全 文 ：参薯种质遗传多样性的 ＩＳＳＲ分析
吴志刚１，冷春鸿１，陶正明１，魏余煌２，姜程曦１
（１浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 ３２５００５；２瑞安市农林局，浙江 瑞安 ３２５２００）
［摘要］ 目的：研究参薯亲缘关系和遗传多样性。方法：收集２０个样品并对其原植物进行鉴定，样品进行 ＩＳＳＲ分析，
ＮＴＳＹＳｐｃ计算遗传相似系数，ＵＰＧＭＡ方法聚类。结果：２０个样品被鉴定为参薯、褐苞薯蓣、山薯。参薯与褐苞薯蓣、山薯存
在明细的遗传差异，且其种内差异十分显著，遗传相似性系数为０６７２９～０９９０７。ＵＰＧＭＡ聚类显示参薯种内１６个样品可
划分为４组，对照样品原植物表型特征，可见断面颜色及块茎支根数是评价参薯种质亲缘关系的重要依据。结论：参薯种内遗
传多样性水平高，研究为山药区分提供了分子生物学依据，也为参薯新品种选育奠定了基础。
［关键词］ 山药；参薯；山薯；褐苞薯蓣；遗传多样性；ＩＳＳＲ
［收稿日期］ ２００９０４０２
［基金项目］ 温州市科技计划项目（Ｎ２００８０００８）；瑞安市科技计划
项目（２００８２０３７）
［通信作者］ 吴志刚，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（０５７７）８８５２６８７６，Ｅｍａｉｌ：ｗｕｚｈｉ
ｇａｎｇ１７７＠１２６ｃｏｍ
山药为薯蓣属 ＤｉｏｓｃｏｒｅａＬ一类重要的药用植
物。２００５年版《中国药典》中山药基原植物规定为
薯蓣ＤｏｐｐｏｓｉｔａＴｈｕｎｂ［１］，药材习称怀山药。但实
际上市场上山药品种多样，除怀山药外，尚有淮山
（方山药）———参薯、广西淮山（广山药、珍薯）———
褐苞薯蓣、广东淮山（广东山药、秤根薯）———山薯，
以上３种在我国南方均有大面积栽培，分别作为浙
江、广西、广东等地的地方习惯山药用［２３］。浙江南
部地区历来有种植山药的传统，为参薯主产区，产区
仍保留利用参薯块茎加工药材的习惯，多年栽培应
用历史，当地百姓又习称为“温州山药”［４５］。目前，
产区参薯、褐苞薯蓣、山薯均有栽培，特别是参薯变
异大，栽培类型多。
ＤＮＡ分子标记技术是研究植物多样性有效手
段。国内外主要是针对山药不同品种之间的遗传差
异性研究［６］，也有利用ＰＣＲ测序技术对山药与广山
药、土山药（日本薯蓣）、方山药的１８ＳｒＲＮＡ基因序列
进行测序的报道［７］。但迄今尚未见参薯ＤＮＡ分子标
记多样性报道。因此，作者采用重复性好、稳定性好
的ＩＳＳＲ标记技术，分析参薯种质遗传多样性，为山药
资源的合理应用及优良品种的选育提供理论依据。
１ 材料与方法
１１ 材料
实验材料为新鲜叶片，２００８年７月分别采于山
药种植基地，样品经－２０℃冷冻与硅胶干燥两种处
理，保存备用。所有样品植物标本均经江苏省中国
科学院植物研究所鉴定，其中采于乐清的１～８号与
采于瑞安的９～１６号样品均被鉴定为参薯 Ｄａｌａｔａ
Ｌ，采于瑞安的 １７号、１８号样品鉴定为褐苞薯蓣
ＤｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓＰｒａｉｎｅｔＢｕｒｋｉｌ，采于瑞安的 １９号、２０
号样品则鉴定为山薯ＤｆｏｒｄｉＰｒａｉｎｅｔＢｕｒｋｉｌ。
１２ 基因组ＤＮＡ提取与ＩＳＳＲ扩增
采用李明军等［８］山药基因组ＤＮＡ的提取方法。
用紫外分光光度计（ＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒＮＤ１０００）检
测ＤＮＡ浓度，１％琼脂糖凝胶电泳检测其大小和完
整性，结果显示提取得到的ＤＮＡ适于ＰＣＲ扩增。
ＩＳＳＲ引物参考哥伦比亚大学生物技术实验室
（ＵＢＣＢＬ）的＃９引物系列，由上海生工生物技术有限
公司合成。反应体系共２５μＬ，其中含基因组 ＤＮＡ
５０ｎｇ，１０×ＰＣＲｂｕｆｅｒ３μＬ，ＭｇＣｌ２５０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１，
ｄＮＴＰｓ４ｍｍｏｌ·Ｌ－１，引物 ０５μｍｏｌ·Ｌ－１，Ｔａｑ酶
１０Ｕ，ｄｄＨ２Ｏ补足２５μＬ。ＰＣＲ反应在ＭＪＰＴＣ２００
ＰＣＲ仪上进行，反应参数为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４
