全 文 ：竹黄无性型的分离确定
杜文，韩燕峰，梁建东，梁宗琦
（贵州大学 真菌资源研究所，贵州 贵阳 ５５００２５）
［摘要］ 目的：分离获得经确证的竹黄的无性型菌种。方法：从竹黄的子实体中分别通过组织分离和活子囊孢子分离获
得不同的子实体分离株。通过培养性状，微观形态特征观察和５８ＳＩＴＳｒＤＮＡ序列的分析对分离获得的菌株进行确证。结
果：应用不同的分离方法分离到的菌株ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ１８１，它们具有相同的菌落形态特征。用ＩＴＳ１５８ＳｒＤＮＡＩＴＳ２
的通用引物，经ＰＣＲ扩增、测序得到ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ１８１的５８ＳＩＴＳｒＤＮＡ序列。将这个序列经ＮＣＢＩＢｌａｓｔ进行核苷
酸比对发现ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ１８１菌株与 ＮＣＢＩ中已登录竹黄序列的相似性均为 ９９％ ～１００％。结论：分离获得的
ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ１８１菌株为竹黄菌Ｓｈｉｒａｉａｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ的真正无性型。
［关键词］ 竹黄；菌种分离；分子鉴定
［收稿日期］ ２００８０８１８
［基金项目］ 贵州大学引进人才科研项目［贵大人基合字（２００７）
０３５号］；贵州大学生命科学学院研究生创新基金项目
［通信作者］ 韩燕峰，Ｔｅｌ：１３６０８５８３２４２，Ｅｍａｉｌ：ｓｗａｌｏｗ１１２８＠
１２６ｃｏｍ
［作者简介］ 杜文，Ｔｅｌ：（０８５１）８２９７８５６，Ｅｍａｉｌ：ｄｕｗｅｎ６６８８＠１６３．
ｃｏｍ
竹黄菌ＳｈｉｒａｉａｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａＰ．Ｈｅｎｎ．又名竹花、
竹三七、竹赤团子等，是一种生长在竹枝上的真菌，
其子实体称竹黄。民间多用竹黄浸酒，用于治疗风
湿性关节炎、坐骨神经痛、跌打损伤及虚寒胃痛、小
儿惊风等症，水煎服对急性肝炎恢复期及慢性肝炎
有一定治疗效果［１］。
竹黄菌的主要成分之一，竹红菌素是一种
醌
类光敏色素物质，其具有抗炎、镇痛、抗菌、光敏杀伤
肿瘤细胞、减轻毒副作用以及抑制肉芽组织增生等
作用［２３］。此外，在食品添加剂和新型生物农药上，
竹红菌素具有广阔的应用前景。目前，在自然界竹
黄资源有限。因此，为摆脱传统上单纯依靠野生采
集，积极开拓资源的异地保育，扩大新的药源，探索
人工培养利用竹黄就显得十分迫切。由于竹黄的分
离株，在人工培养基上很难形成产孢结构，这对日常
工作中菌种分离的识别，交换和应用都带来了诸多
不便。本实验通过子座组织和活子囊孢子２种不同
的分离方法获得竹黄菌种及结合分子确证，获得真
正竹黄无性型菌种。
１ 材料
１．１ 样品来源
分离用竹黄 Ｓ．ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ子实体（由贵州大
学真菌资源研究所梁宗琦教授鉴定）采自浙江省桐
庐县。
１．２ 培养基
ＰＤＡ培养基和查氏培养基均按常规进行配
制［４］。
１．３ 试剂和仪器
ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ相关试剂均购自天根生
物公司；ＡｌｅｇｒａＴＭ６４Ｒ和ＢｉｏＲａｄ凝胶成像系统；Ｈｉｔ
ｔｉｃｈＭｉｋｒｏ２２Ｒ离心机；ＰＴＣ１００ＴＭＰＣＲ仪，ＭＪＲｅ
ｓｅａｒｃｈＩｎｃ．；Ｍｏｔｉｃ１３００数码显微镜。
２ 方法
２．１ 菌种分离
２．１．１ 活子囊孢子分离 参照梁宗琦［５］的孢子分
离法。将新采得的完好竹黄子实体用自来水仔细洗
去表面的灰尘，再用无菌水冲洗３～４次，最后用无
菌滤纸将表面的水吸干。将子实体放在吸水滤纸
上，而后置于无菌的大培养皿中，并保持竹黄子座距
离培养皿盖约１ｃｍ。盖好皿盖后，２４～２６℃下保湿
培养。每天观察，当发现皿盖内壁有灰白色细粉状
物时，随即镜检，注意寻找有芽管形成的活子囊孢
子。用沾有无菌水的接种环粘含有活子囊孢子的粉
状物少许接种于数支 ＰＤＡ琼脂斜面上。经培养后
若无污染，且各斜面皆长出同一培养物，即为竹黄的
多孢子分离菌种。
２．１．２ 组织分离 将新采得的完好竹黄子实体用
自来水仔细洗去表面的灰尘，再用无菌水冲洗３～４
次，最后用无菌滤纸将表面的水吸干。用灭过菌的
