全 文 ：!药理!
芍芪多苷对肝纤维化大鼠肝脏星状细胞基质金属
蛋白酶 ) 及组织金属蛋白酶抑制因子 表达的影响
孙妩弋! 桂双英! 吴丽! 王华! 魏伟!
安徽医科大学 临床药理研究所 抗炎免疫药理学省部共建教育部重点实验室
抗炎免疫药物安徽省工程技术研究中心!安徽 合肥 *)$$)*#
$摘要%!目的&研究芍芪多苷!8 I^F对四氯化碳!<&
诱导的肝纤维化大鼠肝组织和转化生长因子
!
!RFH4
!
刺激
的肝星状细胞!Y8<基质金属蛋白酶 )!99E4)&组织金属蛋白酶抑制因子 !R:9E4表达的影响$探讨 8 I^F抗肝纤维
化作用的可能机制) 方法& <&
皮下注射建立大鼠肝纤维化模型$设立正常对照组&模型组&8 I^F给药组!&*g$ ($ %$ /D
.ZD
e
) 放免法检测血清中 :型胶原!<4:水平*9BOO.1 染色对肝脏组织作病理检查*免疫组化法检测肝组织 99E4)$
R:9E4 的表达) 采用XMO@MC1 \S.@探讨 8 I^F体外对RFH4
!
刺激的Y8<99E4)$R:9E4 及<4:表达的影响) 结果&8 I^F可
显著降低纤维化大鼠血清中<4:含量*病理组织学检查发现$8 I^F可降低化学性肝纤维化大鼠的纤维化程度$与模型组相比$
纤维沉积&肝小叶的破坏等均有所减轻) 免疫组化结果显示$8 I^F!($%$ /D.ZDe 可显著升高肝纤维化大鼠肝脏局部
99E4) 水平$降低R:9E4 水平) 进一步研究发现$8 I^F体外可明显抑制RFH4
!
刺激的Y8<4R# R:9E4 表达$促进99E4)
的表达$同时降低<4:的表达水平) 结论&8 I^F可能通过调节肝纤维化大鼠肝组织99E4) 和R:9E4 的异常表达$促进Y8<
99E4) 的表达$抑制R:9E4 的表达$促进胶原降解而发挥抗肝纤维化的作用)
$关键词%!芍芪多苷*肝纤维化*肝星状细胞*转化生长因子4
!

$稿件编号%!*$$7*)$$)
$基金 项 目 % ! 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 ! (#) 项 目
!*$$*33*_)*)*安徽省自然科学基金项目!$7$&)$(*安徽医
科大学博士科研经费资助项目!KV*$$($&
$通信作者%!!魏伟$教授$博士生导师$主要研究方向为抗炎免疫
药理学$RMS# !$#*$($ U4/BNS# ++MN2B?/T,MQT,-1
$作者简介%!孙妩弋$博士$主要从事抗炎免疫药理学研究$RMS#
!$#*$#
!!肝纤维化是大多数慢性肝病所共有的病理特征$
是肝脏细胞外基质!M6@CB-MSTSBC/B@CN6$U<9合成和
降解失衡$导致其过度沉积的结果$也是慢性肝炎进
一步向肝硬化&肝癌发展的重要环节) 肝星状细胞
!?MAB@N-O@MSB@M-MS$Y8<是肝脏U<9的主要来源$
是肝纤维化形成的细胞学基础+, ) 肝脏U<9的代谢
主要由基质金属蛋白酶 !/B@CN6/M@BS.AC.@MN1BOM$
