全 文 :三七总皂苷对白细胞黏附效应与黏附分子表达调控的研究
李响,马雪涛,吴振起,李靖,李琰峰,张愚
(北京中医药大学 东直门医院,北京100700)
[摘要] 目的:通过观察注射用血栓通(主要成分为三七总皂苷)对各种刺激处理因素下白细胞黏附能力和黏附分子表
达的影响,探讨血栓通对缺血再灌注损伤的保护机制。方法:分离纯化大鼠白细胞与肺部血管内皮细胞,建立体外白细胞与
血管内皮细胞黏附试验体系,在施加内毒素、肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素8(IL8)与缺氧等刺激处理因素之前,采
用血栓通(三七总皂苷剂量分别为5,50,100mg·L-1)进行分组干预,并检测白细胞对血管内皮细胞的黏附率,同时采用流
式细胞术检测白细胞黏附分子LFA1,VLA4与血管内皮细胞黏附分子ICAM1,VCAM1表达的变化。结果:在内毒素作用
条件下,血栓通对大鼠白细胞黏附率无显著改变,而在TNFα与IL8活化因素以及缺氧条件下,50,100mg·L-1血栓通可明
显减少大鼠白细胞对内皮细胞的黏附率;在缺氧、TNFα等刺激因素的作用下,大鼠肺血管内皮细胞 VCAM1与 ICAM1的表
达水平显著升高,在100mg·L-1血栓通的干预作用下,VCAM1与ICAM1的表达水平显著降低。结论:血栓通可抑制大鼠肺
血管内皮细胞VCAM1与ICAM1的表达而降低白细胞的黏附能力,从而减轻血管内皮细胞的损伤,可能是血栓通对缺血再
灌注损伤具有保护作用的机制之一。
[关键词] 三七总皂苷;白细胞;黏附分子;缺血再灌注损伤
[收稿日期] 20090225
[通信作者] 李响,Tel:(010)84015010,Email:lixiang6666@hot
mailcom
在缺血再灌注损伤、严重感染败血症、休克等
病理过程中,肺往往是首发损伤器官,其原因是肺以
其极为丰富的毛细血管而成为全身静脉血的滤器,
而中性粒细胞等白细胞黏附于血管内皮细胞,导致
肺血管内淤积阻塞,造成肺的直接损害。目前采用
黏附分子抗体的抗黏附治疗在临床应用局限性较
大,而注射用血栓通(主要成分为三七总皂苷)在
脑、心、肾、肺等多个器官的缺血再灌注损伤中有明
显的保护作用[13],其保护机制可能与减轻白细胞的
活化、黏附以及其对黏附分子的调控有关。因此,研
究在建立各种刺激因素作用下的体外白细胞与肺血
管内皮细胞黏附体系,通过观察注射用血栓通对黏
附分子细胞间黏附因子1(ICAM1),血管细胞黏附
分子1(VCAM1)的影响,以明确血栓通在缺血再
灌注损伤以及炎症过程中的保护作用与机制。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 注射用血栓通(三七总皂苷含
量>60%,广西梧州制药集团股份有限公司,国药准
字Z20025652,批号060607);内毒素、肿瘤坏死因子
(TNFα)、白细胞介素8(IL8)(Sigma公司)。流式
细胞仪(美国 Backmancoulter公司)。抗鼠 ICAM
1,VCAM1单克隆抗体(美国 SantaCruz公司)。低
糖DMEM、胎牛血清、胰酶(Gibco公司)。
1.2 大鼠肺微血管内皮细胞培养 取新生1d的
仔鼠,无菌取肺组织用 PBS冲洗除去胸膜,剪成 1
mm3大小的组织块,加适量含10%血清低糖 DMEM
培养基进行组织块培养(37℃,5%CO2),约3~5d
细胞爬出,去除组织块,继续培养1周后,025%胰
酶消化传代培养,传至第5代时加入24孔板或6孔
板进行相关试验。
1.3 大鼠白细胞与肺微血管内皮细胞黏附实验与
黏附检测体系的建立[4] 以体外培养的 SD大鼠肺
血管内皮细胞为黏附对象,加入大鼠白细胞而建立
黏附试验体系,即在24孔板上生长至致密融合的单
层大鼠肺血管内皮细胞后,按实验分组不同而施加
不同的干预因素,用10%FCS低糖DMEM液洗涤后