℃变性１ｍｉｎ，５２～５７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１５
ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸 ７ｍｉｎ。反应产物使用
２％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）观察照相并记录结果。
１３ 数据采集与统计分析
选取清晰可辨的电泳条带，以１和０记录条带
的有无，在相同片段位置上有带记为１，无带记为０，
形成０／１矩阵。对于多态性位点，仅在重复实验中
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能稳定出现的差异带用于数据分析。
１４ 聚类分析
采用 Ｎｅｉ＆Ｌｉ遗传相似系数（ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，
ＧＳ）计算各样品之间的遗传相似度，其计算公式为
ＧＳＡＢ＝２Ｎ１１／［（Ｎ１１＋Ｎ０１）＋（Ｎ１１＋Ｎ１０）］，式中 Ｎ１１
表示Ａ和 Ｂ共有的条带，Ｎ１０表示 Ａ有而 Ｂ没有的
条带，Ｎ０１表示Ａ没有而Ｂ有的条带。遗传距离（ｇｅ
ｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ，ＧＤ）ＧＤ＝１ＧＳ。利用 ＮＴＳＹＳｐｃ（ｖｅｒ
ｓｉｏｎ２１０ｅ）分析软件对数据进行分析，采用非加权
配对算术平均法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄａｒｉｔｈ
ｍｅｔｉｃａｖｅｒａｇｅｓ，ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析，构建聚
类图。
２ 结果与分析
２１ ＩＳＳＲ多态性水平
从４１条引物中筛选出 １０条能够扩增出清
晰、稳定条带的 ＩＳＳＲ引物，扩增条带的相对分子
量从２００～１２００ｂｐ不等。共扩增得到１０６条可
区分的 ＤＮＡ条带，每个引物检测到的位点在８～
１５个，平均每条引物可扩增出 １０个条带。在这
１０６条带中，有多态性条带 ９３条，占所观察到的
总扩增带的８７７％，每个引物可扩增出６～１５条
多态性带，平均每条引物产生 ９条多态性条带，
各引物检测到的多态性条带的比例从 ６００％到
１００％（表１）。
表１ ＩＳＳＲ引物序列和多态性分析
引物
碱基序列
（５′３′）
扩增带数
／条
多态性带
／条
多态性率
／％
片段大小
／ｂｐ
ＵＢＣ８０７ （ＡＧ）８Ｔ ９ ９ １００ ２００～１２００
ＵＢＣ８０９ （ＡＧ）８Ｇ １３ １１ ８４．６ ２００～１１００
ＵＢＣ８１７ （ＣＡ）８Ａ １２ ９ ７５．０ １００～７００
ＵＢＣ８２３ （ＴＣ）８Ｃ １０ ９ ９０．０ ２００～１１００
ＵＢＣ８２５ （ＡＣ）８Ｔ １３ １２ ９２．３ ２００～１１００
ＵＢＣ８２６ （ＡＣ）８Ｃ １０ ８ ８０．０ ２００～１１００
ＵＢＣ８２９ （ＴＧ）８Ｃ ８ ８ １００ ２００～１０００
ＵＢＣ８３４ （ＡＧ）８ＹＴ ８ ６ ７５．０ ３００～１１００
ＵＢＣ８４２（ＧＡ）８ＹＧ ８ ６ ７５．０ ３００～８００
ＵＢＣ８４８（ＣＡ）８ＲＧ １５ １５ １００ ３００～１２００
２２ ＩＳＳＲ指纹图谱构建
实验用１０条ＩＳＳＲ引物对２０个样品进行 ＰＣＲ
扩增，建立相应的 ＤＮＡ指纹图谱（图 １）。其中
ＵＢＣ８２３引物对山药习惯用品的 ＤＮＡ基因组扩增
产物的多态性最大。
图１ ＩＳＳＲ引物ＵＢＣ８０９，８２３，８４８对２０个样品
的扩增特征图谱
２３ ＩＳＳＲ聚类分析
计算２０个样品间的遗传相似系数（表２），得到
参薯各样品的遗传相似系数在０６７２９～０９９０７，
其中２号与３号样品间的相似系数最低，为０６７２
９，５与６号，５号与９号以及６号与７号样品之间的
相似系数最高，均为０９９０７；参薯与褐苞薯蓣、山薯
的遗传相似系数分别在 ０４５７９～０５３２７和
０５７０１～０７３８３。结果表明，参薯与褐苞薯蓣、山
薯之间均存在较明显的差异现象，且参薯种内也具
有丰富的遗传多样性。ＵＰＧＭＡ聚类分析，得到树状
图（图２，坐标显示为Ｎｅｉ氏相似系数），从图２可以
看出，参薯１６个样品可划分为４组：第１组含有２
号、１２号样品；第２组为１号样品；第３组含有３号、
１１号、４号、１３号样品；其余９个样品归为第４组。