99EO及其抑制因子组织金属蛋白酶抑制因子!@NO4
OTMN1?N\N@.CO.P/M@BS.AC.@MN1BOM$ R:9EO所调节) 研
究肝纤维化的发生及其治疗对策时$需关注基质合成
和降解 *个方面+*, ) 现普遍认为肝纤维化属可逆性
病变) 抗肝纤维化的治疗目前尚无十分理想的药物$
近年来$国内外大量研究工作表明天然药物和中药在
治疗肝纤维化方面显示出可靠的疗效和较少不良反
应的特点$因此$在中医药领域开发高效低毒控制肝
纤维化病情的新药具有重要意义)
芍芪多苷!8 I^F是由均匀设计法优选的白芍
和黄芪抗实验性肝损伤的最佳剂量配比 &i$采用
浸提和纯化技术混合提取制成的质量可控的天然药
物的有效部位) 8 I^F是针对肝纤维化疾病的基本
特点$取黄芪益气活血&健脾$白芍养血柔肝&止痛$
两者配伍$共奏益气活血&养血柔肝之效) 课题组前
期研究表明 8 I^F对四氯化碳诱导的化学性肝损伤
和卡介苗加脂多糖诱导的免疫性肝损伤小鼠均具有
保护作用$且效果优于单独使用白芍总苷&黄芪总皂
苷及白芍&黄芪分别单独提取后再混合制剂!白芍
总苷l黄芪总皂苷$结果提示白芍和黄芪混合提
取效果较好+)4, ) 前期研究表明$8 I^F具有显著的
抗大鼠肝纤维化作用+#, ) 本实验拟从体内&体外 *
个方面探讨 8 I^F对肝纤维化胶原代谢的影响$整
体给药观察 8 I^F对<&
所致大鼠化学性肝纤维化
肝组织中99E4)$R:9E4 蛋白表达的影响*并以转
.%&&.
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*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
化生长因子
!
!@CB1OP.C/N1DDC.+@? PB-@.C
!
$ RFH4
!
刺激的Y8<4R# 为体外细胞模型$在细胞水平上
研究 8 I^F对激活的Y8<胶原合成和代谢的影响$
深入探讨 8 I^F抗肝纤维化的作用机制)
!材料
U!动物与细胞株!8I大鼠$雄性$体重 )$ k
$ D$由安徽医科大学实验动物中心提供) 合格证
号皖医实动准字第 $ 号) 在恒温!** h&光照周
期 * ?=* ?环境中饲养 周后实验) Y8<4R# 细胞
为永生化大鼠肝星状细胞株$由上海肝病中医药研
究所提供)
U!药物与试剂!8 I^F由药材白芍和黄芪按照 &i
$经乙醇回流提取$大孔吸附树脂纯化后得到$主要
含有白芍总苷和黄芪总皂苷$由安徽医科大学临床药
理研究所提供$整体给药前用 $gj羧甲基纤维素钠
配至所需浓度的混悬液*8 I^F体外用药于实验前精
密称取$以少量乙醇溶解后加 YB1ZcO液至 $ D.
`
e
$过滤除菌$用I9U9液稀释至 #$$($$&$$*$$$
/D.`
e
*<&
系上海新中化学试剂厂产品$临用前用
精制花生油稀释*:型胶原!-.SBDM1 @5AM:$<4:放射
免疫分析测定盒!上海海研医学生物技术中心*
RFH4
!
