全 文 ：木霉菌对荆芥茎枯病菌的拮抗机制
易茜茜! 丁万隆! 李勇!
中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所! 北京 $$7)# $摘要%!目的#研究绿色木霉9)$Rd$&4* 菌株和哈茨木霉 R?G菌株对荆芥茎枯病菌 >(2!#$(!(#0. )%#!%.).*的拮抗作用 机制) 方法#通过对峙培养&水解酶活性测定&抑菌物质检测等研究发现$) 株木霉对荆芥茎枯病菌的拮抗机制包括竞争作用& 重寄生作用和抗生作用) 结果与结论#水解酶活性测定结果表明$) 株木霉均能分泌葡聚糖酶和蛋白酶$其中 9) 菌株分泌的 ! N$)4葡聚糖酶活性最高$R?G菌株分泌的蛋白酶活性最高*) 株木霉菌均产生难&易挥发性抑菌物质) $关键词%!木霉*拮抗机制*对峙培养* ! N$)4葡聚糖酶*蛋白酶 $稿件编号%!*$$ 7**)基金项目%!中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目!5W4
$(4$7
$通信作者% !! 李勇$RMS# ! $$#*(77%&$U4/BNS#SN5.1D2N/A4 SBQgB-g-1 !!荆芥 5(%L#)*$*!. !*)6%A#-%. GCNbg是我国常用大 宗中药材$为八大祁药之一) 荆芥茎枯病是近年发 生一种毁灭性土传病害$植株从发病到死亡仅需 ) k Q$在发病高峰期常导致荆芥连片死亡$对荆芥 生产构成严重威胁) 据 _?B1D等+,报道$荆芥茎枯 病由烟草疫霉 >(2!#$(!(#0. )%#!%.).*侵染所致$笔 者在研究过程中证实了上述结论) 目前$荆芥茎枯 病的防治主要通过化学手段$而长期频繁使用化学 药剂可诱发病菌的抗药性$也会增加生产成本$还易 使中药材农残超标$影响中药材品质和药品安全) 在自然界中存在对病原具有抑菌活性的拮抗微 生物$通过生物之间的拮抗作用控制病害的发生和 流行是预防中药材病害最为经济&安全的策略) 作 为植物病原拮抗微生物的木霉 :0%(#,*0+. OAAg$常 用于植物生长季及储藏期真菌病害的生物防治$生 产中约 7$j的生防菌剂与木霉菌有关+*, ) 木霉可 通过竞争作用&重寄生作用&分泌抑菌物质&诱导植 物产生抗病性等途径防治真菌病害+)4&, ) 因此$本文 从竞争作用&重寄生作用&抗生作用和水解酶方面揭 示木霉菌株对荆芥茎枯病菌的拮抗机制) !材料与方法 U!材料 UU!靶标病原!荆芥茎枯病菌 >g)%#!%.).*$菌 落培养时使用 [( 培养基$* h恒温暗培养) 从培 养 ( k7 Q 的菌落上打直径 $g( -/菌饼用于对峙 培养) UU!拮抗菌株!绿色木霉:g8%0%,*Rd$&4* 和9) 菌株*哈茨木霉 :g(.0L%.)6+R?G菌株) 菌落培养 时使用EI3培养基$* h恒温暗培养*从培养 # Q 的菌落上打直径 $g( -/菌饼用于对峙培养) ) 种 木霉菌株均由中国医学科学院药用植物研究所植物 保护实验室保存) U!竞争作用观察 制备[( 培养基$用对峙培养法先接种荆芥茎 枯病菌至[( 平板培养基一端$* h恒温暗培养 ) Q 后$在病菌的对面分别接种 ) 种木霉菌株$* h恒 温暗培养$连续观察菌落的相互影响) 每种处理 ) 次重复) U&!重寄生作用观察 挑取两菌对峙培养界面处的菌丝$在普通光学 显微镜下观察$拍照) 每种处理 ) 次重复) U_!水解酶活性测定 U_U! ! N$)4葡聚糖酶活性测定!参照杨合同 等+,的平板透明圈法) 培养基的配方为#JY * EL & #g($ D.` e $J * YEL & %g7( D.` e $酵母汁 g$$ D
.`
e
$茯苓粉 &g$$D.`e$苯胺蓝 $$g$ /D. ` e $琼脂粉 &g$$ D.`e) 灭菌后制成平板$于平 板中央接种木霉菌菌饼$于 * h培养 & Q$观察有无 透明圈) 每个处理 ) 次重复) 酶活性测定参照余永廷等+#,的研究方法$并略
有改动) 取木霉菌饼 ) 块放入装有 $$/` 液体查 彼培养基的 *$ /` 三角瓶中$设 ) 个重复$* h $ C./N1 e振荡培养) 将培养 & Q 的木霉培养液 .#(). 第 ) 卷第 期 *$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$:OOTM! VT1M$ * $$于 & h$$ $$$ C./N1e离心 *$ /N1$上清液即为酶 粗提液$e*$ h保存$备用) 酶活性测定采用 )$4 二硝基水杨酸!I;8比色法+%, ) 取 $g$ /.S.`e 乙酸钠4乙酸缓冲液!AYg配制的 $gj底物昆 布多糖$$

$`)% h水浴 /N1$加入 $$

`酶粗
提液$充分混匀后 )% h保温 )$ /N1) 采用 I;8
法+%,测定生成的还原性糖量) 以 )% h环境下每
/N1产生

D葡萄糖的酶量定义为 个酶活力单位
! ]./`
e
) 每个处理 ) 次重复)
U_U!蛋白酶活性测定!采用平板透明圈法+(,测
定蛋白酶活性) 平板由 $ D.`e的明胶和 D.
