全 文 ：通窍活血汤含药血清对谷氨酸损伤的
F<+ 细胞的保护作用
汪宁!+!! 邓奕! 何群! 李庆林! 彭代银! 段金廒+
-安徽中医学院 安徽省中药研究与开发重点实验室! 安徽 合肥 +)$$)%
+-南京中医药大学 江苏省方剂研究重点实验室! 江苏 南京 +$$+*#
摘要#!目的#从细胞水平研究通窍活血汤含药血清!P^ETX对谷氨酸!OSL损伤的 F<+ 细胞的保护作用$为该方剂
的临床应用提供依据) 方法#8X大鼠灌胃给予通窍活血汤提取液$每日 + 次$每次 & D*KDf$连续 J$制备通窍活血汤含药
血清) 采用F<+ 细胞和终浓度为 +d 00/S*Gf的谷氨酸共培养$造成神经细胞损伤模型) 光镜观察 e$$e$+$e的
P^ETX对损伤F<+ 细胞形态改变的影响+台盼兰染色法%4H=IR染色法及GXE法观察 P^ETX对损伤的细胞膜通透性的变
化影响+9PP法检测 P^ETX对F<+ 细胞增殖及活性的影响及对培养上清液中 ;H浓度的影响) 结果#倒置显微镜下可见$
正常组细胞胞体较损伤组略大$呈强折光性$细胞数量多$突起长) 模型组细胞数量显著减少$折光性明显减弱$细胞突起减
少%缩短) P^ETX和F<+ 细胞共培养 +& ?后$活细胞数明显增加$细胞折光性增加$损伤细胞形态接近于正常细胞+台盼兰
染色后$P^ETX组活细胞比率明显上升$4H=IR染色后被IR染色的数量较少) 9PP法检测结果显示$与模型组比较$各浓度
P^ETX组的吸光度2均升高且有显著性差异) 各浓度的 P^ETX组细胞培养上清中GXE$;H含量相对模型组明显减少$两
者有显著性差异) 结论#P^ETX对OSL损伤的F<+ 细胞有明显的保护作用)
关键词#!通窍活血汤含药血清!P^ETX+F<+ 细胞+谷氨酸+保护作用
稿件编号#!+$$*+$($$#
基金项目#!国家自然科学基金面上项目!)$*%)*%*+江苏省方剂
研究重点实验室开放课题!QWc+$$#$$*+ 安徽省 +$$( 年度科技计
划项目!($+$)$)$%*
通信作者#!!汪宁$PMS#!$#*+)+$ I50BNS#,B2D2?Vv3
6B?//d./0d.2
!!通窍活血汤为清代王清任所创$ 主要由麝香%
桃仁%赤芍%川芎%红花等中药组成$ 治头面四肢周
身血管血瘀之证) 该方临床上对中风!包括脑梗
死%血管性痴呆%脑供血不足等%偏头痛%脑外伤性
耳鸣耳聋及眩晕等疾病的防治及症状的改善有较好
的效果$疗效确切.5)/ ) 前期的实验研究证实通窍活
血汤对整体脑缺血动物模型具有显著的脑保护作
用$并对其作用机制进行了初步的探讨.&5/ ) 本研究
从细胞水平探讨通窍活血汤含药血清!P^ETX对
谷氨酸!OSL损伤的神经细胞的保护作用)
!材料
_!药材!通窍活血汤处方药材组成为桃仁%赤
芍%川芎%红花%麝香等) 人工麝香购自北京联馨药
业有限公司$其余中药均购自合肥和义堂中药饮片
有限公司)
_(!仪器!+
培养箱!84;` H公司+洁净工作台
!苏净集团安泰公司+HS60ALU公司+IGT($$9[型酶联免疫检测仪!美国
RN/5PMK公司+IGT($$Ll酶标仪!RN/5PMK公司)
_&!药品与试剂!谷氨酸!#5DSL@B0B@M$8ND0B公司
进口分装$G/@+$$(=+胰蛋白酶!40MCU./公司$批
号 $%$#+$+GXE试剂盒!南京建成生物工程研究