83G<免疫组化染色试剂盒&抗 99E4)
!G3$%&&抗R:9E4 !G3$%多克隆抗体!武汉博
士德生物工程有限公司*抗<4:抗体!司*I9U9培养粉!美国FN\-.公司)
U&!仪器!F` 4*$3全自动高速冷冻离心机!湖南
仪器仪表总厂离心机厂* F<47
7
放射免疫计数
器!中国科学技术大学科技实业总公司*:K4%$ 型
倒置式显微镜!日本 LS5/ATO*电泳仪!美国 GN.4
>BQ* :/BDM4EC.ESTO图像分析管理系统 &g 版
!9MQNB<5\MC1M@N-O公司)
!方法
U!大鼠化学性肝纤维化模型的制备+%,!参照文
献方法$将<&
与高压灭菌精制花生油配成 *gj
油溶液$自造模之日起$除正常组外$其他各组大鼠
按 & /` .ZDe体重背部皮下注射 *gj<&
精制
花生油溶液$每周二&五各 次$连续 ) 周$每周称
重 次$相应调整皮下注射用量)
U!动物分组及处理!将动物按体重分层随机分
为 组) 即正常组&模型组&8 I^F给药组!&*g$
($%$ /D.ZD
e
) 用药方案#造模 & 周后$按 $
/`.ZD
e分别灌胃给予 $gj羧甲基纤维素钠配制
的不同剂量药物$每天 次$连续 7 周$直至实验结
束$正常组和模型组给予等量羧甲基纤维素钠) 末
次给药后 *& ?$股动脉放血处死大鼠$收集血液及组
织标本$进行有关指标的检测)
U&!血清<4:含量的测定!放免法检测血清<4:的
含量$按试剂盒说明书进行)
U_!肝脏病理组织学观察!取各大鼠肝脏左叶$经
$j福尔马林液固定$%$j$($j$7$j$7j$$$j
乙醇脱水$二甲苯透明$石蜡包埋$ M`N-B>9*) 型
切片机作

/切片$常规脱蜡$YU染色$中性树胶
封片) 肝脏标本作胶原纤维的9BOO.1 染色$中性树
胶封片) 上述封片均用LS5/ATOGK$ 显微镜观察$
以及E9$E显微摄像系统照相)
U$!肝脏组织99E4) 和R:9E4 蛋白表达的检测
!采用免疫组化 83G<法进行$

/厚切片脱蜡至
水$)j过氧化氢封闭内源性过氧化物酶的活性$
EG8冲洗 ) 次$每次 /N1$依次滴加 jG83封闭
液$室温封闭 )$ /N1*滴加适当比例稀释的第一抗体
分别为兔抗大鼠 99E4)$R:9E4 抗血清$)% h孵
育 ?后$置 & h过夜$EG8冲洗 ) 次$每次 /N1*第
二抗体为即用型生物素化羊抗兔 :DF血清$)% h孵
育 ?$EG8冲洗 ) 次$每次 /N1*即用型 83G<复
合物$)% h孵育 ?$EG8冲洗 ) 次$每次 /N1) 加
I3G显色$自来水冲洗$脱水$透明$封片) 显微镜
观察) 每组取 ( 张切片$随机选择 个不同视野$采
用:/BDM4EC.ESTO分析软件分析测定蛋白阳性产物
的积分吸光度值$取平均值进行统计分析)
U)!XMO@MC1 \S.@检测 Y8<4R# 99E4)$R:9E4 及
<4:的表达!Y8<4R# 用含 $j;G8 的 I9U9培养
&( ?后$以无血清 I9U9同步化 *& ?$而后分别加
入 RFH4
!
!终浓度 *

D.`
e
&不同质量浓度
8 I^F!$$*$$&$$($$#$ /D.`
e
$同时设细胞对
照$继续培养 # ?$收集细胞$加入 >:E3缓冲液!$
//.S.`
e
;B8I8$* //.S.`
e
UIR3$ $ //.S.`
e
RCNO$ AY
(g$抽提蛋白$H.SN14A?M1.S法蛋白定量$加入上样
缓冲液后$进行 8I84E3FU电泳$$$

D=孔$将蛋白
转移到E[IH膜$丽春红 8 染色$以含 j脱脂奶粉
的EG8封闭 * ?$分别加入B1@N499E)$B1@N4R:9E$
B1@N4<:抗体$& h孵育过夜$EG8 洗膜加入相应的
Y>E标记的 B1@N4CB\\N@:DF$)% h孵育 ) ?$U<` 显
影) 结果采用 :/BDM4EC.ESTO图像分析管理系统分
.(&&.
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!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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VT1M$ *$$
析$以特异性条带平均吸光度与面积的乘积为有效
值$反映蛋白表达水平)
U%!统计学处理!数据以
#
?p&表示$运用
8E88g 软件$多组数据间的比较采用单因素方差
分析!3;L[3)
&!结果
&U!8 I^F对化学性肝纤维化大鼠血清<4:含量的
影响!与正常组相比$<&
诱导的肝纤维化大鼠血
清<4:含量显著升高*与模型组比较$8 I^F!($
%$ /D.ZD
e
能显著降低大鼠升高的血清 <4:水
平) 见图 )
与正常组相比>o$g$*
与模型组相比*>o$g$$)>o$g$)
图 !8 I^F对<&
诱导的化学性肝纤维化
大鼠血清<4:含量的影响!
