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Effect on factors of energy metabolism in rats skeletal muscle by cold traditional Chinese medicine

寒性中药对大鼠骨骼肌能量代谢相关因子的影响



全 文 :寒性中药对大鼠骨骼肌能量代谢相关因子的影响
彭淑红1,2,黄丽萍3,2,高小恒4,张盨2,余日跃2,刘红宁4,徐宁迎1
(1.浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州 310029;
2江西中医学院,江西 南昌 330004;
3北京中医药大学 中药学院,北京 100029;
4江西中医学院 现代中药制剂教育部重点实验室,江西 南昌 330004)
[摘要] 目的:探讨6味寒性中药对大鼠骨骼肌能量代谢相关因子的影响。方法:6味寒性中药(苦参、栀子、黄柏、黄芩、
黄连和龙胆草)的水提取物分别按60,70,84,60,70,40g·kg-1灌胃大鼠30d,测定大鼠骨骼肌Na+K+ATP酶活
性、Ca2+ATP酶活性、琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性、骨骼肌糖原含量和骨骼肌解偶联蛋白3(UCP3)的 mRNA表达水平。结
果:6味寒性中药能显著降低Na+K+ATP酶活性和显著增加肌糖原含量;有降低Ca2+ATP酶活性的趋势,但只有黄芩达显
著水平(P<005);有降低SDH活性的趋势,其中黄芩、黄柏和龙胆草达极显著水平(P<001),黄连达显著水平(P<005);
除黄柏有降低UCP3mRNA趋势外,其他5味中药都能极显著地降低UCP3mRNA表达水平(P<001)。结论:寒性中药可能
通过减少葡萄糖的利用和SDH的活性从而减少 ATP的生成,降低 Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶的活性从而减少 ATP的消
耗,减少UCP3mRNA的表达从而减少产热,起到调节骨骼肌能量代谢的作用。
[关键词] 寒性中药;能量代谢;Na+K+ATP酶;Ca2+ATP酶;琥珀酸脱氢酶;解偶联蛋白3
[收稿日期] 20090516
[基金 项 目]  国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 (973)项 目
(2006CB504702);江西省教育厅项目(GJJ09276)
[通信作者] 刘红宁,Tel:(0791)7118857,Email:lhongning@ya
hoo.com.cn
[作者简介] 彭淑红,讲师,主要从事生物化学与分子生物学研究
和教学工作,Tel:(0791)7118921,Email:yaomoon@126com
  中药四气即寒、热、温、凉四性。寒为凉之甚,热
为温之极,故从四性本质属性而言,只有寒热两性之
分。运用现代科学技术,揭示寒热药性理论科学内
涵,不仅能促进中药药性理论的发展,而且能丰富和
发展中医药基础理论。生物能量是维持机体生命的
重要物质基础,能量代谢是人体物质代谢的最基本
形式。寒热中药与机体能量代谢的关系密不可分,
一般认为:寒凉药作用于机体表现为功能抑制,消耗
较少能量,产生较少热量;温热药则相反。为了进一
步验证这个思路,本试验拟通过对6味典型寒性中
药对骨骼肌能量代谢相关因子的影响,探寻寒性中
药的作用规律和药性特征,进一步为药性的科学评
价打好基础,从而更好的指导中药的临床运用。
1 材料
11 药物及试剂
黄连 RhizomaCoptidis、黄芩 RadixScutelariae、
黄柏 CortexPhelodendri、栀子 FructusGardeniae、苦
参RadixSophoraeFlavescentis、龙胆草 RadixGenti
anae均购自北京市鹤元堂医药科技有限公司,产品
批号均为200610003,其中黄连产于四川峨眉山,黄
芩产于甘肃陇西,黄柏产于四川荥经,栀子产于江西
金溪,苦参产于山西,龙胆草产于吉林临江;均经江
西中医学院付小梅副教授鉴定。Na+K+ATP酶
(批号20080705)、Ca2+ATP酶(批号20080705)、琥
珀酸脱氢酶(SDH)试剂盒(批号20080705),考马
斯亮蓝蛋白测定试剂盒(批号 20080705),大鼠
肌糖原测试盒(批号 20080611),均购自南京建
成生物工程研究所;Trizol购自全式金公司(批号
C20514);反转录试剂盒购自 Fermentas公司(批
号00033699);荧光定量 PCR试剂盒购自 TaKa
Ra公司(批号 BK8006)。所用引物通过引物设
计软件 Oligo6自行设计,序列如下:内参基因 β
actin参照 GenBank基因序列(NM_031144)设
计,上游引物 5′TGGGTATGGAATCCTGTG3′,
下游引物 5′GTGTTGGCATAGAGGTCTTT3′。
UCP3基 因 参 照 GenBank基 因 序 列 (NM_
