计算并分析了夏枯草种质间的相似度，构建了遗传系统进化树。结果：①SDS 法提取的夏枯草基因组 DNA
质量较佳，能够满足 AFLP 分析的要求；②从 32 对选择性扩增引物中，筛选出 10 对多态性较强、带型较好、分辨率较高的
组合；③构建了夏枯草 AFLP 指纹图谱，将 8 个夏枯草种质全部区分开来；④通过构建进化树，把 8 个种质分成 3 类。结论：
夏枯草种质资源有丰富的遗传多样性，某些形态特征差异和基因型存在相关性。
[关键词] 夏枯草；种质资源；扩增片段长度多态性；遗传多样性

夏枯草为唇形科夏枯草属植物夏枯草 Prunella
vulga Linn．的干燥果穗，因“夏至后即枯”得名，是
常用的传统中药之一。夏枯草有降压、降糖、抗菌、
抗炎、抗过敏及抗病毒等功效[1]。在我国，夏枯草
主产于湖南、安徽、浙江和江苏，但是各地的夏枯
草种质资源混杂，而且不同地区的种质药用成分含
量差别很大，严重影响夏枯草药材质量的稳定性，
已经成为夏枯草规范化栽培(GAP)及优良品种(系)
大面积推广的瓶颈。在分子水平上，对夏枯草种质
资源进行遗传多样性分析，揭示它们的遗传基础，
对解决当前夏枯草种质资源混杂，指导品种选育具
有重要的意义。
1 材料
1.1 供试夏枯草 收集了 8 份野生夏枯草种质的
种子，种植于同一试验区，经浙江省中药研究所俞
旭平鉴定为唇形科夏枯草属植物夏枯草，取 8 份种
质的新鲜幼嫩叶片提取基因组 DNA，每份种质测量
10 个单株的地上部分形态参数，取平均值，见表 1。
1.2 试剂 AFLP 接头和引物均由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成。EcoRI(2 万 U·mL-1，0.25
mL)，MseI(1 万 U·mL-1，0.025 mL)，BSA(10 g·L-1，
0.25 mL)，T4 DNA Ligase(40 万 U·mL-1，0.025 mL)

[收稿日期] 2008-06-20
[基金项目] 浙江省科技厅重大项目(2005C12002-02)
[通信作者] *沈晓霞，Tel：(0571)85241074，E-mail：xiaoxiashen@sina.
com
表 1 8 份夏枯草种质地上部分形态参数
果穗 序号 种质来源 株高
/cm
茎色 叶色
量/枚 长/cm 直径/cm
1 四川南充 29.6 淡紫 浅绿 7.90 4.4 1.2
2 浙江文成 34.8 紫红 深绿 11.0 6.0 1.3
3 浙江磐安 31.2 紫红 深绿 12.0 6.7 1.3
4 浙江乐清 34.2 紫红 深绿 11.8 6.9 1.4
5 浙江淳安 31.3 紫红 深绿 13.3 7.2 1.4
6 浙江景宁 35.3 紫红 深绿 11.3 6.7 1.3
7 浙江宁海 31.8 紫红 深绿 13.1 6.8 1.3
8 浙江临安 32.1 紫红 深绿 13.5 7.3 1.4

由纽英伦生物技术（北京）有限公司生产，Taq DNA
聚合酶(2 U·μL-1，1 000 U)由北京鼎国生物技术有限
责任公司生产。
1.3 仪器 Bio-Rad smart spec-plus 核酸蛋白分析
仪， Sigma 3K15 冷冻离心机， Bio-Rad Dyad
PTC-0220 PCR 仪，Bio-Rad GS-800 扫描仪，Bio-rad
T2A 凝胶成像仪，天能 EPS-100 电泳仪。
2 方法
2.1 DNA 提取 采用 CTAB 法、SDS 法、尿素法，
对夏枯草幼嫩叶片进行基因组 DNA 的提取。
2.2 酶切 每个反应总体积为 20 μL，其中包括夏
枯草基因组 DNA (100 mg·L-1)10.0 μL，EcoRI 0.5
μL，MseI 0.5 μL，BSA 0.2 μL，EcoRI buffer 2.0 μL，
ddH2O 6.8 μL。37 ℃酶切 5 h，酶切后 70 ℃反应 15
min，使酶失活，再次离心后放置在冰上。
2.3 连接 酶切后，在酶切体系中加入接头连接反


