全 文 :乌药中异喹啉生物碱去甲异波尔定的含量测定
陈建忠1,鱺桂新2,3,杨莉2,王长虹2,王峥涛1,2,3
(1.中国药科大学 生药学研究室,江苏 南京 210038;
2.上海中医药大学 教育部中药标准化重点实验室,上海 201210;
3.上海中药标准化研究中心,上海 201210)
[摘要] 目的:建立乌药中去甲异波尔定的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法测定去甲异波尔定(norisoboldi
ne)的含量,以PhenomenexGeminiC18柱为固定相,乙腈05%甲酸(加三乙胺调节pH至225)为流动相,梯度洗脱,检测波长
为280nm,柱温25℃。结果:去甲异波尔定在 0015~1509μg峰面积与进样量呈良好的线性,r=09999;平均回收率为
9958%,相对标准偏差为14%。结论:通过对20批不同来源的乌药样品中去甲异波尔定的测定,结果表明方法简单,准确
可靠,重复性好,可为提升乌药的质量标准提供依据。
[关键词] 乌药;去甲异波尔定;高效液相色谱法;含量测定
[收稿日期] 20090324
[通信作者] 王峥涛,Tel/Fax:(021)51322507,Email:wangzht@
hotmail.com
乌药为樟科山胡椒属植物乌药Linderaaggrega
ta(Sims)Kosterm.的干燥块根,为传统常用中药,
是重要的温胃理气止痛药之一[1]。药理学研究表
明乌药具有广泛的药理活性。如乌药能增加消化液
的分泌[2],还能对抗临床应用大黄引起的腹痛[3],
有兴奋和增强胃运动节律作用[4],可以显著抑制溃
疡的形成,明显对抗乙醇诱发的细胞损伤,具有细胞
保护作用[5]。近来又发现乌药具有较强的镇痛、抗
炎作用[6]和显著的抗风湿作用[7]。
《中国药典》2005年版一部中乌药的薄层鉴别
和含量测定的指标成分都是乌药醚内酯。乌药醚内
酯为倍半萜类成分,是乌药的特征性成分,专属性
强,作为乌药的真伪鉴别指标较为适宜。但乌药醚
内酯为脂溶性成分,在水煎液中的煎出率较低,且含
量也较低,作为含量测定的指标不是最佳的选择。
乌药含有多种异喹啉类生物碱[8],且具有良好的生
物活性,试验表明乌药总碱具有抗类风湿关节炎的
活性,口服给药能显著抑制大鼠佐剂关节炎、小鼠胶
原关节炎,并能显著抑制 ConA(刀豆蛋白 A)引起
的小鼠脾淋巴细胞增殖,LPS(脂多糖)所致小鼠腹
腔巨噬细胞释放 NO(一氧化氮)和 IL1(白细胞介
素1)[911],去甲异波尔定是其中的主要成分。最新
研究报道,乌药中异喹啉类生物碱的含量测定方法
有高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱法
(UPLC)两种,测定的指标成分有波尔定、降波尔
定、网状香荔枝碱和 Linderegatine[1213]。综上所述,
本实验选择去甲异波尔定作为含量测定的指标,采
用高效液相色谱法进行含量测定,为提升乌药的质
量标准提供方法依据。
1 仪器与试药
美国安捷伦 HP1100系列高效液相色谱仪(包
括四元泵,自动进样器,二极管阵列检测器。去甲异
波尔定对照品由上海中药标准化研究中心提供(纯
度大于98%),乙腈为色谱纯(美国Fisher公司),甲
酸和三乙胺为色谱纯(美国 Tedia公司),水为重蒸
水,其余溶剂为分析纯。
20批乌药样品分别收集于安徽、河北、河南、四
川、哈尔滨、贵州、江西、浙江等地和市售乌药,均由
上海中医药大学吴立宏博士鉴定,除了一批为伪品
以外,其余的均为樟科山胡椒属植物乌药 L.eag
gregata。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 PhenomenexGeminiC18色谱柱
(46mm×250mm,5μm);流动相,乙腈为 A相,
05%甲酸(用三乙胺调节 pH至225)为 B相,梯
度洗脱,0~13min,10% ~22%A;13~22min,22%
A。柱温 25℃;流速 1mL·min-1,检测波长 280
nm,进样量5μL。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取去甲异波尔定
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对照品适量,加甲醇05%衡盐酸的混合溶液(2∶1)
制成每 1mL中含去甲异波尔定 02mg,摇匀,即
得。
2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过3号筛)
05g,精密称定,置250mL圆底烧瓶中,精密加入
甲醇稀盐酸(05%)的混合液(2∶1)25mL,称定质
量,加热回流并保持微沸1h,放冷,再称定质量,用
甲醇稀盐酸(05%)的混合液(2∶1)补足减失的质
量,摇匀,静止,取上清夜,045μm滤膜过滤即得。
2.4 检测限与定量限 以信噪比为3∶1确定检测
限为 1509ng;以信噪比为 10∶1确定定量限为
3018ng,RSD17%。
2.5 线性关系 取去甲异波尔定对照品15mg,精
密称定,置50mL量瓶中,加混合溶剂甲醇稀盐酸
(05%)溶液(2∶1)稀释至刻度,摇匀。精密吸取该
溶液01,2,4,6,8,10mL转移至10mL量瓶中,加
混合溶剂甲醇05%盐酸溶液(2∶1)至刻度,摇匀,
分别制成浓度为 00030,00604,01207,0181
1,02415,03018g·L-1的对照品溶液。准确吸
取上述对照品溶液5μL,按上述确定的色谱条件进
行测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,回归方
程为Y=85694X-13303,r=09999。
2.6 精密度试验 准确吸取同一供试品溶液 5
μL,连续6次,分别测定去甲异波尔定的峰面积,结
果RSD038%。
2.7 重复性试验 取同一样品(四川成都)6份,精
密称定,按“供试品溶液制备”项下操作,在上述色
谱条件下进行进样测定,测得去甲异波尔定的平均
含量为0990%,RSD038%。
2.8 稳定性试验 准确吸取同一供试品溶液 5
μL,分别在0,4,12,24,48,72h进行测定,以去甲异
波尔定的峰面积进行考察,进样 6次,测得 RSD