#
?p&$)f(
&U!8 I^F对化学性肝纤维化大鼠肝脏病理组织
学的影响!9BOO.1染色结果显示$正常组大鼠肝小
叶结构完整$肝细胞索排列整齐$仅见血管壁&胆管
壁有蓝绿着色) 模型组肝脏胶原增生明显$大量的
纤维组织向肝小叶内伸展$并与邻近汇管区及肝静
脉相连$纤维间隔较厚$分割包绕肝实质$形成大小
不一的假小叶*肝细胞脂肪变性$炎性细胞浸润)
8 I^F治疗组炎症细胞浸润明显减少$汇管区及小
叶内&小叶间胶原纤维间隔减少&变细$多数纤维间
隔未分割包绕肝小叶$无假小叶形成*肝细胞脂肪变
性程度减轻$见图 *)
&U&!8 I^F对化学性肝纤维化大鼠肝组织 99E4
)$R:9E4 表达的影响!免疫组化结果表明$正常
大鼠肝脏汇管区及肝实质内均见99E4) 的阳性颗
粒$也可见散在的肝细胞呈阳性颗粒*肝纤维化模型
组阳性染色多集中于纤维间隔&中央静脉周围&肝窦
处的间质细胞胞浆$呈棕黄色$99E4) 表达略有增
加$但与正常组比较差异无显著性*8 I^F给药组$
尤以纤维间隔及肝窦处的间质细胞胞浆棕黄色着色
明显增多$与模型组比较$99E4) 的表达显著升
高) 正常大鼠肝脏 R:9E4 的棕黄色阳性颗粒主要
见于汇管区及血管周围肝细胞胞浆$肝实质内肝细
3,正常组*G,<&
模型组*<,8 I^F%$ /D.ZDe组)
图 *!8 I^F对<&
诱导的肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响!9BOO.1$m*$$
胞散在阳性*肝纤维化模型组汇管区及血管周围肝
细胞阳性$分布于肝细胞胞浆中$纤维带呈阳性$肝
实质内肝细胞亦见弥漫性阳性$其阳性细胞数明显
多于正常组!>o$g$*8 I^F!($%$ /D.ZDe
组R:9E4 呈弱阳性表达) 见表 )
&U_! 8 I^F对 RFH4
!
诱导的 Y8<4R# 99E4)$
R:9E4 和<4:表达的影响!用 :/BDM4EC.ESTO图象
处理系统对XMO@MC1 \S.@图象进行处理$对实验结果
进行半定量分析$并以正常组为基数 $$$计算各实
验组的相对比例) RFH4
!
刺激的 Y8<4R# <4:$
R:9E4 表达明显升高$8 I^F可明显促进 RFH4
!

刺激的Y8<4R# 99E4) 的表达$抑制 R:9E4 的表
达$降低<4:的表达$见图 ))
_!讨论
肝纤维化是一种严重危害人类健康的疾病$其
共同的病理改变是 U<9的过度沉积) <&
诱导的
肝纤维化动物模型是经典的肝纤维化模型$具有简
便易行&造模成功率高$病变典型的优点$被广泛用
于对肝纤维化的研究+%4(, ) 本研究采用 <&
诱导的
大鼠化学性肝纤维化模型$9BOO.1 胶原染色结果显
.7&&.
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VT1M$ *$$
!!
表 !8 I^F对<&
所致肝纤维化大鼠肝脏99E4) 和
R:9E4 表达的影响!
#
?p&$)f(
组别 剂量=/D.ZDe 99E4) R:9E4
正常 e **g#* pg%) *&g7 pg&
模型 e )g7) pg(* ((g*7
p)%g*(

8 I^F &*g
$g7 p#g&%
*
&%g7 p)g*$
(
(*g# p%g%
)
7#g&#
p*(g(
)
%$
7$g) p#g#)
)
()g&
p*#g7
)
!!注#与正常组比较 >o$g$*与模型组比较*>o$g$$)>o
$g$)
,正常细胞**,RFH4
!