`
e的琼脂组成) 在平板中央接种木霉菌菌饼$*
h培养 ) k& Q$用 $ D.`e的YD*
溶液 /` 处
理平板 /N1$观察有无透明圈$倒去 YD*
溶液$测量透明圈直径$每种处理 ) 次重复)
U_U&!纤维素酶活性测定+7,!培养基3#!;Y
&

*
8L
&
* D$9D8L &$g D$JY * EL & D$;B*$D$刚果红 $g* D$琼脂 *$D$水 $`自然 AY) 培养 基G#!;Y & * 8L & * D$9D8L
&
$g D$JY
*
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&
D$
;B水 $`自然 AY) 灭菌后制平板$接种木霉菌饼$*( h恒温暗培养 ) k& Q$观察有无透明圈及透明圈大
小$每种处理 ) 次重复) U$!抗生作用测定
U$U!木霉菌挥发性抑菌物质检测!参照曹玉桃 等+$,的对扣法检测木霉菌挥发物) 分别将靶标病
原和拮抗木霉接种在盛有 [( 培养基的培养皿中$病菌在上$木霉菌在下$将培养皿对扣后封口膜密 封) 以不接种木霉的处理作为对照$每种处理 ) 次
重复) * h恒温暗培养 & Q 后测量病菌菌落直径$计算抑菌率) U$U!木霉菌难挥发抑菌物质检测!参照刘淑娟
等+,的方法测定难挥发物质对病菌的抑制作用)
在[( 培养基上平铺双层硝酸纤维素膜$膜中央接 种木霉菌$* h恒温暗培养至木霉菌落直径约
-/$去除硝酸纤维素膜及附着的木霉菌$在平板中
央接种靶标病原$* h恒温暗培养 & Q) 以不含木 霉菌代谢物的 [( 培养基平板接种病原作为对照$
每种处理 ) 次重复) 每天记录病菌的生长情况$计 算抑菌率) !结果与分析 U!竞争作用 供试疫霉菌在 [( 培养基上生长迅速$但在
EI3等培养基上生长缓慢$供试木霉菌在 [( 培养 基及EI3培养基上均生长迅速) 为了保证实验的 准确性$对峙培养选择既适合病菌又适合木霉菌生
长的[( 培养基) 研究发现$在[( 培养基上$) 种木
霉的生长速率均显著高于病菌$能够迅速占领大部 分培养基空间$通过营养&生存空间等的竞争作用抑
制病菌生长!图 )
3g疫霉*Gg9)*图 !拮抗木霉与病菌平板对峙培养
U!重寄生作用
在木霉与病菌对峙培养过程中$木霉迅速在[( 培养基上定殖$接种 ) k Q 后$木霉 9)$Rd$&4* 和 R?G菌株逐渐覆盖病菌菌落$随培养时间的延长$病 菌菌落逐渐萎缩$其中与 9)$Rd$&4* 对峙的病菌菌
落萎缩现象尤为明显) 显微观察发现$木霉 Rd$&4*
和 R?G菌株的菌丝体对病菌菌丝有附着和缠绕
现象)
U&!水解酶活性测定
U&U!
!
N$)4葡聚糖酶活性测定!平板透明圈 法#经过 & Q 恒温暗培养$9) 菌株的菌落直径达
&g$-/$透明圈直径达 &g$-/*Rd$&4* 菌株的
.%().