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应液。EcoRI 接头的上游接头为 5′-CTCGTAGACT
GCGCGTACC-3′，下游接头为 5′-AATTGGTA
CGCAGTCTAC-3′；MseI 接头的上游接头为
5′ -GACGATGAGTCCTGAG-3′，下游接头为
5′-TACTCAGG ACTCAT-3′。接头连接反应液包
括 5.0 μmol·L-1 EcoRI 上游接头 2.5 μL，5.0 μmol·L-1
EcoRI 下游接头 2.5 μL，50.0 μmol·L-1 MseI 上游接
头 2.5 μL，50.0 μmol·L-1 MseI 下游接头 2.5 μL，T4
DNA ligase 1.0 μL，T4 DNA ligase buffer（含 dATP）
4.0 μL，ddH2O 5.0 μL，共 20.0 μL。
室温下混匀，离心，16 ℃或室温 15 h；反应结
束后 70 ℃ 15 min，使酶失活；将上述反应液稀释
10 倍，不用的部分保存在-20 ℃冰箱中。
2.4 预扩增 EcoRI 预扩增引物(E pre-primer)为
5-GACTGCGTACCAATTC-3；MseI 预扩增引物(M
pre-primer)为 5-GATGAGTCCTGAGTAA-3。取 3.0
μL 连接后并稀释过的 DNA 样品，加入 27.0 μL 反
应液：10×PCR buffer 3.0 μL，10.0 mmol·L-1 的 dNTP
混合液 0.6 μL，10 μmol·L-1 EcoRI 端预扩增引物 1.0
μL，10.0 μmol·L-1 MseI 端预扩增引物 1.0 μL，2.0
U·μL-1 的 Taq DNA 聚合酶 1.0 μL，ddH2O 20.4 μL。
混匀后，在 PCR 仪上扩增：94 ℃ 5 min；94 ℃
30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共 31 个循环；72 ℃
延伸 10 min；4 ℃保温。预扩增产物稀释 20 倍，-20
℃保存备用。
2.5 选择性扩增 取 5 μL 预扩增稀释混合液，加
入 15.0 μL 反应液：10×PCR buffer 2.0 μL，10.0
mmol·L-1 的 dNTP 混合液 0.4 μL，10.0 μmol·L-1 MseI
端引物和 EcoRI 端引物各 0.25 μL，5.0 U·μL-1 的 Taq
DNA 聚合酶 0.75 μL，ddH2O 11.35 μL。
混匀后，在 PCR 仪上扩增：94 ℃ 5 min；94 ℃
30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，以后每个循环温度递
减 0.7 ℃，扩增 12 个循环；然后按 94 ℃ 30 s，55 ℃
30 s，72 ℃ 60 s 扩增 23 个循环；72 ℃延伸 10 min，
4 ℃保温。
2.6 电泳和银染 用 40 mL 的 page 溶液在 1.0 mm
胶版上制胶，静置 3 h 后点样，在电泳仪上以 200 V
的电压电泳 3 h，然后在醋酸溶液中固定 30 min，
纯水中清洗 10 min 后，银染 30 min，再放入显影液
中显影，显影完成后放回醋酸固定液中。用扫描仪
扫描胶片。
3 结果与分析
3.1 夏枯草基因组 DNA 的提取和质量分析 本研
究中比较了 SDS 法、CTAB 法和尿素法提取的夏枯
草基因组 DNA 的产量和质量。结果表明，3 种方法
都能获得夏枯草基因组 DNA，但 DNA 的产量和质
量有明显差异。其中 SDS 法提取的 DNA，A260/A280
介于 1.70～1.99，质量较佳，产量也是 3 种方法中
最高的；而 CTAB 法、尿素法所获得的 DNA，
A260/A280 介于 1.30～1.69，且多数低于 1.60，表明
DNA 样品中有较多杂质。
3.2 AFLP 指纹图谱的建立和鉴别效率 选择性扩
增引物为预扩增引物 3’末端添加 3 个碱基，本研究
共选用了 32 对进行试验，从中筛选出了 10 对多态
性较强、带型较好、分辨率较高的引物组合进行分
析，10 对引物组合对 8 个夏枯草种质扩增结果，见
表 2。
表 2 10 对 AFLP 引物对 8 个夏枯草种质的扩增结果
引物
组合
末端碱基组合
(EcoRI- MseI)
扩增位点
/个
多态性位点
/个
多态性位点
比率/%
3 AAC-CCT 18 18 100.00
5 AAC-CAG 16 16 100.00
8 AAC-CTC 37 37 100.00
11 AAG- CCT 41 31 75.61
13 AAG- CAG 11 11 100.00
18 AGC- CCA 31 31 100.00
25 ACG- CAA 30 21 70.00
26 ACG- CCA 53 53 100.00
29 ACG- CAG 20 20 100.00
30 ACG- CAT 55 55 100.00