所$批号 +$$($++;H试剂盒!南京建成生物工程
研究所$批号 +$$($%+$)
_Q!动物及细胞株!F<+ 细胞株购自中国科学院
上海细胞所+8X大鼠由安徽医科大学实验动物中心
提供$合格证号皖医实动准字第 $ 号)
(!方法
(_!F<+ 细胞的培养!将 F<+ 细胞接种于培养
瓶中$培养基为>F5#&$!含 $e胎牛血清%青霉素
$$ _*0G
f和链霉素 $$ 0D*Gf$置于 )% h$
e +
培养箱中培养) 细胞贴壁生长$待细胞长至
*$e的密度$用 $d+e胰蛋白酶消化传代$每 ) g
J传代 次)
(_(!通窍活血汤提取液的的制备!称取 $ 倍量的
处方!麝香后加$采用水提醇沉法制备通窍活血汤
*%$)*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
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[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
提取液!生药含量为 d# D*0Gf$备用)
(_&!通窍活血汤含药血清的制备.#/!选用健康 8X
大鼠$体重 *$ g+$ D$+$ 只$雌雄各半) 给药组!$
只灌胃给予通窍活血汤提取液!& D*KDf$每日早
晚 +次$连续 J) 空白组!$ 只给予等量的生理盐
水) 末次给药后 ?$腹腔注射水合氯醛!)$ 0D*
KD
f
麻醉$腹主动脉取血$)% h静置 ?$) $$$ C*
0N2
f离心 $ 0N2$分离血清$放入离心管中$$d&

0
微孔滤膜过滤除菌$分装$f+$ h保存备用)
(_Q!实验分组!正常对照组#>F95#&$ 培养基 k
空白大鼠血清 !按血清浓度分为 e$$e$+$e
组+模型对照组#>F95#&$ 培养基 kOSL k空白大
鼠血清 !按血清浓度分为 e$ $e$ +$e组+
P^ETX组#>F95#&$ 培养基kOSL kP^ETX!按血
清浓度分为 e$$e$+$e组 ) 各组分别加入不
同浓度的空白血清或 P^ETX$ ? 后$模型组及
P^ETX组分别加入终浓度为 +d 00/S*Gf的
OSL进行损伤$放入培养箱中培养 +& ?) 培养结束
后进行各项检测)
(_$!P^ETX对 OSL 损伤的 F<+ 细胞形态的影响
!细胞接种至 *# 孔板中$待贴壁后饥饿 +& ?$分别
加不同浓度的 P^ETX培养 +& ?) 各组细胞置倒置
显微镜下观察$并拍照)
(_Y!P^ETX对 OSL 损伤的 F<+ 细胞膜通透性变
化影响!台盼蓝染色法#取对数生长期细胞消化后
制成 i$个=0G的细胞悬液$接种至 # 孔细胞培
养板中$+ 0G=孔) 待细胞贴壁后换用无血清培养
基饥饿$+& ?后分组加药培养 +& ?) 培养结束后消
化%收集细胞$将各组细胞调整至每管 i$#个)
各组加入 $d&e的台盼蓝染液$用细胞计数板在普
通光学显微镜下计数$死细胞可被蓝染$活细胞不染
色) 分别记录染色和未染色的细胞数$计算细胞存
活率 j未染色细胞数=!被染色细胞数 k未染色细
胞数 i$$e)
荧光显微镜观察!4H=IR染色法 .%/ #制备细
胞爬片$各组加药培养后$分别加终浓度为 )$ 0D*
G
f的4H和终浓度为 &$ 0D*Gf的 IR$避光染色
+$ 0N2后$将爬片取出$盖至载玻片上$荧光显微镜
