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三七总皂苷对白细胞黏附效应与黏附分子表达调控的研究



全 文 :三七总皂苷对白细胞黏附效应与黏附分子表达调控的研究
李响,马雪涛,吴振起,李靖,李琰峰,张愚
(北京中医药大学 东直门医院,北京100700)
[摘要] 目的:通过观察注射用血栓通(主要成分为三七总皂苷)对各种刺激处理因素下白细胞黏附能力和黏附分子表
达的影响,探讨血栓通对缺血再灌注损伤的保护机制。方法:分离纯化大鼠白细胞与肺部血管内皮细胞,建立体外白细胞与
血管内皮细胞黏附试验体系,在施加内毒素、肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素8(IL8)与缺氧等刺激处理因素之前,采
用血栓通(三七总皂苷剂量分别为5,50,100mg·L-1)进行分组干预,并检测白细胞对血管内皮细胞的黏附率,同时采用流
式细胞术检测白细胞黏附分子LFA1,VLA4与血管内皮细胞黏附分子ICAM1,VCAM1表达的变化。结果:在内毒素作用
条件下,血栓通对大鼠白细胞黏附率无显著改变,而在TNFα与IL8活化因素以及缺氧条件下,50,100mg·L-1血栓通可明
显减少大鼠白细胞对内皮细胞的黏附率;在缺氧、TNFα等刺激因素的作用下,大鼠肺血管内皮细胞 VCAM1与 ICAM1的表
达水平显著升高,在100mg·L-1血栓通的干预作用下,VCAM1与ICAM1的表达水平显著降低。结论:血栓通可抑制大鼠肺
血管内皮细胞VCAM1与ICAM1的表达而降低白细胞的黏附能力,从而减轻血管内皮细胞的损伤,可能是血栓通对缺血再
灌注损伤具有保护作用的机制之一。
[关键词] 三七总皂苷;白细胞;黏附分子;缺血再灌注损伤
[收稿日期] 20090225
[通信作者] 李响,Tel:(010)84015010,Email:lixiang6666@hot
mailcom
  在缺血再灌注损伤、严重感染败血症、休克等
病理过程中,肺往往是首发损伤器官,其原因是肺以
其极为丰富的毛细血管而成为全身静脉血的滤器,
而中性粒细胞等白细胞黏附于血管内皮细胞,导致
肺血管内淤积阻塞,造成肺的直接损害。目前采用
黏附分子抗体的抗黏附治疗在临床应用局限性较
大,而注射用血栓通(主要成分为三七总皂苷)在
脑、心、肾、肺等多个器官的缺血再灌注损伤中有明
显的保护作用[13],其保护机制可能与减轻白细胞的
活化、黏附以及其对黏附分子的调控有关。因此,研
究在建立各种刺激因素作用下的体外白细胞与肺血
管内皮细胞黏附体系,通过观察注射用血栓通对黏
附分子细胞间黏附因子1(ICAM1),血管细胞黏附
分子1(VCAM1)的影响,以明确血栓通在缺血再
灌注损伤以及炎症过程中的保护作用与机制。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 注射用血栓通(三七总皂苷含
量>60%,广西梧州制药集团股份有限公司,国药准
字Z20025652,批号060607);内毒素、肿瘤坏死因子
(TNFα)、白细胞介素8(IL8)(Sigma公司)。流式
细胞仪(美国 Backmancoulter公司)。抗鼠 ICAM
1,VCAM1单克隆抗体(美国 SantaCruz公司)。低
糖DMEM、胎牛血清、胰酶(Gibco公司)。
1.2 大鼠肺微血管内皮细胞培养 取新生1d的
仔鼠,无菌取肺组织用 PBS冲洗除去胸膜,剪成 1
mm3大小的组织块,加适量含10%血清低糖 DMEM
培养基进行组织块培养(37℃,5%CO2),约3~5d
细胞爬出,去除组织块,继续培养1周后,025%胰
酶消化传代培养,传至第5代时加入24孔板或6孔
板进行相关试验。
1.3 大鼠白细胞与肺微血管内皮细胞黏附实验与
黏附检测体系的建立[4] 以体外培养的 SD大鼠肺
血管内皮细胞为黏附对象,加入大鼠白细胞而建立