参薯先与山薯进行聚类，然后再与褐苞薯蓣聚类。
３ 讨论
本实验采用ＩＳＳＲ分子标记技术分析了山药遗
传多样性水平，表明３种薯蓣属植物种间存在差异；
褐苞薯蓣、山薯种内遗传差异小，相似系数均在
０９８以上；参薯作为产区主要的栽培品种，种内遗
传差异显著，１６个样品相似系数在 ０６７２９～
０９９０７。
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表２ ２０个样品的遗传相似系数
Ｎｏ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０
１ １．００００
２ ０．７５７０１．００００
３ ０．７２９００．６７２９１．００００
４ ０．７３８３０．６８２２０．８９７２１．００００
５ ０．８４１１０．７６６４０．７９４４０．７６６４１．００００
６ ０．８３１８０．７７５７０．８０３７０．７７５７０．９９０７１．００００
７ ０．８４１１０．７８５００．７９４４０．７６６４０．９８１３０．９９０７１．００００
８ ０．８５９８０．８０３７０．８１３１０．８４１１０．９０６５０．９１５９０．９２５２１．００００
９ ０．８３１８０．７７５７０．８０３７０．７７５７０．９９０７０．９８１３０．９７２００．９１５９１．００００
１０ ０．８３１８０．７５７００．８２２４０．８６９２０．８９７２０．９０６５０．８９７２０．９５３３０．９０６５１．００００
１１ ０．７７５７０．７００９０．８９７２０．８１３１０．８９７２０．９０６５０．８９７２０．８７８５０．９０６５０．９０６５１．００００
１２ ０．７３８３０．９８１３０．６９１６０．６８２２０．７４７７０．７５７００．７６６４０．７８５００．７５７００．７５７００．７１９６１．００００
１３ ０．７６６４０．７１０３０．８６９２０．９７２００．７９４４０．８０８４０．７９４４０．８６９２０．８０３７０．８９７２０．８４１１０．７１０３１．００００
１４ ０．８３１８０．７５７００．８２２４０．８８７９０．８７８５０．８８７９０．８７８５０．９５３３０．８８７９０．９６２６０．８６９２０．７５７００．９１５９１．００００
１５ ０．８５９８０．７８５００．７９４４０．８４１１０．９０６５０．９１５９０．９２５２０．９８１３０．９１５９０．９７２００．８７８５０．７６６４０．８６９２０．９５３３１．００００
１６ ０．８４１１０．７６６４０．８１３１０．８５９８０．８８７９０．８９７２０．９０６５０．９６２６０．８９７２０．９７２００．８７８５０．７４７７０．８８７９０．９３４６０．９８１３１．００００
１７ ０．４８６００．４８６００．４５７９０．４６７３０．５１４００．５０４７０．５１４００．４９５３０．５２３４０．５０４７０．４６７３０．４６７３０．４７６６０．４６７３０．５１４００．５３２７１．００００
１８ ０．４８６００．４８６００．４５７９０．４６７３０．５１４００．５０４７０．５１４００．４９５３０．５２３４０．５０４７０．４６７３０．４６７３０．４７６６０．４６７３０．５１４００．５３２７１．００００１．００００
１９ ０．７００９０．６４４９０．６１６８０．５７０１０．７２９００．７１９６０．７２９００．７１０３０．７３８３０．６６３６０．６８２２０．６２６２０．５９８１０．６６３６０．６９１６０．６７２９０．５０４７０．５０４７１．００００
２０ ０．６８２２０．６２６２０．６１６８０．５７０１０．７１０３０．７００９０．７１０３０．６９１６０．７１９６０．６６３６０．６８２２０．６２６２０．５９８１０．６６３６０．６７２９０．６５４２０．４８６００．４８６００．９８１３１．００００
ｓｓ参薯；ｓｈｓ山薯；ｓｂｓ褐苞薯蓣。
图２ ２０个样品的ＩＳＳＲ聚类树状图
作者在产区调查发现，参薯栽培类型较多，如幼
苗颜色有红色和绿色之分，地下块茎有姜块状、圆
形、扁球形、圆柱状等形状，块茎断面颜色有白色、淡
紫色、深紫红色等颜色。因此，为尽量反映种内遗传
差异性水平，作者则根据表型差异特征进行随机采
样，同时为保证样品的可靠性，压制样品植物标本鉴
定。本实验对参薯１６个样品进行 ＵＰＧＭＡ聚类，分
为４大组，２号、１２号为Ⅰ组，１号为Ⅱ组，３号、１１
号、４号、１３号为Ⅲ组，其余为Ⅳ组。对照样品原植
物表型特征发现，每组样品聚类均具有明显的表型
