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Study on total alkaloids content and its influential factors in medicinal materials of Tripterygium

雷公藤药材总生物碱含量及影响因素的研究



全 文 :雷公藤药材总生物碱含量及影响因素的研究
黄文华1,张 蕊1,郭宝林1,斯金平2
(1.中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所,北京 100094;
2.浙江林学院 林业与生物技术学院,浙江 临安 311300)
[摘要] 目的:考察雷公藤药材总生物碱的含量状况及其变化规律。方法:采用有机溶剂提取和氧化铝柱色
谱分离进行样品前处理,紫外分光光度法在268nm波长下测定吸收度。结果与结论:一般韧皮部含量是木质部含
量的2~5倍,二者含量变化呈现一致性。从不同种和类型看,昆明山海棠含量较高,雷公藤F次之,东北雷公藤最
低;但每一类型内,不同居群间差别较小。含量较高的居群均来自雷公藤 F和昆明山海棠,它们是江西遂川、安徽
黄山、浙江景宁和云南昆明。居群内个体间的差别在不同居群中程度有所不同,浙江景宁、福建泰宁、云南昆明等
居群内多样性丰富,有利于优良种质的选择。在同一植株内,药材粗细对总生物碱的含量影响不大。木质部总生
物碱的含量呈现随季节变化的规律,3月含量最高,然后降低,12月降为最低。韧皮部的总生物碱含量变化规律不
明显。
[关键词] 雷公藤;雷公藤F;昆明山海棠;东北雷公藤;总生物碱含量
[中图分类号]S567;R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)01001504
[收稿日期] 20061126
[基金项目] 浙江省自然科学基金项目(Y205031)
[通讯作者] 郭宝林,Tel:(010)62895049,Email:guobaolin010@
yahoo.com.cn
  雷公藤 TripterygiumwilfordiHook.f.系卫矛科
雷公藤属植物,具有抗炎、抗菌、免疫调节、抗肿瘤及
抗生育等多种药理作用,是治疗各种自身免疫性疾
病的首选药物[1]。但雷公藤又具有一定的毒性,治
疗安全范围比较窄,因此,严格控制雷公藤制剂的质
量是当前雷公藤应用最关键的问题,而药材质量的
控制是首要的环节。
本课题组从2002年起开始了雷公藤种质资源
收集和良种选育研究工作,在全国范围内收集了雷
公藤、昆明山海棠T.hypoglaucum(Levl.)Hutch、
东北雷公藤 T.regeliSpragueetTakeda种质资源
20多个居群,200多个个体样本,同时发现了形态
居于雷公藤和昆明山海棠的一种中间类型,暂定名
为雷公藤F,所有种质扦插种植于浙江丽水的种质
资源圃,对种质进行质量评价是项目的重要研究内
容。
目前,对于雷公藤药材及制剂的质量研究,大
多集中在环氧二萜类化合物雷公藤甲素 (triptol
ide),但是,雷公藤中含有大量的生物碱类成分,
主要是倍半萜类生物碱,具有明显的免疫抑制作
用,也是治疗类风湿性关节炎的有效成分,且毒性
小于雷公藤甲素[2,3]。同属植物昆明山海棠含有与
雷公藤极为相似的成分和相近的疗效,应用也比较
广泛。在现有雷公藤制剂中,昆明山海棠片是利用
总生物碱的含量进行质量控制的。因此,测定雷公
藤中总生物碱含量对评价生药质量具有一定的意
义。雷公藤倍半萜类生物碱结构相似,有共同的紫
外吸收特征,本研究参考了现有雷公藤总生物碱的
含量测定方法[47],采用有机溶剂提取和氧化铝柱
色谱分离的样品前处理方法,在268nm波长下测
其吸收度,计算总生物碱含量,比较了药材根的不
同粗细度、同一药材原产地和浙江丽水种植后,以
及种植后2年新生根的不同采收时间的样品,考察
总生物碱的含量变化规律。
1 仪器、材料与试剂
UVVisSpectrometer,Lambda35(PerkinElmer);电
子天平(Satorius)。中性氧化铝(100~200目);甲醇、
醋酸乙酯等试剂均为分析纯;水为自制双蒸水。雷公
藤新碱(euonine)和雷公藤碱戊(wilforidine)对照品为
本课题组从雷公藤中提取得到,经光谱鉴定结构,
HPLC面积归一法测定纯度大于98%。
试验所用雷公藤属3种植物雷公藤、昆明山海
棠、东北雷公藤的来源共包括了9个省的22个市县
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的25个居群,每个居群取2~9个个体,共计116个
样本(统一样品编号)。由于雷公藤根的韧皮部和
木质部所含的成分种类和含量以及所具有的毒性有
较大差别,均将每一个个体样本分为2个部位测定
(木质部编号为1,韧皮部为2),且取粗细基本一致
的根进行分析(根直径在8~12mm)。此外,测定
了同一个体不同的木质部的粗细和韧皮部的厚度的
材料,测定了同一个采集号个体在浙江丽水种植2
年后的新生根的样品,以及种植2年后1个生长年
度内不同季节的样品。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备 精密称取雷公藤粉末
025g,置磨口三角瓶中,加醋酸乙酯25mL,浸泡过