!*

D.`
e
刺激 Y8<组*),RFH4
!
l
8 I^F!$ /D.`
e
*&,RFH4
!
l8 I^F!*$ /D.`
e
*,RFH4
!
l8 I^F!&$ /D.`
e
*#,RFH4
!
l8 I^F!($ /D.`
e
*%,
RFH4
!
l8 I^F !#$ /D.`
e
) 与正常细胞相比较 >o
$g$* 与RFH4
!
刺激Y8<组比较*>o$g$$ )>o$g$)
图 )!8 I^F对RFH4
!
诱导的Y8<4R# 细胞
99E4)$R:9E4 和<4:表达的影响
示大鼠胶原纤维延伸连接$纤维间隔向小叶内伸展
形成大小不一纤维包绕$细胞索排列紊乱$纤维间隔
增厚$可见假小叶形成$并有肝细胞脂肪变性$表明
肝纤维化大鼠模型造模成功)
肝纤维化时胶原含量显著提高$以 <4:上升幅
度最大$<4:可作为反映胶原代谢的重要参数+7, )
本实验观察到<&
诱导的肝纤维化大鼠血清<4:水
平显著升高) 8 I^F!($%$ /D.ZDe于造模 & 周
后灌胃$均能显著降低升高的 <4:水平) 9BOO.1 胶
原染色结果显示 8 I^F可以明显降低肝组织的胶原
沉积$减轻肝细胞的脂肪变性等$明显减轻肝组织纤
维化程度$对肝纤维化大鼠显示保护作用)
大量研究表明$在肝纤维化的发生和发展过程
中$肝内过量积聚的 U<9除因 Y8<激活大量产生
外$尚存在降解异常) U<9降解过程主要依赖于
99EO和R:9EO之间的平衡+$, ) 99E4) 是大鼠主
要的间质性胶原酶$在降解肝脏 U<9的主要成分
<4:过程中起重要作用) R:9EO是一种最重要的调
节细胞外 99EO活性的酶家族) R:9EO不但与
99EO酶原以 i 形式相结合抑制它的活化$而且
能灭活活性酶$从而使 99EO失去降解功能) 在大
鼠肝纤维化发生过程中 99E4) 的活性主要受
R:9E4 所抑制+, ) 近年来国内外越来越多的学者
把R:9E4 看作是肝纤维化发生过程中的一个非常
重要的促发因素) 本研究免疫组化检测结果表明$
99E4) 及R:9E4 在正常大鼠肝组织有少量表达$
肝纤维化模型组 99E4) 表达增加不显著$但
R:9E4 表达显著增强$二者平衡被破坏*大量R:9E4
的出现使 99E4) 失去活性$造成肝损伤后增生
的U<9成分降解减少$沉积增多$促进了肝纤维化
的形成$结果与文献报道相吻合+*, ) 而 8 I^F!($
%$ /D.ZD
e
一方面可明显降低肝组织R:9E4 的
表达$同时进一步增强肝组织99E4) 的表达$上调
99E4)=R:9E4) 提示 8 I^F通过调节肝组织
99E4) 和R:9E4 的表达$使 U<9分解加速$进而
发挥抗肝纤维化作用)
Y8<的活化和增殖在肝纤维化的发生&发展过
程中起关键作用$Y8<是肝纤维化时 99EO和
R:9EO主要的细胞来源) 而 RFH4
!
为公认的致肝
纤维化最主要的细胞因子之一$主要通过自分泌和
旁分泌方式参与Y8<的活化&促进U<9的合成&抑
制基质降解来参与肝纤维化发展过程+), ) XMO@MC1
\S.@结果显示$8 I^F!*$$&$$($$#$ /D.`e可显
著降低RFH4
!
