全 文 ：柿叶黄酮类成分的 ＨＰＬＣ指纹图谱研究
刘　军，郎爱东，聂　磊
（山东大学 药学院，山东 济南 ２５００１２）
［收稿日期］　２００６０６０８
［通讯作者］　郎爱东，Ｔｅｌ：（０５３１）８８３８２３３０，Ｅｍａｉｌ：ａｉｄｏｎｇ１＠
ｓｄｕｅｄｕｃｎ
　　柿叶为柿科植物柿树 ＤｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉＬｆ的新
鲜或干燥叶片［１］。研究证明，柿叶中的黄酮类成分
具有抗菌消炎、清热解毒、抗氧化、软化血管等作
用［１３］。目前已有成药应用于临床，主要用于治疗冠
心病、心绞痛、脑动脉硬化、缺血性脑血管病等［４］。
然而，到目前为止，柿叶的质量并无标准可循，早期
文献［５］曾采用分光光度法测定柿叶总黄酮含量。
本研究采用ＲＰＨＰＬＣ对不同产地及品种的柿叶中
黄酮类成分进行了指纹图谱研究，为中药柿叶的筛
选、采收利用及质量评价提供依据。
１　仪器与试药
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪，包括二极管阵列
检测器，四元泵，在线脱气机，柱温箱，自动进样器，
ＬＣ／ＭＳＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ色谱工作站。对照品芦丁（批号
００８０９７０５）、槲皮素（批号１０１９９０５）、山柰酚（批号
１１０８６１２００４０５）均购自中国药品生物制品检定所。
甲醇、乙腈为色谱纯（美国 ＴＥＤＩＡ公司），水为纯净
水，磷酸为色谱纯（天津科密欧公司）。１２批柿叶药
材于２００５年９月～１０月采自各地柿树规模化种植
园（表１），经本院中药室陈永林教授鉴定为柿叶。
表１　柿叶药材样本
样品 产地及品种 采集日期
１ 山东青州水果柿 １０１４
２ 山东青州大萼柿 １０１４
３ 山东青州小鄂柿 １０１４
４ 山东青州贴柿 １０１４
５ 山东青岛四峰柿 １００５
６ 山东青岛牛心柿 １００７
７ 山东临沂盖柿 ０９２５
８ 山西夏县牛心柿９月 ０９１５
９ 山西夏县牛心柿１０月 １０１５
１０ 山东济南牛心柿 ０９１５
１１ 山东济南牛心柿 １０１７
１２ 安徽亳州牛心柿 １０３６
２　方法与结果
２１　色谱条件　ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａ（２）Ｃ１８色
谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）和保护柱；检测波长
３６０ｎｍ；柱温为室温；流速０８ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量
２０μＬ。流动相为乙腈－１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＫＨ２ＰＯ４溶液
二元梯度洗脱，０～２０ｍｉｎ，１３％乙腈，２０～４５ｍｉｎ，
２０％乙腈，４５～６０ｍｉｎ，６０％乙腈，６０～７０ｍｉｎ，１００％
乙腈。色谱图见图１。
图１　对照品和样品的色谱图
Ａ．对照品；Ｂ．柿叶药材；ａ．芦丁；１１．槲皮素；１２．山柰酚
２２　供试品溶液的制备　称取柿叶粉末约５ｇ，置
于索氏提取器中，加入２００ｍＬ石油醚，８０℃回流５
ｈ，用于脱脂及除叶绿素。精密称取脱脂柿叶粉末
１０ｇ于２５ｍＬ具塞锥形瓶中，加入１０００ｍＬ甲醇
水（７５∶２５）的提取溶液，密塞后称重。超声提取４０
ｍｉｎ，放冷，称重，甲醇补足减失质量。摇匀，过０４５
μｍ滤膜，取续滤液进样。
２３　精密度考察　取同一供试品溶液，连续测定６
次，结果６次测定图谱中的１２个共有峰的保留时间
的 ＲＳＤ为 ００５％ ～１７０％，峰面积的 ＲＳＤ为
０４１％～１９９％，证明仪器精密度良好。
２４　稳定性考察　取同一供试品溶液，于０，２，４，８，
１２，１６ｈ测定，计算色谱图中１２个共有峰峰面积的
ＲＳＤ为０４９％ ～１４４％，证明样品在１６ｈ内稳定。