093%。表明样品至少在72h内稳定。
2.9 加样回收率试验 取已知去甲异波尔定含量
的乌药样品粉末025g,精密称定9份,每3份加入
相同量(分别为已知含量的80%,100%,120%)的
去甲异波尔定对照品,按“供试品溶液制备”项下方
法操作,测定。9次平均回收率为 9958%,RSD
14%。结果见表1。
2.10 样品测定 按照本方法的测定条件,分别测定
20批次的乌药样品,每个批次平行2份,每份样品平
行进样2次,以外标法计算样品中去甲异波尔定的含
量,结果见表2。样品和对照品HPLC图见图1。
表1 去甲异波尔定加样回收率(n=9)
称样量
/g
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
02485 24602 1980 44749 10176
02451 24265 1980 44321 10129
02483 24582 1980 44412 10015
02418 23938 2463 48215 9857
02493 24681 2463 48817 9800 9958143
02447 24225 2463 48231 9747
02487 24621 2960 54074 9950
02453 24285 2960 53858 9991
02441 24166 2960 53639 9957
表2 20批次不同来源乌药中去甲异波尔定的
质量分数(n=2) %
收集地 产地 去甲异波尔定
安徽亳州 浙江 0214
浙江天台 浙江 0265
上海浦东新区 浙江 0383
浙江天台 浙江 0484
江西玉山 浙江 0646
河北安国 浙江 0656
河北安国 浙江 0690
黑龙江哈尔滨 浙江 0758
河南中原 浙江 1079
安徽亳州 浙江 1265
广东广州 广东 0315
四川成都 广东 0966
陕西西安 福建 0520
广东普宁 江西 0736
湖北 湖北 0733
重庆石柱 重庆 0000
贵州威宁 不详 0610
贵州贵阳 不详 0985
四川内江 不详 0989
四川威远 不详 1082
A.对照品;B.样品;1.去甲异波尔定。
图1 去甲异波尔定对照品及样品HPLC图
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3 讨论
在供试品溶液制备中,分别考察了不同的提取
溶剂(05%盐酸溶液、1%盐酸溶液、甲醇、不同比
例的甲醇和05%盐酸溶液的混合液、氯仿和醋酸
乙酯)、不同的提取方法(超声法、回流法和浸渍
法)、提取时间(30,60,120,180min)、提取次数(1
次、2次和3次),结果表明,以甲醇和05%盐酸溶
液混合液(2∶1)为溶剂,50倍量,回流提取1次,每
次60min,为最佳提取方法。
在耐受性实验中,还分别考察了不同的色谱柱、
不同流速、不同的柱温和不同流动相 pH等,结果表
明,色谱条件的微小变化对测定结果影响不大(RSD
均小于2%),说明本方法的耐用性好。
各批样品中去甲异波尔定的质量分数在
0214%~1265%,不同产地之间的含量相差比较
大,即使同一产地的各个批间,也差异较大。其中从
重庆石柱收集的样品为伪品,未能检出去甲异波尔
定。说明各地各批次的乌药品质有较大的区别,这
不利于中医的临床用药。因此,本文报道乌药中去
甲异波尔定的含量测定方法,简单、可靠和重复性
好,可用于中药乌药的质量控制研究,对于提高其质
量、保证临床疗效具有重要意义。
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DeterminationofnorisoboldineinRadixLinderaebyRPHPLC
CHENJianzhong1,CHOUGuixin2,3,YANGLi2,WANGChanghong2,WANGZhengtao1,2,3
(1.DepartmentofPharmacognosy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,China;
2.KeyLaboratoryofStandardizationofChineseMedicinesofMinistryofEducation,ShanghaiUniverstiyof
TraditionalChineseMedicine,Shanghai201210,China;
3.ShanghaiR&DCentreforStandardizationofChineseMedicines,Shanghai201210,China)
[Abstract] Objective:TodevelopaRPHPLCmethodforquantitativedeterminationofnorisoboldineinRadixLinderaeandto
providevaluabledataforqualitycontrolofRadixLinderae.Method:TheseparationwasperformedonaPhenomenexGeminiC18col
umn(46mm×250mm,5μm)at25℃ usingagradientelutionofmobilephaseA(05% formicacid,adjustedpH225withtri
ethylamine)andmobilephaseB(acetonitrile).Thedetectionwavelengthwas280nm.Result:Thecalibrationcurveshowedagood
linearity(r=09999)withintestrangesof00151509μg.Theaveragerecoverywas9958% withRSD14%.Conclusion:The
developedmethodissimple,accurateandreliablewithgoodrepeatability.ItissuitableforqualityevaluationofRadixLinderae.
[Keywords] RadixLinderae;norisoboldine;HPLC;assay
[责任编辑 王亚君]
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