做黏附试验:在相应孔中加入大鼠白细胞,密度2×
106个/mL,05mL/孔。将培养板置37℃,5%CO2
孵箱中孵育60min后,加入含01mol·L-1EDTA
的RPMI1640液洗涤2次,收集各孔上清液及洗涤
液,混合后计数细胞,计算黏附百分率。每一标本设
10个复孔。
黏附率=(1-未黏附细胞数/加入细胞总数)×100%
1.4 血栓通预处理白细胞黏附实验 刺激因素组:
在体外白细胞黏附体系中,分别对大鼠白细胞与大
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鼠肺血管内皮细胞进行刺激与处理,刺激与处理因
素为内毒素(终浓度10mg·L-1,处理时间12h)、
TNFα,(终浓度200000U·L-1,处理时间24h)、
IL8(终浓度1mg·L-1,处理时间24h)以及缺氧
(培养罐内90%氮气,处理时间6h),并检测白细胞
黏附率;血栓通浓度组:除用内毒素及肿瘤坏死因子
刺激大鼠白细胞活化之外,以血栓通配制(三七总
皂苷剂量为5,50,100mg·L-1)等渗培养液,制成
大鼠的白细胞悬液,并在分别加入内毒素、肿瘤坏死
因子、IL8和缺氧条件刺激前加入不同浓度的血栓
通进行干预,然后进行体外黏附实验并检测其黏附
率;空白组:在体外白细胞黏附体系中,不加任何干
预因素,检测其黏附率。以上每组设10个复孔。
1.5 检测大鼠黏附分子 LFA1,ICAM1,VLA4,
VCAM1的表达 在体外模型中,用血栓通进行刺
激前干预,继而采用缺氧、肿瘤坏死因子等因素进行
刺激,作用6h,消化混合细胞培养体系的细胞后,采
用流式细胞术检测黏附体系中白细胞LFA1,VLA4
与内皮细胞ICAM1,VCAM1的表达水平。消化各
组细胞,调整细胞密度在2~5×105/mL,细胞重悬
于100μL含 05%的 BSA的 PBS中,加入一抗
LFA1,ICAM1,VLA4,VCAM1,4℃孵育 30min
后,PBS洗涤细胞3遍,加入FITC标记二抗(1∶200
稀释)。4℃避光孵育 30min,用 PBS洗涤细胞 2
次,行流式细胞仪检测。
1.6 统计学方法 采用 SPSS130版本统计软件
进行分析,所有数据用 珋x±s表示,组间比较用单因
素方差分析,若方差不齐者,2组间采用 t′检验分
析,P<005为有统计学意义。
2 结果
2.1 对大鼠白细胞与肺血管内皮细胞黏附特性的
影响 内毒素、TNFα,IL8、缺氧等刺激因素均可使
大鼠白细胞与肺血管内皮细胞的黏附率显著增加
(P<001),而50,100mg·L-1组血栓通对白细胞
的黏附能力有所抑制,表现为对 TNFα,IL8、缺氧
刺激活化白细胞的黏附率明显降低(P<005),但
对内毒素刺激活化白细胞的黏附特性有降低趋势,
但无显著性意义(表1)。
表1 血栓通对大鼠白细胞与肺血管内皮细胞黏附特性的影响(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·L-1
黏附率/%
内毒素 TNFα IL8 缺氧刺激
正常 - 156±48 156±48 156±48 156±48
刺激 - 503±891) 408±941) 328±621) 452±851)
血栓通 5 406±153 352±127 272±75 406±69
50 415±78 227±1162) 206±672) 253±862)
100 395±101 248±852) 153±922) 205±832)
注:与正常组比较1)P<001;与刺激对照组比较2)P<005。
2.2 对肺血管内皮细胞黏附分子ICAM1,VCAM1
表达的影响 在缺氧、肿瘤坏死因子等刺激因素的
作用下,大鼠血管内皮细胞 VCAM1与 ICAM1的
表达水平显著升高,在100mg·L-1血栓通的干预