10 对引物组合共在 312 个位点上扩增出条带，
平均每对引物组合扩增位点为 31.2 个。平均每个种
质扩增位点为 39.0 个。扩增位点数量最多是 30 号
引物组合，共扩增出的位点为 55 个；扩增位点数
量最少是 13 号引物组合，共扩增出的位点为 11 个。
10 对引物组合共扩增出多态性位点 293 个，多态性
位点占总扩增位点的比例平均为 93.91%，平均每对
引物扩增多态性位点为 29.3 个。
3.3 8 个夏枯草种质的 AFLP 指纹图谱 在 8 个夏
枯草种质中，共有多态性位点 312 个，把有条带标
记为 1，无条带标记为 0，通过这些位点的不同条
带组合，构建了夏枯草的 AFLP 指纹图谱，将 8 个
夏枯草种质全部区分开来，其中 1 对引物组合选择
性扩增产物电泳后的银染结果，见图 1。


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图 1 引物组合 E-AAG/M-CCT 选择性扩增产物
电泳后的银染结果（每个泳道为 1 个夏枯草种质）

3.4 基于 AFLP 分子标记的夏枯草种质分类 将
10对引物组合在312个位点上扩增出的条带作为原
始矩阵，用 NTSYS-PC 软件计算并分析了 8 个夏枯
草种质间的相似度，获得了聚类图，见图 2，这些
夏枯草种质可分为 3 类，第 1 类包括了文成（2 号）、
乐清（4 号）和景宁（6 号）种质；第 2 类包括磐
安（3 号）、淳安（5 号）、宁海（7 号）和临安（8
号）的种质；而四川南充（1 号）种质自成一类，
为第 3 类。

图2 基于AFLP分子标记的8个夏枯草种质遗传
系统进化树(编号见表1)