下观察$拍照)
(_%!P^ETX对 OSL 损伤的 F<+ 细胞的增殖及活
力影响!细胞接种至 *# 孔板中$待贴壁后饥饿 +&
?$分别加终浓度 e$$e$+$e的 P^ETX培养 +&
?) 培养结束后9PP法检测细胞的增殖及活力)
(_`!P^ETX对F<+细胞培养上清液中乳酸脱氢酶
!GXE和;H含量的影响!细胞接种至 *# 孔细胞培
养板$加不同浓度的 P^ETX培养后$吸取每孔内的
细胞培养上清液$按GXE$;H试剂盒说明书检测)
(_#!统计处理方法!实验数据用
#
Mp?表示$各组
间数据比较采用,检验)
&!结果
&_!P^ETX对 OSL 损伤的 F<+ 细胞形态学改变
的影响!正常 F<+ 细胞呈圆形%梭形或多边形$为
贴壁生长细胞$可有一到多条的类似神经突起的细
胞突起出现$细胞生长迅速$培养 + g+& ? 后细胞
成簇生长$+ g) J 后突起明显增多$增长$可见多数
突起从细胞边缘发出$相互连接成网状$在倒置显微
镜下呈强折光性$核不易见) +d 00/S*Gf的
OSL作用于F<+ 细胞后 + g) ? 即可见部分细胞体
肿胀$细胞形态改变$折光减弱$作用 +& ? 后$大部
分F<+ 细胞胞体变小%变圆$失去折光性$细胞突
起明显减少%缩短$细胞之间的突起连接明显减少)
细胞可由贴壁生长脱落到细胞培养液中悬浮$随着
培养时间的延长活细胞逐渐减少) 经过 P^ETX处
理的F<+ 细胞$细胞形态学的改变与模型组 F<+
细胞比较有明显的改善) 在显微镜下见活细胞数明
显增加$细胞的脱落率下降$细胞的贴壁率提高$细
胞折光性增加$细胞间仍可见比较多的细胞联系$细
胞仍以簇状生长为主$散在单一的细胞较少$接近正
常组细胞)
&_(!P^ETX对 OSL 损伤的 F<+ 细胞膜通透性变
化影响!模型组可被蓝染的死细胞明显增多$细胞
存活率 ! %#d( p#d$% e 与正常组 ! *$d( p
$de相比明显下降!$n$d$$eP^ETX组
!((d) p+d$+e和模型组比较明显增高$有显著
性差异!$n$d$)
荧光显微镜法观察 !4H=IR染色#正常组
F<+ 细胞形态规则$大部分细胞经 4H染色成均匀
一致的绿色+而模型组细胞经 OSL 损伤后可见大部
分细胞经4H染色后核染色质部分呈现浓染$且部
分细胞发出强烈的橘红色荧光+而 e的 P^ETX组
细胞仅出现部分 4H核浓染的细胞$说明细胞膜损
伤情况相对模型组已明显减轻) 见图 )
&_&! P^ETX对F<+ 细胞的增殖及活力影响!模
型组与正常组比较$2值明显降低$有显著性差异
*($)*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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9B6$ +$$
!!
图 !4H=IR染色法观察 P^ETX对OSL损伤的
F<+ 细胞的影响! i&$$
!$n$d$$e$$e$+$e的 P^ETX组与同浓度
的模型组比较$2值明显增高$两者有显著性差异
!$n$d$) 说明各浓度 P^ETX对细胞的增殖及
活力均有明显的增强作用) 见图 +)
与同浓度正常组比较 $n$d$+
与同浓度模型组比较 +$n$d$)
图 +!不同浓度 P^ETX对OSL损伤的F<+ 细胞
增殖及活力的影响!