一致性。如块茎多支根，圆柱形，断面呈白色聚为Ⅰ
组；幼苗红色，块茎多支根，圆柱形，断面呈淡紫色聚
为Ⅱ组；块茎单支根，扁形或圆柱形，断面呈白色聚
为Ⅲ组；幼苗红色，块茎单支根，扁形或圆柱形，断面
呈深紫红色则聚为Ⅳ组。可见断面颜色及块茎支根
数是参薯样品聚类重要依据，块茎支根数、断面色泽
一致则亲缘关系接近。有关文献［９］则把参薯分为
白圆参薯、白扁参薯、红圆参薯、红扁参薯等４个类
型，本实验ＩＳＳＲ聚类结果与上述分类基本吻合。
ＩＳＳＲ分子标记技术由于其稳定、方便、多态性
丰富等优点，在药用植物遗传多样性及中药材基原
植物鉴定方面应有十分普遍［１０１１］。但 ＩＳＳＲ亦存在
一些缺点，偏重基础研究，与育种实践相结合应用研
究较少。本实验仅采用 ＩＳＳＲ标记技术进行山药习
惯用品遗传多样性探讨，为山药核心种质的构建和
遗传育种奠定基础。
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ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａｂａｓｅｄｏｎＩＳＳＲａｎａｌｙｓｉｓ
ＷＵＺｈｉｇａｎｇ１，ＬＥＮＧＣｈｕｎｈｏｎｇ１，ＴＡＯＺｈｅｎｇｍｉｎｇ１，ＷＥＩＹｕｈｕａｎｇ２，ＪＩＡＮＧＣｈｅｎｇｘｉ１
（ＺｈｅｊｉａｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５００５，Ｃｈｉｎａ；２ＲｕｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＦｏｒｅｓｔｙＢｕｒｅａｕ，
Ｒｕｉａｎ３２５２００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅａｓｓｅｓｓｅｄｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａａｌａｔａ．Ｔｗｅｎｔｙｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｅｘａｍ
ｉｎｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｉｒｏｒｉｇｉｎａｌｐｌａｎｔｓ，ａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ２０ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｄｉｆｅｒ
ｅｎｔｐｌａｎｔｓ，ｓｕｃｈａｓＤ．ａｌａｔａ，Ｄ．ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ，ａｎｄＤ．ｆｏｒｄｉ．ＴｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎＤ．
ａｌａｔａａｎｄＤ．ｐｅｒｓｉｍｉａｓｗｅｌａｓＤ．ｆｏｒｄｉ．ＴｈｅｒｅｗａｓｄｉｓｔｉｎｃｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎＤ．ａｌａｔａ，ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｗａｓｒｅｓｕｌｔｅｄｆｒｏｍ
０．６７２９ｔｏ０．９９０７．ＷｉｔｈＵＰＧＭＡｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，１６ｓａｍｐｌｅｓｏｆＤ．ａｌａｔａｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓ．Ａｆｔｅｒｃｏｍｐａｒｉｎｇｓａｍｐｌｅｓ
ｗｉｔｈｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｐｌａｎｔｓ，ｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｌｏｒａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｕｂｅｒｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒ
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