4 讨论
对地上部分形态相关参数的测量应用 SPSS 统
计软件分析表明，8 份夏枯草种质株高为 29.6～35.3
cm，平均 32.5 cm，以株高分类，其中第 1 类（1
号）为 29.6 cm，第 2 类（包括 2，4，6 号）在 34.2~35.3
cm，第 3 类（包括 3，5，7，8 号）在 31.2~32.1 cm；
果穗方面，1 号为第 1 类，2，3，4，6 号为第 2 类，
其余为第 3 类；果穗长度除了第 1 类南充种质为 4.4
cm 以外，其余在 6.0～7.3 cm，浙江省内种质差异
不大；果穗直径都在 1.2～1.4 cm，没有明显差异；
这 3 个参数的 SPSS 聚类结果与 NTSYS-PC 分析得
到的分子标记聚类结果基本一致。另外，叶片颜色
方面，除南充种质为浅绿之外，其余均为深绿色；
茎杆颜色方面，除了南充种质为淡紫色，浙江省内
种质均为紫红色，因此可以得出四川南充种质与浙
江 7 份种质的亲缘关系较远，这可以根据株高、果
穗数、果穗长度、叶色和茎色等差别加以区分，而
浙江种质 2 个类型之间的差异，也可在株高、果穗
数 2 个形态参数上得到印证，这些形态特征差异和
基因型存在相关性。
由于可供选择的特征性状有限，本研究利用
AFLP方法分析8份夏枯草种质的遗传多样性，不仅
说明该方法对夏枯草种质的遗传多样性的检测效
应很高，而且揭示了夏枯草种质资源及其丰富的遗
传多样性，其多态性位点占总扩增位点的比例高达
93.91％，说明夏枯草的人工选择程度很低。
AFLP 是广泛用于研究遗传多样性、作物品
种鉴定、基因定位等方面的分子标记方法[2-6]。目
前，尚未见到 AFLP 用于夏枯草种质资源遗传多
样性研究的报道。本研究利用 AFLP 分子标记技
术对夏枯草种质资源进行遗传多样性分析，从分
子水平揭示这些夏枯草种质的遗传基础，为夏枯
草种质资源的收集保存、分类鉴定、合理开发利
用与品种选育等提供科学的理论依据，对有效利
用夏枯草种质资源、促进夏枯草 GAP 基地的建设
具有重要意义。
[参考文献]
[1] 中国药典. 一部[S]. 2005：197.
[2] Voss P，Hogers R，Bleeter M，et al. AFLP：A new technique for DNA
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[3] Pejie I. Comparative analysis of genetic similarity anaong maize
inbred lines detected by RFLPs，RAPLs，SSRs and AFLPs[J]．Theor
Appl Genet，1998，97：1248．
[4] Bohn M. Genetic similarities among winter wheat cuhivars
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predicting progeny vafiance[J]．Crop Sci，1999，39：228．
[5] Segovia Lerma A，Cantrell R，Conway J，et a1. AFLP-based
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分析[J]. 华北农学报，2007，22(增刊)：122.


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AFLP analysis of genetic diversity of Prunella

SHEN Yufeng1,2，SUN Yiming2,3，SHEN Xiaoxia2*，JIANG Jianming2，
WANG Zhian2，YU Xuping2
(1. College of Agriculture and Biotechnology of Zhengjiang University, Hangzhou 310029, China；
2. Zhengjiang Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310023, China；
3. Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

[Abstract] Objective：To explore the variety of the genetic polymorphism of eight Prunella germplasm resources by AFLP
analysis. Method：The amplified fragment length polymorphism (AFLP) tags were applied to screen out 32 selective amplification
primer pairs, the amplified bands as original matrix were analyzed with NTSYS-PC software for the similarity between the Prunella
germplasm and the construction of genetic phylogenetic tree. Result：SDS extraction of genomic Prunella DNA showed a good
quality, could meet the requirements of AFLP analysis. From 32 selective amplification primer pairs, 10 pairs with strong
polymorphism, better band and higher resolution were used for the construction of the AFLP Prunella fingerprint, all eight Prunella
germplasms were separated, they were divided into 3 categories. Conclusion：Prunella germplasm resources are rich in genetic
diversity, certain morphological characteristics and differences are associate with genotype.
[Key words] Prunella vulgaris；germplasm resourse；AFLP；genetic diversity
[责任编辑 吕冬梅]



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2 国内数据库收录
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期刊；中国中文核心期刊；中国科技核心期刊；《中国学术期刊文摘》中、英文版。
3 主要引证数据或数据库统计结果
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