第 ) 卷第 期
* $$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM! VT1M$ *$$
菌落直径为 %g*7 -/$透明圈直径为 &g( -/* R?G菌株菌落直径为 %g# -/$透明圈直径为
*g&) -/!图 * ) 分析表明$) 种木霉菌株在培养 过程中均产生 ! N$)4葡聚糖酶$而且有可能在与 病原菌的对峙培养过程中参与对病原菌丝的消 解作用) 3g9)*GgRd$&4**图 *!平板透明圈法测定木霉
!
N$)4葡聚糖酶活性 !!酶活性测定#) 种木霉的液体查彼培养基中均 检测到 ! N$)4葡聚糖酶$而且活性比较发现$9) 酶
活性最高!7g*# ]./` e$其次是Rd$&4*$酶活性 为 %g)( ]./` e$R?G酶活性最低$仅为 )g*& ]. /` e$与透明圈大小的测量结果呈正相关) 其中酶
活性最高的9) 菌株在与病原对峙过程中表现出强
大的病原菌丝消解能力$导致病菌菌落快速萎缩和 消亡) U&U!蛋白酶活性测定!在蛋白酶活性测定实验 中$9)$Rd$&4*$R?G菌落周围均形成透明圈$透明圈
大小及透明程度存在差异) 其中$Rd$&4* 产生的透明
圈最大$平均直径为 g#( -/$透明程度居中*R?G产
生的透明圈透明程度最高$透明圈大小居中$平均直
径为 g*( -/*9) 形成的透明圈最小$平均直径为 &g* -/$透明程度最低!图 )) 表明9)$Rd$&4*$R?G 菌株均产生蛋白酶$并且都可能参与病原菌丝的消解
作用*根据明胶中形成的透明圈大小及透明程度$推 测R?G菌株分泌蛋白酶的量最大且活性最高) 图 )!平板透明圈法测定蛋白酶活性 U&U&!纤维素酶活性测定!) 种木霉在纤维素含 量较高的培养基3上培养 ) Q 后长满全皿$均未见
透明圈*在培养基G上的生长速率较在培养基3上
慢$也未见透明圈产生) 说明在培养过程中$) 种木
霉菌株均不产生纤维素酶或酶的分泌量很少)
U_!易挥发及难挥发物质的抑菌作用
根据实验结果 9)$Rd$&4*$R?G产生的易挥 发性及难挥发性物质对靶标病原生长均有抑制 作用) 其中 R?G产生的易挥发物质对病菌生长 的抑制作用最强$抑菌率为 *g7j*Rd$&4* 产生 的难挥发物质对病菌生长的抑制作用最强$抑菌
率为 )*g*j!表 )
.(().
第 ) 卷第 期
* $$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM! VT1M$ *$$
表 !木霉菌产生的难&易挥发物质对病菌生长的影响
处理
易挥发物质 难挥发物质
病菌菌落直径=-/ 抑菌率=j 病菌菌落直径=-/ 抑菌率=j
9) &,(*3B #,$),##G\ *(,% Rd$&4* &,**G\ %,% ),&(G\ )*,*
R?G ),($G- *,7 ),(G\ *,% !!注#表中大&小写字母分别表示在 77j和 7j水平上的差异显著性) &!讨论 烟草疫霉属于鞭毛菌亚门卵菌纲的病原真菌$
纤维素&葡聚糖&几丁质和蛋白质都是真菌细胞壁的
重要组成部分+*, ) 水解酶活性的测定结果表明木
霉9)$Rd$&4*$R?G菌株均具有 ! N$)4葡聚糖酶活
性和蛋白酶水解活性$! N$)4葡聚糖酶和蛋白酶能
够对病菌细胞壁产生强烈的水解作用$因此推测其 可能在控制病原菌生长方面起主要作用) 另外$参
试的木霉对营养及生存空间的竞争作用以及木霉菌
株产生的难&易挥发物质也是抑制荆芥茎枯病菌的
重要生防机制)
木霉菌作为活体生防菌在田间土壤中的定殖及
生防效果的发挥易受各种自然环境因素影响+)4&, )
笔者在开展木霉菌防治荆芥茎枯病害研究过程中也
发现$尽管对峙培养时绿色木霉 Rd$&4*$9) 菌株和 哈茨木霉R?G菌株均表现出理想的抑菌效果$而在
田间病害防治效果却存在显著差异) 除绿色木霉
9) 菌株仍保持较高的抑菌率外$其余 * 株木霉菌 Rd$&4*$R?G的抑菌率均不理想) 因此$在筛选具有
拮抗作用的木霉菌株的基础上研究拮抗机制$对于 木霉菌株生防效果的发挥和合理使用也是必要的) 目前$利用木霉菌防治田间病害的主要是向土
壤中释放活体菌种$通过木霉菌对病菌的拮抗作用 抑制病害的发生和发展$存在的问题主要是木霉菌
的抑菌活性受诸多环境因子影响较大$田间病害防 治效果不够稳定) 植物病原真菌细胞壁主要由葡聚 糖&纤维素等构成$利用葡聚糖酶和几丁质酶消解病
菌菌丝或孢子的细胞壁$能够抑制病菌的生长和孢 子的萌发$从而有效减轻病害的危害程度) 根据现