013167)设计,上游引物5′CTACACCTCCTGAC
CTTG3′,下游引物 5′GCACTTCTGATGGCTGA
3′。均由上海生工合成。
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12 药物制备
药物水提液由本实验室制备。取黄连210kg、
黄芩180kg、黄柏252kg、栀子140kg、苦参180
kg、龙胆草 120kg,分别加入 10倍量水,浸泡 60
min,回流提取60min,倒出药液,残渣再加入 8倍
水,回流提取60min。合并2次药液,滤过、浓缩后
制成30L黄连水提液(含生药量070kg·L-1)
(用药前稀释1倍)、60L黄芩水提液(含生药量
030kg·L-1)、60L黄柏水提液(含生药量042
kg·L-1)、20L栀子水提液(生药量 070kg·
L-1)(用药前稀释1倍)、30L苦参水提液(生药量
060kg·L-1)(用药前稀释1倍)、30L龙胆水提
液(生药量040kg·L-1)(用药前稀释1倍),-20
℃放置备用。
13 动物
SD大鼠,雄性,体重(200±20)g,江西中医学
院动物中心提供,许可证号 SCXK(赣)20060001。
大鼠饲养予标准饲料和饮用水。
14 仪器
UV2000型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海
仪器有限公司)、Labfuge400R台式低温离心机(德
国Heraeus)、荧光定量PCR仪(BIOER)。
2 方法
21 动物分组与给药
大鼠70只,随机分为7组,即空白组、黄连组、
黄芩组、黄柏组、栀子组、苦参组、龙胆草组,每组10
只。各组动物适应性喂养3d后开始灌胃给药,灌
胃容积为10mL·kg-1,每日2次,共给药30d。每
天给药剂量(以下均为生药含量):苦参 60g·
kg-1,栀子70g·kg-1,黄柏84g·kg-1,黄芩60
g·kg-1,黄连70g·kg-1,龙胆草40g·kg-1,空
白组给予等容量的蒸馏水。
22 试验取材
第31天将大鼠麻醉,取出骨骼肌后迅速按照顺
序分成若干份,分别用锡箔纸包好,放入液氮中,然
后转移至-80℃冰箱保存备用。每1个实验指标
选用同一部位的骨骼肌组织进行。
23 骨骼肌Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶、SDH活
性及肌糖原含量的测定
准确称量骨骼肌组织,按质量体积比加9倍生
理盐水,制成 10%的匀浆,1500r·min-1离心 10
min,取上清液按试剂盒说明进行骨骼肌 Na+K+
ATP酶、Ca2+ATP酶、SDH活性的测定以及肌糖原
含量,组织蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。
24 SYBRGreen实时定量PCR检测UCP3基因的
表达[1]
241 mRNA提取及反转录 取骨骼肌组织50~
100mg加入 1mLTrizol按照说明书步骤提取总
RNA。紫外分光光度计测定 RNA浓度及纯度,吸
光度A260/A280178~21,所提取的 RNA -70℃储
存备用。按反转录试剂盒说明进行cDNA合成。
242 UCP3和βactin扩增效率检测 参照 Ken
neth方法[1],取一反转录好的骨骼肌cDNA样品,分
别稀释至100,50,20,10,5,2,1倍。测定每1个稀
释倍数下的 ΔCT=(CT,UCP3CT,βactin),数据经过最小
二乘法线性回归分析。
243 UCP3mRNA检测 取待测样品的 cDNA,
按照荧光定量 PCR试剂盒的说明书进行操作。反
应总体积20μL,cDNA为1~2μg,上游引物终浓度
05μmol·L-1,下游引物终浓度 05μmol·L-1。
反应条件:95℃1min,95℃15s及60℃60s,共
40个循环。最后做溶解曲线,以确定扩增产物的特
异性。所有样品均重复检测3次,用2ΔΔCT方法来表
示所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因
的表达倍数。
ΔΔCT=(CT,目的样本UCP3 -CT,目的βactin)-(CT,参照样本UCP3 -
CT,参照样本βactin)。
25 统计学方法
采用SPSS150进行统计分析。资料经过方差
齐性检验,数据用 珋x±s表示。药物组与对照组间的
差异比较用成组资料的t检验法。
3 结果
31 对大鼠骨骼肌 Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶
和SDH活性的影响
6味寒性中药均能显著降低骨骼肌 Na+K+
ATP酶活性,其中龙胆草、黄芩、黄柏、黄连达到极显
著水平(P<001),栀子、苦参达到显著水平(P<
005);6味寒药均能降低骨骼肌Ca2+ATP酶活性,
除黄芩组有显著性意义(P<005)外,其他5味寒
性中药均未达到显著水平;6味寒性中药均能降低
骨骼肌SDH活性,龙胆草、黄芩、黄柏能极显著降低