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第３３卷第５期
２００８年３月
　　　　　　　　　
　　　 中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
　　　　　　　
Ｖｏｌ３３，Ｉｓｓｕｅ　５
Ｍａｒｃｈ，２００８
同时计算６次分析所得色谱图相似度大于０９９。
２５　重复性考察　取同一批样品６份，按供试品溶
液的制备方法操作，测定，结果１２个共有峰的保留
时间和峰面积的 ＲＳＤ分别为 ００４％ ～０３５％和
０６６％～１８５％，证明方法的重复性良好。计算６
个样品分析所得色谱图相似度大于０９８，证明分析
方法和提取工艺的稳定性和可靠性。
２６　共有峰的标定　根据１２批样本的ＨＰＬＣ图谱
给出的相关参数，采用药典委推荐的《中药色谱指
纹图谱相似度评价系统２００４１０版》对所有图谱进
行比较（图２），确定１２个峰为共有峰。由于８号峰
的分离度好，无杂质干扰，峰面积较大，且比较稳定，
处于色谱图中间位置，故确定其为参照峰（Ｓ）。１２
个共有峰的峰面积之和占总峰面积的９０％以上，峰
面积的 ＲＳＤ在 ２８０８％ ～７４７３％，相对峰面积的
ＲＳＤ在１１１４％ ～１０２９５％；共有峰的相对保留时
间从 ０５５２～１８３８，相对保留时间的 ＲＳＤ在
０１２％～０８０％。
图２　１２批柿叶样品的ＨＰＬＣ指纹图谱
３　讨论
３１　供试品溶液制备方法的考察　柿叶中含有大
量叶绿素和脂类，所以首先采用索氏提取器进行脱
脂和除叶绿素［２］。为了尽可能完全的提出药材中
的黄酮类成分，比较了不同比例甲醇和水混合溶剂
（从１００％甲醇到６０％甲醇）的提取效果，发现甲醇
水（７５
$
２５）的条件下，色谱图中所有成分的峰面
积较大［６］。对超声和回流法进行比较，由于超声法
操作简单，提取时间短，效果好，故选用该法。将样
品超声３０，４０，５０，６０，７０ｍｉｎ后制样，发现在４０ｍｉｎ
后各峰面积基本不变，故确定７５％甲醇为溶剂超声
提取４０ｍｉｎ制备供试品溶液。
３２　流动相的选择　与甲醇和水作流动相相比，乙
腈和ＫＨ２ＰＯ４溶液作流动相时色谱图基线比较平稳，
色谱峰窄，且柱压较低。因而选定乙腈和 ＫＨ２ＰＯ４
溶液作为流动相。
３３　波长的选择　根据 ＤＡＤＵＶｏｎｌｉｎｅ１９０～４００
ｎｍ扫描发现，所有峰均在３５０～３７０ｎｍ有较大吸收。
由于３６０ｎｍ处为黄酮类成分的特征吸收峰，且基线
平稳，无过多干扰，故选择３６０ｎｍ作为测定波长。
３４　文献［７］报道柿叶中黄酮成分主要为槲皮素、
山柰酚２种苷元及其苷，含量非常丰富。本实验采
用芦丁、槲皮素和山柰酚作为对照品，与样品图谱比
较发现，所采集柿叶药材中芦丁含量很低，槲皮素和
山萘酚含量相对较高。
３５　通过１２批样本的 ＨＰＬＣ图谱发现，不同产地
和品种的柿叶中黄酮成分之间既有相关性，又有区
别。共有色谱峰数目一致，即其中所含化学成分比
较相似；但是由于受产地、品种及采收期等因素的影
响，各色谱峰的相对峰面积相差很大（ＲＳＤ在
１１１４％～１０２９５％），即黄酮类成分的相对含量有
明显差异。１２批药材样本相似度在０７８～０９９，其
中相同产地药材的相似度均大于０９０，不同产地药
材相似度则相对较低。提示在柿叶药材的采集利用
上，要注意产地对药材质量的影响。与直观比较
ＨＰＬＣ图谱不同，用相似度结果来评价药材之间的
差异，能够更确切的了解药材之间差异的程度。
３６　目前柿叶药材的来源有野生和栽培两种，其质
量受产地、采收期、柿树品种的影响较大。本研究建
立了柿叶黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱分析
方法，方法稳定、可靠，重现性好，为柿叶的质量评价
及控制提供了参考依据。
［参考文献］
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［责任编辑　张宁宁］
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Ｍａｒｃｈ，２００８