黏附试验体系,即在24孔板上生长至致密融合的单
层大鼠肺血管内皮细胞后,按实验分组不同而施加
不同的干预因素,用10%FCS低糖DMEM液洗涤后
做黏附试验:在相应孔中加入大鼠白细胞,密度2×
106个/mL,05mL/孔。将培养板置37℃,5%CO2
孵箱中孵育60min后,加入含01mol·L-1EDTA
的RPMI1640液洗涤2次,收集各孔上清液及洗涤
液,混合后计数细胞,计算黏附百分率。每一标本设
10个复孔。
黏附率=(1-未黏附细胞数/加入细胞总数)×100%
1.4 血栓通预处理白细胞黏附实验 刺激因素组:
在体外白细胞黏附体系中,分别对大鼠白细胞与大
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鼠肺血管内皮细胞进行刺激与处理,刺激与处理因
素为内毒素(终浓度10mg·L-1,处理时间12h)、
TNFα,(终浓度200000U·L-1,处理时间24h)、
IL8(终浓度1mg·L-1,处理时间24h)以及缺氧
(培养罐内90%氮气,处理时间6h),并检测白细胞
黏附率;血栓通浓度组:除用内毒素及肿瘤坏死因子
刺激大鼠白细胞活化之外,以血栓通配制(三七总
皂苷剂量为5,50,100mg·L-1)等渗培养液,制成
大鼠的白细胞悬液,并在分别加入内毒素、肿瘤坏死
因子、IL8和缺氧条件刺激前加入不同浓度的血栓
通进行干预,然后进行体外黏附实验并检测其黏附
率;空白组:在体外白细胞黏附体系中,不加任何干
预因素,检测其黏附率。以上每组设10个复孔。
1.5 检测大鼠黏附分子 LFA1,ICAM1,VLA4,
VCAM1的表达 在体外模型中,用血栓通进行刺
激前干预,继而采用缺氧、肿瘤坏死因子等因素进行
刺激,作用6h,消化混合细胞培养体系的细胞后,采
用流式细胞术检测黏附体系中白细胞LFA1,VLA4
与内皮细胞ICAM1,VCAM1的表达水平。消化各
组细胞,调整细胞密度在2~5×105/mL,细胞重悬
于100μL含 05%的 BSA的 PBS中,加入一抗
LFA1,ICAM1,VLA4,VCAM1,4℃孵育 30min
后,PBS洗涤细胞3遍,加入FITC标记二抗(1∶200
稀释)。4℃避光孵育 30min,用 PBS洗涤细胞 2
次,行流式细胞仪检测。
1.6 统计学方法 采用 SPSS130版本统计软件
进行分析,所有数据用 珋x±s表示,组间比较用单因
素方差分析,若方差不齐者,2组间采用 t′检验分
析,P<005为有统计学意义。
2 结果
2.1 对大鼠白细胞与肺血管内皮细胞黏附特性的
影响 内毒素、TNFα,IL8、缺氧等刺激因素均可使
大鼠白细胞与肺血管内皮细胞的黏附率显著增加
(P<001),而50,100mg·L-1组血栓通对白细胞
的黏附能力有所抑制,表现为对 TNFα,IL8、缺氧
刺激活化白细胞的黏附率明显降低(P<005),但
对内毒素刺激活化白细胞的黏附特性有降低趋势,
但无显著性意义(表1)。
表1 血栓通对大鼠白细胞与肺血管内皮细胞黏附特性的影响(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·L-1
黏附率/%
内毒素 TNFα IL8 缺氧刺激
正常  - 156±48 156±48 156±48 156±48
刺激  - 503±891) 408±941) 328±621) 452±851)
血栓通 5 406±153 352±127 272±75 406±69
  50 415±78 227±1162) 206±672) 253±862)
  100 395±101 248±852) 153±922) 205±832)
  注:与正常组比较1)P<001;与刺激对照组比较2)P<005。
2.2 对肺血管内皮细胞黏附分子ICAM1,VCAM1
表达的影响 在缺氧、肿瘤坏死因子等刺激因素的
作用下,大鼠血管内皮细胞 VCAM1与 ICAM1的