夜(16h),超声提取45min,静置,过中性氧化铝色
谱柱(含25g中性氧化铝,玻璃柱内径10cm),然
后用15mL醋酸乙酯冲洗柱子,合并流出液和洗脱
液,减压回收醋酸乙酯至干,放置过夜后,用甲醇水
(6∶4)溶解并定容至2mL量瓶中,摇匀,过045μm
滤膜,取续滤液,备用。
2.2 测定波长的选择 取雷公藤甲素、雷公藤新
碱、雷公藤碱戊对照液以及供试样品溶液稀释后置
吸收池中,以甲醇水(6∶4)为空白,在200~300nm
波长范围内扫描,生物碱类在2个波长处(225,268
nm)有较高吸收,而雷公藤甲素等二萜内酯类化合
物在219nm附近有最大吸收,为排除该类成分的吸
收干扰,选择268nm为测定波长。供试样品溶液的
紫外吸收图在268nm附近处也有明显的吸收值,故
可用于雷公藤药材中总生物碱的含量测定。
2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取雷公藤新
碱、雷公藤碱戊对照品120,115mg,置1mL量瓶
中,加甲醇水(6∶4)溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,
避光,于4℃冰箱保存。
2.4 标准曲线的制作 精密量取对照液2,5,10,
15,20μL,用甲醇水(6∶4)溶液溶解并稀释至100
μL,混匀。以甲醇水(6∶4)为空白,在268nm波长
处测定各吸光度。以质量浓度(C)对吸光度(A)进
行线性回归,线性方程:新碱 A=360C+00306,
r=09999,线性范围24~240μg·mL-1,碱戊 A=
368C+00266,r=09995,线性范围23~230μg
·mL-1。试验结果表明,总生物碱含量按照雷公藤
新碱或雷公藤碱戊为对照品得到的结果极为接近,
可任选其一,本研究结果按照雷公藤新碱为对照品
进行计算。
2.5 精密度试验 精密吸取雷公藤新碱对照品溶
液10μL,稀释至50μL,连续测定7次,测定吸光
度,RSD025%。
2.6 重复性试验 按2.1项供试样品制备方法处
理7份1512号样品溶液,在室温25℃,测定A值,
计算含量,RSD16%,表明方法重复性良好。
2.7 稳定性试验 取处理好的样品溶液,在室温
25℃,避光放置,于0,2,4,6,8h测定 A值,计算含
量,RSD29%(n=5),表明样品溶液在8h内稳定。
2.8 回收率试验 精密称取 402号样品粉末 5
份,分别加入雷公藤新碱对照品溶液,按2.1项供试
样品制备方法处理样品,测定 A值,计算加样回收
率,平均回收率为986%,RSD26%。
2.9 供试品含量测定 精密量取供试样品液置比
色池中,在268nm下测定吸光度,采用外标法,计算
总生物碱含量,各样品的测定结果见表1~4。
3 讨论与结论
酸碱处理重量法是总生物碱含量测定的常用方
法。雷公藤总生物碱的测定以往也较多使用此
法[46],但其处理步骤繁琐,对于大样本研究较为复
杂。本研究依照文献报道的紫外分光光度测定方
法[7],比较了不同的提取溶剂、不同的氧化铝柱色
谱洗脱溶剂的样品处理方法,并对本实验方法进行
了方法学考察,结果表明本方法用于测定总生物碱
含量是可行的。
从表1中可见,雷公藤药材木质部和韧皮部总
生物碱含量呈正相关,同一样品韧皮部含量一般是
木质部含量的2~5倍。
东北雷公藤中总生物碱含量略低于其他类型,
雷公藤、雷公藤 F和昆明山海棠中,木质部为
012%~078%,韧皮部为057% ~249%。从总
体平均值看,昆明山海棠平均含量(木质部和韧皮
部分别达到 045%和 173%)较高,雷公藤 F
(039%和 122%)次之,雷公藤最低(023%和
096%);雷公藤、昆明山海棠居群间相差小,最高
值与最低值相差约2~3倍,木质部总生物碱质量分
数高的居群为江西遂川077%、安徽黄山058%和
浙江景宁056%,韧皮部总生物碱质量分数高的居
群为江西遂川249%、云南昆明218%和浙江景宁
168%,另外含量较高的居群还有浙江遂昌、庆元、
松阳以及福建泰宁。
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表1 不同类型和居群总生物碱质量分数
样品类型 产地 样本个数
总生物碱均值(范围)/%
木质部 韧皮部
雷公藤 浙江丽水 8 0435(0060~0739) 1130(0573~1310)
  湖北通城 2 0178(0148~0209) 1120(1020~1220)
  浙江苍南 4 0225(0132~0384) 1110(0638~1610)
  浙江乐清 4 0137(0080~0282) 0565(0460~0724)
  浙江义乌 9 0183(0062~0655) 0763(0478~1500)
  浙江云和 4 0202(0061~0481) 0868(0611~1240)
  浙江松阳 2 0297(0169~0425) 1360(0392~2280)
  浙江缙云 5 0223(0107~0327) 0737(0278~1020)
雷公藤F 江西萍乡 3 0439(0316~0671) 0830(0785~0877)
  安徽黄山 3 0579(0292~0960) 1360(0885~1980)
  浙江缙云 2 0119(0103~0136) 1160(1020~1300)