骨骼肌 SDH活性(P<001),黄连组有显著意义
(P<005),而苦参和栀子组虽然比空白组的 SDH
活性低,但是未达到显著水平(表1)。
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表1 寒性中药对大鼠骨骼肌Na+K+ATP酶、
Ca2+ATP酶和SDH活性的影响(珋x±s)U·mg-1
组别
剂量
/g·kg-1

Na+K+
ATP酶
Ca2+
ATP酶
SDH
空白  - 10 355±034 401±054 492±069
苦参  60 10 316±0551) 379±049 453±097
栀子  70 10 292±0691) 354±070 412±070
黄柏  84 10 278±0452) 362±078 384±0562)
黄芩  60 9 276±0582) 341±0391) 356±0352)
黄连  70 10 289±0632) 353±063 399±0881)
龙胆草 40 10 275±0532) 355±058 348±0302)
  注:与空白组比较1)P<005,2)P<001(表2,3同)。
32 寒性中药对大鼠肌糖原含量的影响
与空白组比较,6味寒性中药均能升高大鼠肌
糖原的含量,均达到极显著水平(P<001)(表2)。
表2 寒性中药对大鼠肌糖原含量的影响(珋x±s)
组别 剂量/g·kg-1 n 肌糖原/mg·g-1
空白  - 10 450±088
苦参  60 10 526±0382)
栀子  70 9 588±0562)
黄柏  84 9 526±0252)
黄芩  60 10 541±0382)
黄连  70 10 571±0692)
龙胆草 40 9 555±0382)
33 寒性中药对大鼠骨骼肌 UCP3mRNA表达的
影响
6味寒药均能降低大鼠骨骼肌 UCP3mRNA的
表达量,除黄柏外,其他5种药物均极显著的低于空
白对照组(P<001)(表3)。
表3 寒性中药对大鼠骨骼肌UCP3mRNA
表达的影响(珋x±s)
组别 剂量/g·kg-1 n UCP3mRNA
空白  - 10 109±045
苦参  60 9 036±0162)
栀子  70 9 044±0292)
黄柏  84 9 094±060
黄芩  60 9 038±0352)
黄连  70 8 038±0262)
龙胆草 40 9 010±0072)
4 讨论
机体能量代谢包含能量生成和分解两部分。
ATP是机体能量的主要体现形式。ATP生成方式有
2种———氧化磷酸化和底物水平磷酸化,其中以氧
化磷酸化为主。SDH是氧化磷酸化呼吸链的主要
组分之一,同时也是参与三羧酸循环代谢反应的重
要酶。UCP通过催化质子的跨线粒体内膜运输,降
低线粒体内膜两侧的质子梯度[2],从而降低 ATP生
成,使产热增加。动物体内已知的 UCP包括 UCP1,
UCP2,UCP3,UCP4和UCP5,其中UCP3高水平地表
达在骨骼肌与棕色脂肪组织(BAT)中[3]。所以
SDH和UCP都与 ATP生成密切相关。本次结果6
味寒性中药均能降低骨骼肌 SDH的活性和 UCP3
mRNA表达量,表明寒性中药能降低能量代谢中
ATP的生成,并使产热降低。另外,6味寒药对大
鼠肌糖原含量均有显著的升高作用,提示6味寒药
可能通过减少骨骼肌对于葡萄糖的利用,而使机体
ATP产生减少。
Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶与ATP的分解关
系密切。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上,
是生物膜上的一种蛋白酶,它在物质运送,能量转
换,以及信息传递方面具有重要作用。其中 Na+
K+ATPase参与机体内多种生理活动,其对 Na+,
K+的运转是一个耗能的过程,需要消耗 ATP,在静
息的人体内,细胞质内25%的 ATP被 Na+K+ATP
酶水解[4]。Ca2+ATP酶是另一种通过消耗 ATP来
维持胞质和肌浆网之间 Ca2+平衡的膜蛋白。据报
道,胞质和肌浆网Ca2+的循环能为肌肉的静息能量
消耗贡献 30% ~70%(依肌肉中钙池的大小而
定)[5]。本次结果 6味寒性中药均能降低骨骼肌
Na+K+ATP酶、Ca2+ATP酶的活性,说明 6味寒
药能降低对 ATP的分解。周灿平等[6]报道寒药黄
连能进一步降低体虚小鼠肝脏 Na+K+ATP酶、
Ca2+ATP酶的活性。但是文献鲜见寒药对骨骼肌
ATP酶活性影响的报道。
综上所述,寒药通过减少能源物质的利用和降
低SDH活性而降低了 ATP生成,同时通过降低
UCP3的表达量减少产热,另外通过降低 Na+K+
ATP酶和 Ca2+ATP酶活性而降低了对 ATP的分
解,这与寒凉药作用于机体表现为功能抑制,消耗较
少能量,产生较少热量是一致的。这可能也是《神
农本草经》指出“药有寒热温凉四气……疗寒以热
药,疗热以寒药”的现代生物学依据。寒性中药可
能通过调节骨骼肌的能量代谢,纠正热证患者或热
证动物模型与能量代谢增高有关的病理生理基础。
[参考文献]