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第３４卷第１３期
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刀片切开表皮，用手将子座折断。用灭菌剖针于子
实体的近边缘区，挑取约０５ｃｍ的小组织块，置于
ＰＤＡ培养基上，置 ２４～２６℃恒温箱中培养 ３～１５
ｄ。观察样品边缘部分是否有菌丝长出，用接种针挑
取不同部位的边缘菌丝再次转接到 ＰＤＡ培养基平
板上进行纯化，然后接到试管斜面上保存。
２．２ 分子鉴定
２．２．１ 基因组ＤＮＡ提取 将分离获得的纯培养菌
种的试管斜面转接于 ＰＤＡ液体培养基中，２８℃，
１２０ｒ·ｍｉｎ－１，培养 ７ｄ。过滤，蒸馏水洗菌丝体 ３
次，改进ＣＴＡＢ法［６］提取基因组ＤＮＡ。
２．２．２ ＩＴＳ序列扩增 用于扩增 ＩＴＳ１５８ＳｒＤＮＡ
ＩＴＳ２的引物参照 ＧｅｎＢａｎｋ公布的真菌 ＩＴＳ序列［７］，
ＩＴＳ４（ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ），ＩＴＳ５（ＧＧＡＡＧ
ＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ）。２０μＬＰＣＲ反应体系
中含有ＭＩＸ１μＬ，ＩＴＳ４和ＩＴＳ５各０４μＬ，模板ＤＮＡ
１０μＬ，其他部分为蒸馏水。在 ＰＣＲ仪上运行的条
件为９５℃ 预变性５ｍｉｎ，９４℃ 变性１ｍｉｎ，５０℃ 退
火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环，最后７２℃延
伸１０ｍｉｎ。
２．２．３ 测序和数据处理 ＰＣＲ产物经试剂盒纯化
后直接用于测序 （上海鼎安生物科技有限公司）。
将菌株测得的 ＩＴＳ序列于 ＧｅｎＢａｎｋ上进行 Ｂｌａｓｔ比
对，选择相似性大于８７％的菌株及其序列用 Ｃｌｕｓｔ
ａｌＸ１８１［８］作完全比对，经手工校正后，用Ｍｅｇａ４０
软件构建系统树进行分子鉴定。
３ 实验结果
３．１ 竹黄标本的形态特征观察
子座外形呈瘤状，龟裂，软木栓质，粉红色，长
２０～５０ｍｍ，宽 １０～２５ｍｍ。子囊壳近椭圆形，
（４８０～５１０）μｍ×（５９０～６３０）μｍ，埋生于子座边缘。
子 囊 长 圆 筒 形，通 常 为 ６个 子 囊 孢 子，
（２８０～３４０）μｍ×（２２～２５）μｍ。子囊孢子砖格状，
无色或近至无色，梭形或纺锤形，两端略尖锐，
（４０～６０）μｍ×（１３～１６）μｍ。近竹枝的子座部分，有
分生孢子器形成，内生分生孢子，形状及分隔与子囊
孢子相似，但稍小，（３６～４８）μｍ×（１３～２１）μｍ。
３．２ 无性型菌株的培养特征
通过组织分离和子囊孢子分离获得的２个菌株
分别为 ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ１８１，它们在 ＰＤＡ
平板上形成相同的菌落形态。在２６℃ ４ｄ后，菌落
直径超过２５ｃｍ，１０ｄ后菌落直径达６～７ｃｍ，菌丝
有隔，有分枝，透明，宽度３～８μｍ。菌落表面初期
呈棉絮或疏松绒毛状，有同心轮带，白色后呈淡褐
色，基质菌丝密致呈深棕色，培养１０ｄ后，未见产孢
结构。
３．３ 竹黄无性型菌种的分子确定
按上述方法提取菌株ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ
１８１的染色体 ＤＮＡ后，再进行 ＰＣＲ扩增，扩增产物
的琼脂糖凝胶电泳图见图１，初步显示已成功扩增
得到目的条带。ＰＣＲ产物经试剂盒纯化后委托华
大基因上海鼎安生物科技有限公司测序。
图１ ５８ＳＩＴＳｒＤＮＡ电泳图
再采用Ｍｅｇａ４０软件，用ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）
法建立系统发育树的分析观察表明，通过组织分离
和子囊孢子分离得到的 ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，ＧＺＤＸＩＦＲ
１８１２个菌株，与 ＧｅｎＢａｎｋ上下载的全部竹黄菌都
能很好地聚在一个进化分枝中，见图２，并有９９％的
支持率。分子鉴定有力地支持了 ＧＺＤＸＩＦＲ１７１，
ＧＺＤＸＩＦＲ１８１２个菌株是真正的竹黄无性型。
图２ 基于５８ＳＩＴＳｒＤＮＡ序列构建的系统发育树
（邻接法）
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４ 讨论
药用真菌竹黄在医药、农业和食品上有重要的
应用前景［９］。因而，竹黄的进一步开发利用受到了
普遍关注。在资源的利用上，能否从野外的天然采