#
Mp?$)j#
&_Q!P^ETX对 F<+ 细胞培养上清液中 GXE和
;H变化的影响!模型组细胞培养上清中的GXE活
力明显高于同浓度的正常组$两者有显著性差异
!$n$d$) 而各浓度 P^ETX组细胞培养上清液
中的GXE活力均低于模型组$有显著性差异) 同时
模型组细胞培养上清液中;H水平相对正常组有明
显升高$P^ETX组细胞内;H水平相对模型组明显
降低$有显著性差异) 见表 )
Q!讨论
前期体外实验结果显示通窍活血汤提取液对谷
氨酸损伤的 F<+ 细胞有保护作用.(/ $但考虑到在
体外实验中$和细胞直接作用的中药复方提取液成
分的复杂性$尤其是其中杂质等成分对实验结果的
影响$因此$本研究将该复方的含药血清作用于细
胞$从细胞水平观察其对损伤神经细胞的保护作用)
血清药理学方法在实际应用中$应考虑血清本身所
含物质成分及血清体积等因素对体外实验结果的影
响$血清比例低时$反应体系中血药浓度偏低$而血
!!
表 !P^ETX对OSL损伤的F<+ 细胞GXE活性
及;H的影响!
#
Mp?$)j#
组别 血清浓度=e
GXE=_*G
f
;H=

0/S*G
f
正常 #+- p*-+( (-$%( p$-$$)
$ *++-%$ p&-)* %-%*+ p$-$$
+$ **+-+ p#-# $-&* p$-$+)
模型 *$(-&
p)-#$
+
*-)))
p$-$$&

$ +$-$
p%-
+
*-))
p$-$$
+
+$ )(-$
p&-&+
+
&-(&
p$-$$#
+
P^ETX %&-)
p+(-$
&
%-*$+
p$-$$&
&
$ #-$)
p$-$$
)
(-))
p$-$$+
)
+$ +)%-$%
p*&-(#
)
+-(&
p$-$$#
&
!!注#与同浓度正常组比较 $n$d$$+$n$d$+与同浓度模型
组比较)$n$d$$&$n$d$)
清比例高时$血药浓度又趋饱和) 由于血清本身所
含物质成分对细胞的毒性作用$含药血清在高浓度
时可抑制细胞增殖.*/ ) 在离体实验中$含药血清的
浓度不宜太高$血清添加量以不超过 +$e为宜.$/ )
本实验通过筛选确定了 P^ETX作用于 F<+ 细胞
适宜的血清浓度为 e g+$e$设立 e$$e$+$e
) 个含药血清剂量组$并在正常组和模型组中分别
平行加入 e$$e$+$e的空白大鼠血清对照$以
排除血清本身活性对实验结果的影响)
在OSL 离体损伤模型中$国内外对 OSL 诱导细
胞损伤使用的剂量有不同的报道$而且因为 OSL 作
用的细胞种类!大脑皮层细胞%小脑颗粒细胞%海马
细胞%F<+ 细胞等%作用持续时间%实验方法和检
测方法的不同$更为重要的是 OSL 使用剂量的不同
使得不同研究中OSL损伤模型也不同) 本实验结合
文献报道并通过9PP法进行筛选$采用浓度为 +d
00/S*G
f的谷氨酸作用 +& ? 造成 F<+ 细胞的损
伤模型)
通常情况下神经细胞的GXE释放较少$但受损
神经细胞释放的GXE则明显增多$神经细胞损伤程
度与GXE释放量成正比$故测定培养液中 GXE活
性是反映细胞损伤的一种敏感且较为简便的指标)
一氧化氮!;H在中枢神经系统具有广泛的生理作
用$在正常的情况下$神经元合成和释放适量的
;H$参与多种神经功能$但若合成和释放过多$则会
诱发细胞毒性作用$导致细胞损伤$加速神经元的凋
亡或死亡) 本实验结果表明$模型组 F<+ 细胞形
态损伤明显$易被台盼蓝及IR染色$对9PP的摄取
能力明显下降$培养液中 GXE漏出量及 ;H含量明
**$)*
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!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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9B6$ +$$
显高于对照组+而给予不同浓度的 P^ETX后$损伤
细胞的形态接近正常细胞$被台盼蓝及 IR染色细
胞减少$细胞上清液中的 GXE及 ;H含量明显减
少$通窍活血汤含药血清能增强 F<+ 细胞的活力$
保护细胞膜完整性$有明显的拮抗兴奋性氨基酸的
神经毒作用)
参考文献#