表达水平显著升高,在100mg·L-1血栓通的干预
作用下,VCAM1与 ICAM1的表达水平显著降低
(表2)。
3 讨论
缺血再灌注损伤的实质是一系列联级炎性反
应,在炎性因子如 TNFα,INFγ,IL1,IL2,IL6,IL
8[5]和缺氧、内毒素等刺激下,可引起血管内皮细胞
黏附分子 ICAM1,VCAM1表达上调,与白细胞上
整合素家族的 LFA1(CD11a/CD18)等黏附分子配
基互相作用,介导白细胞在血管内皮的滚动与黏附,
  表2 血栓通对黏附分子ICAM1,VCAM1表达的影响
(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·L-1
ICAM1表达
/%
VCAM1表达
/%
正常 - 46±17 38±09
缺氧 - 532±851) 308±851)
TNFα - 448±821) 368±971)
血栓通+缺氧 50 459±76 303±63
血栓通+TNFα 50 381±63 317±58
血栓通+缺氧 100 228±612) 198±592)
血栓通+TNFα 100 269±823) 178±893)
  注:与正常组比较1)P<001;与缺氧对照组比较2)P<005;与
TNFα组比较3)P<005。
是整个炎症效应的始动环节[68],继而产生大量的氧
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自由基,蛋白水解酶,弹性酶,白三烯等炎性介质,损
害局部血管,导致血管的通透性增加,并进而穿透血
管内皮细胞渗透到器官实质内造成器官的炎性损
伤[910],这是缺血再灌注损伤的病理生理基础,而
且在肺部白细胞活化引起的炎性损伤尤其典
型[1112]。因此,拮抗白细胞与血管内皮细胞的黏附
效应就可以抑制多种病理情况下的炎性损伤,而目
前针对黏附环节的治疗策略是采用黏附分子抗体进
行封闭,但抗体昂贵,多在机制研究的验证性试验中
采用,不宜临床推广应用。而传统中药制剂注射用
血栓通已经在临床广泛应用于缺血再灌注损伤的
多种脏器保护,但机制仍不十分明确。
在体外建立白细胞黏附试验体系,是模拟在缺
血再灌注损伤以及缺氧、感染等病理情况下,研究
体内白细胞与肺血管内皮之间的相互作用,如黏附
效应等。在试验中,施加刺激和处理因素如内毒素、
肿瘤坏死因子、IL8、缺氧等条件下,白细胞黏附大
鼠肺血管内皮的能力显著提高,表现为黏附率的明
显增高。在注射用血栓通的干预后,能比较充分地
抑制TNFα,IL8、缺氧等因素介导的的白细胞的活
化与黏附,但对内毒素激活的黏附效应抑制较弱。
研究表明血栓通可以抑制白细胞与血管内皮细胞的
黏附反应,可以减轻缺氧与炎性细胞因子诱导的白
细胞与血管内皮细胞之间的黏附效应,提示血栓通
可抑制缺氧与炎性细胞因子介导的细胞信号通路,
以此来减轻缺血再灌注损伤效应,达到细胞保护目
的。为进一步在分子水平明确其中保护机制,选择
缺氧因素与代表性的炎性细胞因子 TNFα作处理
因素进行深入研究。研究表明,在缺氧、IL8、肿瘤
坏死因子等刺激因素的作用下,肺血管内皮细胞
VCAM1与ICAM1的表达水平显著升高,而在注射
用血栓通的干预下,肺血管内皮细胞 ICAM1与
VCAM1的表达水平明显下降,提示在白细胞与肺
血管内皮的相互作用过程中,注射用血栓通可以通
过抑制血管内皮细胞黏附分子的表达,减少白细胞
与血管内皮细胞之间的黏附反应,减轻了缺血再灌
注损伤中联级炎性反应的起始环节,减轻了血管内
皮细胞的损伤和减缓了白细胞从血管内皮细胞中的
  
渗出等后续炎症反应,可能是血栓通减轻临床上常
见的缺血再灌注损伤效应的机制之一,有重要的临
床应用意义。
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[责任编辑 古云侠]
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