集，到分离获得菌种，进而人工培养利用竹黄子实
体，是个具有挑战性、有开发应用前景的课题。从竹
黄上分离得到的菌株在人工培养条件下，很难形成
产孢结构和子实体。不产孢菌株无法用传统形态学
方法来进行鉴定［１０］，须辅以分子生物学的方法。张
灏等［１１］等曾报道在分离纯化过程中观察到不同的
孢子。而对无性型菌种严格意义上的确证却未见报
道。本实验在菌种分离过程中，采用了组织分离和
萌发的活子囊孢子的不同分离法进行分离，以获得
同一菌种间的相互验证，这对较好的排除杂菌，准确
获得真正竹黄无性型菌种十分有利。随后，将获得
２个菌株的 ＩＴＳ１５８ＳＩＴＳ２ｒＤＮＡ序列与 ＧｅｎＢａｎｋ
中的竹黄序列比对分析，发现它们之间的相似性达
到了９９％～１００％，这在分子层面上确证了本实验
用不同分离法分离到的菌株均是真正的竹黄 Ｓ．
ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ无性型，这将为竹黄的进一步开发利用
奠定坚实的基础。
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ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｎａｍｏｒｐｈｏｆＳｈｉｒａｉａｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ
ＤＵＷｅｎ，ＨＡＮＹａｎｆｅｎｇ，ＬＩＡＮＧＪｉａｎｄｏｎｇ，ＬＩＡＮＧＺｏｎｇｑｉ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｕｎｇｕｓＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅａｎａｍｏｒｐｈｏｆＳｈｉｒａｉａｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｆｕｎｇｕｓｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ
ｆｒｏｍｍａｔｕｒｅａｓｃｏｓｐｏｒｅｓａｎｄｓｔｒｏｍａ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｌｏｎｙａｎｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｄｏｎｅｂｙ５．８ＳＩＴＳｒＤＮＡ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｓｔｒａｉｎｓＧＺＤＸＩＦＲ１７１ａｎｄＧＺＤＸＩＦＲ１８１ｗｅｒｅｉ
ｓｏｌａｔｅｄａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ，ｗｈｉｃｈｈａｄｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．Ｗｉｔｈｔｈｅｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｓｏｆｔｈｅ
ＩＴＳ１５．８ＳｒＤＮＡＩＴＳ２，ｔｈｅ５．８ＳＩＴＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＧＺＤＸＩＦＲ１７１ａｎｄＧＺＤＸＩＦＲ１８１ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ５．８ＳＩＴＳｒＤＮＡｉｎＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），ＧＺＤＸＩＦＲ１７１ａｎｄＧＺＤＸＩＦＲ１８１ｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｉｄｅｎｔｉｃａｌｗｉｔｈＳ．ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓＧＺＤＸＩ
ＦＲ１７１ａｎｄＧＺＤＸＩＦＲ１８１ｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅｔｈｅｔｒｕｅａｎａｍｏｒｐｈｏｆＳ．ｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓｈｉｒａｉａｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 吕冬梅］
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