  浙江景宁 13 0562(0220~1540) 1680(0763~2510)
  浙江遂昌 5 0495(0309~0916) 1310(0100~2490)
  浙江庆元 3 0479(0403~0552) 1640(1330~2170)
  浙江武义 5 0242(0173~0283) 1160(0818~1460)
  浙江开化 5 0167(0108~0264) 0806(0296~1350)
  浙江江山 4 0253(0100~0391) 1120(0181~1550)
  浙江松阳 3 0479(0189~0662) 1260(0616~2310)
  福建泰宁 7 0458(0312~0763) 1150(0598~2920)
昆明山海棠 云南昆明 4 0469(0363~0650) 2180(0641~4580)
  湖南新宁 6 0287(0200~0363) 0806(0340~1380)
  贵州雷山 5 0278(0136~0510) 1460(0416~2630)
  江西遂川 3 0777(0505~0932) 2490(0828~4320)
东北雷公藤 吉林通化 4 0178(0110~0305) 0620(0322~1040)
表2 不同粗细根的总生物碱质量分数比较
样品编号 产地 类型
直径
/mm
木质部
/%
皮厚
/mm
韧皮部
/%
10A 浙江丽水 a 38 0684 20 228
10B     11 0699 10 104
10C     5 0663 10 250
24A 浙江景宁 b 20 0782 06 161
24B     6 0654 20 260
24C     3 0617 10 169
90A 浙江景宁 b 35 0726 08 161
90B     125 0795 15 219
90C     5 0777 10 151
107A 福建泰宁 b 32 0588 22 200
107B     11 0458 30 142
107C     75 0768 20 148
163A 贵州雷山 c 44 0656 05 126
163B     19 0611 20 120
163C     12 0577 10 109
   注:a.雷公藤;b.雷公藤 F;c.昆明山海棠;d.东北雷公藤(表
3,4同)
  居群内个体间的差别程度在不同居群间有所不
同,如木质部之间的差别最高值与最低值之间相差约
17~123倍,韧皮部相差11~7倍。因此,针对生
物碱类成分的优良种质的选择可以考虑单株选择。
从表2看出,在同一植株内,不同粗细的主侧根
表3 原产地和栽培2年后样品木质部总生物碱质量分数
编号 产地 类型
木质部/%
种源 3月 6月 9月 12月
19 浙江丽水 a 00880357042102910158
56 浙江丽水 a 03851570044300780075
33 浙江缙云 a 01660696047002580044
50 浙江云和 a 01790421044900740035
54 浙江云和 a 04810213043700740042
58 浙江松阳 a 04250147029201260068
78 浙江义乌 a 02800284032200920062
79 浙江义乌 a 06550438036000510056
24 浙江景宁 b 04810531032203220175
28 浙江景宁 b 05271080040703140299
85 浙江景宁 b 09410987047901920277
93 浙江景宁 b 02650519040801460222
40 浙江江山 b 02610764030902980076
46 浙江开化 b 01370574036802780050
62 浙江遂昌 b 04880544033101610078
95 浙江庆元 b 05520522040800770074
96 浙江庆元 b 04890132037600850038
109 福建泰宁 b 05950246040001240044
113 福建泰宁 b 05580700041000960085
118 福建泰宁 b 07630197032701660372
158 贵州雷山 c 01360570036201490177
  平均     04210547038601640119
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表4 原产地和栽培2年后样品韧皮部总生物碱质量分数
编号 产地 类型
韧皮部/%
种源 3月 6月 9月 12月
19 浙江丽水 a 05731060119007920950
56 浙江丽水 a 11400707184014400228
33 浙江缙云 a 10201670126013000612
50 浙江云和 a 10102270086111000677
54 浙江云和 a 12403150157015100975
58 浙江松阳 a 22801550142017200772
78 浙江义乌 a 07120842157013300937
79 浙江义乌 a 06482060179011600853
24 浙江景宁 b 10802150158020501980
28 浙江景宁 b 19603400186015700646
85 浙江景宁 b 20403070142021901100