作用下,VCAM1与 ICAM1的表达水平显著降低
(表2)。
3 讨论
缺血再灌注损伤的实质是一系列联级炎性反
应,在炎性因子如 TNFα,INFγ,IL1,IL2,IL6,IL
8[5]和缺氧、内毒素等刺激下,可引起血管内皮细胞
黏附分子 ICAM1,VCAM1表达上调,与白细胞上
整合素家族的 LFA1(CD11a/CD18)等黏附分子配
基互相作用,介导白细胞在血管内皮的滚动与黏附,
表2 血栓通对黏附分子ICAM1,VCAM1表达的影响
(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·L-1
ICAM1表达
/%
VCAM1表达
/%
正常 - 46±17 38±09
缺氧 - 532±851) 308±851)
TNFα - 448±821) 368±971)
血栓通+缺氧 50 459±76 303±63
血栓通+TNFα 50 381±63 317±58
血栓通+缺氧 100 228±612) 198±592)
血栓通+TNFα 100 269±823) 178±893)
注:与正常组比较1)P<001;与缺氧对照组比较2)P<005;与
TNFα组比较3)P<005。
是整个炎症效应的始动环节[68],继而产生大量的氧
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自由基,蛋白水解酶,弹性酶,白三烯等炎性介质,损
害局部血管,导致血管的通透性增加,并进而穿透血
管内皮细胞渗透到器官实质内造成器官的炎性损
伤[910],这是缺血再灌注损伤的病理生理基础,而
且在肺部白细胞活化引起的炎性损伤尤其典
型[1112]。因此,拮抗白细胞与血管内皮细胞的黏附
效应就可以抑制多种病理情况下的炎性损伤,而目
前针对黏附环节的治疗策略是采用黏附分子抗体进
行封闭,但抗体昂贵,多在机制研究的验证性试验中
采用,不宜临床推广应用。而传统中药制剂注射用
血栓通已经在临床广泛应用于缺血再灌注损伤的
多种脏器保护,但机制仍不十分明确。
在体外建立白细胞黏附试验体系,是模拟在缺
血再灌注损伤以及缺氧、感染等病理情况下,研究
体内白细胞与肺血管内皮之间的相互作用,如黏附
效应等。在试验中,施加刺激和处理因素如内毒素、
肿瘤坏死因子、IL8、缺氧等条件下,白细胞黏附大
鼠肺血管内皮的能力显著提高,表现为黏附率的明
显增高。在注射用血栓通的干预后,能比较充分地
抑制TNFα,IL8、缺氧等因素介导的的白细胞的活
化与黏附,但对内毒素激活的黏附效应抑制较弱。
研究表明血栓通可以抑制白细胞与血管内皮细胞的
黏附反应,可以减轻缺氧与炎性细胞因子诱导的白
细胞与血管内皮细胞之间的黏附效应,提示血栓通
可抑制缺氧与炎性细胞因子介导的细胞信号通路,
以此来减轻缺血再灌注损伤效应,达到细胞保护目
的。为进一步在分子水平明确其中保护机制,选择
缺氧因素与代表性的炎性细胞因子 TNFα作处理
因素进行深入研究。研究表明,在缺氧、IL8、肿瘤
坏死因子等刺激因素的作用下,肺血管内皮细胞
VCAM1与ICAM1的表达水平显著升高,而在注射
用血栓通的干预下,肺血管内皮细胞 ICAM1与
VCAM1的表达水平明显下降,提示在白细胞与肺
血管内皮的相互作用过程中,注射用血栓通可以通
过抑制血管内皮细胞黏附分子的表达,减少白细胞
与血管内皮细胞之间的黏附反应,减轻了缺血再灌
注损伤中联级炎性反应的起始环节,减轻了血管内
皮细胞的损伤和减缓了白细胞从血管内皮细胞中的
渗出等后续炎症反应,可能是血栓通减轻临床上常
见的缺血再灌注损伤效应的机制之一,有重要的临
床应用意义。
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[责任编辑 古云侠]
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