刺激的Y8<中<4:的表达水平$还能
增加Y8<99E4) 的表达$抑制R:9E4 的表达) 提
示促进肝纤维化Y8<胶原降解酶99E4)的表达$抑
制其抑制因子R:9E4 的蛋白表达$促进胶原降解可
能是 8 I^F发挥抗肝纤维化作用的机制之一)
综上所述$本研究发现 8 I^F对化学性肝纤维
化模型具有明显的保护作用$ 8 I^F可能通过调节
肝纤维化Y8<99E4)$R:9E4 的异常表达$促进胶
原降解而发挥抗肝纤维化的作用)
.$&.
第 ) 卷第 期
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!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
$参考文献%
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R:9EO +V,,_FBO@C.M1@MC.S$ *$$%$&!#*,
+ ) ,!8T1 X a$ XMNX$ FTN8 a$ M@BS,EC.@M-@NdMMPM-@.PM6@CB-@
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N10TC5N1QT-MQ \5\B-NSTO-BS/M@M4FT CN1 B1Q SNA.A.S5OB--?BCNQM
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MCPN\C.ONON1QT-MQ \5-BC\.1 @M@CB-?S.CNQMN1 CB@O+V,,VU@?1.4
A?BC/B-.S$ *$$%$ *!)# &,
+ % ,!:CMQBSMVE,9.QMSO.PSNdMCPN\C.ONO# U6AS.CN1D@?MQ51B/N-1B4
@TCM.PN1PSB//B@N.1 B1Q CMABNCN1 BO.SNQ .CDB1+V,,VdMO@$ *$$%$%!)#)7,
+ ( ,!8?NY$ I.1D $` GBNa$ M@BS,@M@CB-?S.CNQM4N1QT-MQ SNdMCPN\C.ONON1 CB@O+V,,UTCVE?BC/B-.S$
*$$7$#*)!=)#7,
+ 7 ,!IBO8 J$[BOTQMdB1 I9,FM1MONO.P?MAB@N-PN\C.ONOB1Q N@O\N.4
-?M/N-BS/BCZMCO+V,,8-B1Q V*#$,
+$,!YM//B11 8$ FCBPV$ >.QMCPMSQ 9$ M@BS,U6ACMOON.1 .P99EO
B1Q R:9EON1 SNdMCPN\C.ONO# BO5O@M/B@N-CMdNM++N@? OAM-NBSM/4
A?BONO.1 B1@N4PN\C.@N-O@CB@MDNMO+V,,VYMAB@.S$ *$$%$&#!#
7,
+,!朱跃科$ 王宝恩$ 申凤俊$ 等,肝纤维化过程中胶原&基质金
属蛋白酶及其抑制因子表达的动态变
#
化及相互关系+V,,
中华肝脏病杂志$ *$$&$*!$##*,
+*,!;NM^ Y$ ITB1 F>$ T`.KI$M@BS,U6ACMOON.1 .PR:9E4 B1Q
R:9E4* N1 CB@O+N@? ?MAB@N-PN\C.ONO+V,,X.CSQ VFBO@C.M1@MC.S$
*$$&$$!# (#,
+),!9.CMNCB>J,YMAB@N-O@MSB@M-MSOB1Q SNdMCPN\C.ONO+V,,3C-?
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!99E4) B1Q @NOOTMN1?N\N@.C.P/M@BS.AC.@MN1BOM !R:9E4 N1 -BC\.1 @M@CB-?S.CNQM!<&
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!RFH4
!
NCN@B@MQ ?MAB@N-O@MSB@M-MSO!Y8<$ B1Q @.M6AS.CMN@OA.OON\SM/M-?B1NO/O,/.QMS.P-?M/N-BS?MAB@N-PN\C.ONON1QT-MQ \5<&
+BOACMABCMQ,R?MCB@O+MCMCB1Q./S5QNdNQMQ N1@. DC.TAO$ N1-STQN1D1.C/BS-.14
@C.SDC.TA$ SNdMCPN\C.ONO/.QMSDC.TA B1Q 8 I^F!&*g$ ($ %$ /D.ZD
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