有研究报道$寄主植物在生长过程中很少分泌上述 水解酶类$通过基因工程手段将木霉菌中的水解酶
基因转移到寄主植物$使寄主植物通过合成水解酶 而抑制病原菌的生长$能有效解决木霉菌田间病害
防效不稳定的问题+4%, )
$参考文献% + ,!_?B1D_$ XMNVY$ (2!#$(!(#0. )%#!%.).*-BTON1D\SB-Z O?B1Z .P5(%L#)*$*!. !*)6%A#-%. N1 +V,gESB1@EB@?.S$*$$7$ (#($&g + * ,!GM1N@MWR$ >N1-.1 39$N`/.1 9<$ M@BSgGN.-.1@C.S/M-?B4
1NO/O.P:0%(#,*0+. O@CBN1O+V,g:1@MC9N-C.$ * $$&$ %#*&7g + ) ,!>MN1.V` $ FTMCMC.>H$ YMC1B1QMW4FBSB1 >$ M@BSg8M-.1QBC5 /M@B\.SN@MOPC./OAM-NMO.P@?M\N.-.1@C.SBDM1@:0%(#,*0+. +V,g E?5@.-?M/>Md$ *$$ ($%#(7g + & ,!?B1QCB9$ JBSCB3$ 8?BC/BEJ$ M@BSg<MSTSBOMAC.QT-@N.1<br\5ON6:0%(#,*0+. OAAgPMC/M1@MQ .1 /MQN-N1BSASB1@AC.-MOON1DO +V,gV:1Q 9N-C.\N.SGN.@M-?1.S$ * $$7$ )###$g + ,!杨合同$ 唐文华$ 宋家华$ 等g绿色木霉 R`>4* 对小麦纹枯 病的作用机制 +<,==中国植物病理学会第六届代表大会暨 学术年会论文选编g北京#中国农业科学技术出版社$ 77(# $&g + # ,!余永廷$谢媛媛$黄丽丽$等g不同碳&氮源组合对小麦全蚀 病菌产生胞外 ! N$)4葡聚糖酶的影响 +V,g西北农林科技大 学学报#自然科学版$ *$$ %$)!*#$g
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聚糖酶的产生和部分特性的研究 +V,g菌物系统$*$$)$ **
!&##*(g
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生防的初报+V,g四川农业大学学报$*$ $$*)!#))g +*,!VN0BZSN9Y$ M`A.NdCMEg?BCB-@MCNWB@N.1 .PB1 M6.4<br! 4$)4DST4 -B1BOMAC.QT-MQ \5>%(%. .)#+.-.O@CBN1 J$B1@BD.1NO@.PI#!02N !%&%)*0*. .1 BAASMO+V,gE?5@.AB@?.S.D5$ 77($ ((#))g +),!庄敬华$ 杨长城$ 牟连晓$ 等g土壤不同处理对木霉菌定殖 及其生防效果的影响+V,g植物保护$ *$$ $)!##&*g +&,!朱虹$ 汪章勋$樊美珍$ 等g草莓灰霉病拮抗木霉菌株筛选
及温室防效测定+V,g中国生物防治$*$ $$*!#*g +,!金波$ 蒋福升$ 余美荣$ 等g农杆菌介导几丁质酶及 ! N$)4 .7(). 第 ) 卷第 期 *$$ 年 # 月
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[.Sg)$:OOTM! VT1M$ * $$葡聚糖酶基因转化半夏的研究+V,g中国中药杂志$ *$$ 7$)&!&#%#g +#,!陈双臣$ 刘爱荣$邹志荣g转葡聚糖酶和防御素基因的番茄 植株及其对番茄灰霉病的抗性+V,g植物保护学报$ * $$#$ ))!&#)%g +%,!吴家和$ 张献龙$ 罗晓丽$ 等g转几丁质酶和葡聚糖酶基因 棉花的获得及其对黄萎病的抗性+V,g遗传学报$ *$$ &$) !*#()g 4AB-S@A.IB.R,?RC-A.I,I@J2+%)./*+-, IKKg-S-.AIB 0.3$#.$.+, (%)$%,(,*
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F@.# (a_)`OR[R,,(((责任编辑!吕冬梅%
.$7). 第 ) 卷第 期 *$$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM!
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