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Efectonfactorsofenergymetabolisminratsskeletalmuscleby
coldtraditionalChinesemedicine
PENGShuhong1,2,HUANGLiping3,2,GAOXiaoheng4,ZHANGSu2,YURiyue2,LIUHongning4*,XUNingying1
(1.AnimalScienceColegeofZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China;
2JiangXiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;
3BeiJingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;
4KeyLaboratoryofModernPreparation,MinistryofEducationJiangxiUniversityofTraditional
ChineseMedicine,Nanchang330004,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectofsixcoldtraditionalChinesemedicineontheenergymetabolismfactorsinrats
skeletalmuscleMethod:TheactivityofNa+K+ATPase,Ca2+ATPaseandsuccinatedehydrogenase(SDH),thecontentofmuscle
glycogen,andthemRNAexpressionofskeletalmuscleuncouplingprotein3(UCP3)weremeasuredafterratshavingbeenadministra
tedwithwaterextractsofRadixSophoraeFlavescentis,FructusGardeniae,CortexPhelodendri,RadixScutelariae,RhizomaCopti
dis,andRadixGentianaerespectivelyatthedoseof60,70,84,60,70,40g·kg-1for30daysResult:Theactivityof
Na+K+ATPasehasbeendepressedsignificantlyandthecontentofskeletalmuscleglycogenhasbeenincreasedremarkablybysix
coldtraditionalChinesemedicineThedecreasedtendencyhasbeenfoundonactivityofCa2+ATPaseandSDH,onlytheRadixscutel
lariaeggroupdecreasedtheCa2+ATPaseactivitysignificantly(P<005),theSDHactivitywasdecreasedhighsignificantlybyRadix
scutelariae,CortexPhelodendri,RadixGentianaeandsignificantlybyRhizomaCoptidisThemRNAexpressionofUCP3hasbeen
decreasedhighsignificantlybyalfivecoldtraditionalChinesemedicineexceptCortexPhelodendrigroupwiththedecreasedtendency
ofUCP3mRNAexpressionConclusion:ThecoldtraditionalChinesemedicinehasthesignificantefectsontheskeletalmuscleenergy
metabolismbydecreasingtheutlizationoftheglucoseandtheactivityofmitochondriaSDHtoreducetheproductionofATP,andde
pressingtheactivityofNa+K+ATPaseandCa2+ATPasetocutdowntheconsumptionofATP,bydecreasingthemRNAexpression
ofUCP3todecreasetheheatproduction
[Keywords] coldtraditionalChinesemedicine;energymetabolism;Na+K+ATPase;Ca2+ATPase;succinatedehydrogen
ase;UCP3
[责任编辑 古云侠]
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