93 浙江景宁 b 09881260112008620818
40 浙江江山 b 15501570249020100302
46 浙江开化 b 07011550096913200243
62 浙江遂昌 b 08311300179019000561
95 浙江庆元 b 14202640201015601190
96 浙江庆元 b 08670974162016200410
109 福建泰宁 b 06911070116016100257
113 福建泰宁 b 09561760086423600566
118 福建泰宁 b 29200628215016302220
158 贵州雷山 c 04162710121028502490
  平均     11911780151016100895
未产生总生物碱含量的明显差别,进一步推断药材
的生长年限对于总生物碱含量影响较小。从表3,4
看出,木质部总生物碱含量呈现随季节变化的规律,
3月含量最高,6月、9月、12月逐渐下降,12月降为
最低。统一采收时间的原产地种源(采集时间10~
12月)的总生物碱含量显著高于种植后,影响因素
有待进一步考察,而韧皮部的总生物碱含量变化规
律不明显,但可以初步看出,原来总生物碱含量高的
个体,大多种植后含量也比较高。
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Studyontotalalkaloidscontentanditsinfluentialfactorsinmedicinal
materialsofTripterygium
HUANGWenhua1,ZHANGRui1,GUOBaolin1,SIJinping2
(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege,
Beijing100094,China;
2.SchoolofForestryandBiotechnology,ZhejiangForestryColege,Lin'an311300,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatethetotalalkaloidscontentprofileanddiversityofmedicinalmaterialsofTripterygium.
Method:Thetotalalkaloidswereextractedbyorganicsolventandpurifiedbycolumnchromatography(aluminiumoxide),anddeter
minedbyUVspectrometry.Resultandconclusion:Thetotalalkaloidscontentinphloemwas2to5timesricherthanthatinxylem,and
theirchangeshadshownconcordance.Forthediferentspecies/types,thecontentfromhightolowinorderwasT.hypoglaucum,
TripterygiumF,T.wilfordiandT.regeli,butineachtype,thedisparityamongdiferentpopulations'contentwasverysmal.Thepop
ulationswithhighercontentwereinSuichuan,JiangxiProvince,Huangshan,AnhuiProvince,Jingning,ZhejiangProvinceandKun
ming,YuannanProvince;whichcamefromT.hypoglaucumandTripterygiumF.Thedegreeofdiferenceoftotalalkaloidscontentamong
individualsineachpopulationwasdiferent.Thepopulations,whichhadarichcontentdiversity,wereinJingning,ZhejiangProvince,
Taining,FujianProvinceandKunming,YunnanProvince.Theywilbeusedforgoodgermplasmselecting.Thethicknessofmedicinal
materialsdidnotafectthetotalalkaloidscontentinthesameplant.Thetotalalkaloidscontentinxylemchangedwithseasons:thehigh
estinMarch,thendecliningfromJunetoDecember,thelowestinDecember,Whilethisdidnothappeninphloem.
[Keywords] Tripterygiumwilfordi;TripterygiumF;T.hypoglaucum;T.regeli;totalalkaloidscontent
[责任编辑 张宁宁]
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