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AC/@M.@NlMMVM.@U.W/dWF?BC0B./S9M@?$**$ +)##)-
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动力学.W/-世界科学技术&&&中药现代化$+$$+$&!)#-
2>FD?JD?A>TA-O>>I>TAH?IH>DF+V-ABE>T?TA-?@!<]0[=
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JB0BDMJ \6DSL@B0B@M!OSLB2J AC/lNJM.SN2N.BSAC//V/V@?MV/C0LSBMd;>AB?E# 8ACBDLMXB,SM6CB@UL2JMC,M2@N2@CBDBU@CN.BJ0N2NU5
@CB@N/2 /VP/2DbNB/EL/7LMJM./.@N/2 @,N.MBJB6V/CVNlMJB6U$ @?MBJ0N2NU@CB@N/2 J/UMV/CCB@U,BU& D*KD
f
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2N2DP^ETX,BUACMABCMJdP?M0/JMS/V2MLC/.6@MUJB0BDMJ \6OSL ?BJ \MM2 MU@B\SNU?MJ \6BJJN2D+d 00/S*G
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OSL @/.LS@LCM
0MJNL0/VF<+ .MSU-F?/@N.0N.C/U./AM?BJ \MM2 LUMJ @//\UMClM@?M0/CA?/S/DN..?B2DMU/V.MSU$ @?MAC/SNVMCB@N/2 B2J B.@NlN@6/V
F<+ .MSU?BJ \MM2 JM@M.@MJ \69PPd\SLMB2J 4H=IR$ @?MB.@NlN@NMU/VGXEB2J @?M./2@M2@U/V;HN2 @?MULAMC2B@B2@/VF<+ .MSU?BJ \MM2 JM@M.@MJ BV@MCe$$e$
+$e P^ETX\MN2DBJJMJ @/@?M.LS@LCM0MJNL0/VF<+ .MSUJB0BDMJ \6OSLd7>HF.A# P?M0/CA?/S/DN..?B2DMUN2 .MSU,MCM/\5
UMClMJ L2JMC@?MN2lMC@MJ 0N.C/U./AMd;/C0BSF<+ .MSUN2 ./2@C/SDC/LA ,MCMVLSB2J \CND?@$ \L@@?M.MSUM7A/UMJ @/OSL ,MCM
U?CB2K+ 0/CM/lMC$ U/0M.MSU,MCMJNUCLA@MJ$ ./2VNDLCB@N/2 /V@?M.MSUN2 @?MP^ETX DC/LA ,BU.S/UMJ @/@?B@/V2/C0BS
DC/LAdN.B2@N2.CMBUM-4V@MC4H=IRU@BN2N2D$ .MSUN2 P^ETXDC/LAU,MCMSMUU\MN2DU@BN2MJ \6IR-P?MB\U/C\B2.M!2 lBSLMU/VP^ETX
DC/LA N2.CMBUMJ SBCDMS6-GXEB2J ;HN2 .MS.LS@LCMULAMC2B@B2@?BJ JM.CMBUMJ$ N@?BJ U?/,2 @?M0BCKMJ JNVMCM2.Md/?@T.FH-?@#
P^ETXU?/,MJ B2 BAABCM2@AC/@M.@NlMMVM.@/2 2MLC/.6@MUJB0BDMJ \6OSL /2 AC/SNVMCB@N/2 B.@NlN@6B2J 0M0\CB2MAMC0MB\NSN@6d
.a>C V?DEH/!P/2DbNB/EL/7LMJM./.@N/2!P^ETX+ F<+ .MSU+ DSL@B0B@M+ 2MLC/AC/@M.@NlMMVM.@
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责任编辑!张宁宁#
*$)*
第 ) 卷第 $ 期
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