全 文 ：ＨＰＬＣ电化学检测法用于黄芩苷和黄芩素大鼠
血浆稳定性研究
汪 祺，张玉杰，李维峰，杨 洁，姜 昊，孙万晶
（１．北京中医药大学 中药学院，北京 １００１０２）
［摘要］ 目的：考察黄芩苷（ＢＧ）和黄芩素（Ｂ）在缓冲液及大鼠血浆中的稳定性，建立测定二者在大鼠血浆中
含量的样品处理方法，并初步探讨二者在血浆中稳定性的影响因素。方法：采用 ＨＰＬＣ电化学检测法，分别考察
ＢＧ，Ｂ在不同条件下的稳定性及使二者稳定的条件。结果：ＢＧ，Ｂ在大鼠血浆中较在ｐＨ７４的缓冲液中更不稳定。
在ｐＨ７４缓冲液中加入抗氧化剂可使ＢＧ和Ｂ的稳定性明显提高，剩余百分含量达到１０２％和１００％；在大鼠血浆
中加入抗氧化剂及１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ可使ＢＧ和Ｂ的稳定性明显增加，剩余百分含量可分别达到９８％和１０３％。结
论：ＢＧ和Ｂ在ｐＨ７４缓冲液中的稳定性主要受氧化影响，ＢＧ和Ｂ在血浆中的稳定性不仅与氧化有关，还受血浆
中的内源物质影响，最终确定每１ｍＬ大鼠血浆中加入抗氧剂及１００μＬ１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ为血浆样品的处理条件，此
条件可使样品稳定。
［关键词］ ＨＰＬＣ电化学；黄芩苷；黄芩素；血浆中稳定性
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２２２６７５０４
［收稿日期］ ２００７１０１２
［通讯作者］ 张玉杰，Ｔｅｌ：（０１０）８４７３８６１８，Ｆａｘ：（０１０）８４７３８６
１１，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｙｊ２２７＠１２６．ｃｏｍ
黄芩苷（ｂａｉｃａｌｉｎ，ＢＧ）和黄芩素（ｂａｉｃａｌｅｉｎ，Ｂ）为
中药黄芩的主要成分及体内代谢产物，具有抗菌、抗
病毒、抗炎和抗过敏的药理作用［１２］。已有文献报道
光照、受热、ｐＨ变化及生物环境对二者稳定性均有
影响，除了肝匀浆物中众多生物酶对二者有较强的
作用外，多数反应被认为是自由基介导的氧化还原
反应［３５］，而血浆中的内源性物质是否对黄芩苷、黄
芩素有影响还未见报道。本实验主要通过比较黄芩
苷、黄芩素在ｐＨ７４的缓冲液及大鼠血浆中的稳定
性，探讨测定二者在大鼠血浆中不稳定的影响因素，
并最终确定含量的样品处理方法，为进一步研究黄
芩苷、黄芩素在血浆中的代谢提供实验依据。由于
黄芩苷和黄芩素极易受到生物环境因素影响发生转
化，其在各种生物体液中的浓度较低，为了提高检测
灵敏度而采用ＨＰＬＣ电化学检测。
１ 材料
１．１ 仪器
５６００Ａ型高效液相色谱库仑电化学分析系统
（美国惠泽公司），ＣｏｕｌＡｒａｙ电化学工作站；ＥＲ－
１８２Ａ型分析天平（日本 Ａ＆公司）；ＴＤＬ８０－２Ｂ型
台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。ｐＨＳ－３Ｃ型
酸度计（上海伟业仪器）。
１．２ 药品及试剂
黄芩苷（纯度 ＞９８％，批号７１５９００３）和黄芩素
（纯度＞９８％，批号 １１１５９５２００３０１）对照品购自中
国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯（Ｆｉｓｈ
ｅｒＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．美国），水为超纯水，其他试剂均为
分析纯。
１．３ 动物
清洁级ＳＤ雄性大鼠，体重２５０～３００ｇ，由北京
维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号
ＳＣＸＫ（京）２００７０００１。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件
色谱柱为迪马公司 Ｃ１８钻石柱（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）；检测电位 ＋２５０ｍＶ；柱温为室温；流速
１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；流动相 ＣＨ３ＯＨ与 Ｈ２ＯＴＨＦ３ＰＯ４
（８０∶１０∶０２）等体积混合，其中含００２ｍｏｌ·Ｌ－１的
ＮａＣｌ。
２．２ 检测电势的选择
按上述色谱条件，在 ０～８００ｍＶ进等量黄芩
苷、黄芩素对照品溶液，以二者峰面积响应值高低为
指标筛选最佳电势，发现在施加２５０ｍＶ电势时，黄
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芩苷和黄芩素均有较好的响应，且低电势稳定、重现
性好，故选择２５０ｍＶ为测定电势。
２．３ 溶液的制备
２．３．１ 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、黄芩
素对照品适量，加甲醇溶解制成每１ｍＬ含有黄芩苷
００１４３ｍｇ，黄芩素０００７６０ｍｇ的对照品溶液，以
０２２μｍ微孔滤膜滤过，进样１０μＬ，供ＨＰＬＣ分析，
结果见图１。
Ａ．对照品溶液；Ｂ．空白血浆；Ｃ．黄芩苷样品；
Ｄ．黄芩素样品；１．黄芩苷；２．黄芩素
图１ 对照品溶液和空白血浆的ＨＰＬＣ图
２．３．２ 空白血浆的制备 取雄性ＳＤ大鼠，禁食２４
ｈ（自由饮水），腹腔注射２５％乌拉坦生理盐水溶液
（１８ｇ·ｋｇ－１）麻醉，颈动脉插管取血后用３８％柠
檬酸钠抗凝，４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，分取血浆，
供ＨＰＬＣ分析，结果见图１。
２．４ 方法学考察
２．４．１ 标准曲线的制备 分别精密量取上述黄芩
苷对照品溶液适量，用甲醇稀释得到７１７６，２３６６，
６０８４，０６６３，００９４９ｍｇ·Ｌ－１的系列溶液；分别精
密吸取黄芩素对照品溶液适量，用无水乙醇稀释得
到８７８０，３０２３，１４３９４，０５７８，００４４９ｍｇ·Ｌ－１的
系列溶液，精密吸取上述黄芩苷、黄芩素对照品溶液
各１０μＬ，按上述色谱条件进样分析，测定峰面积。
以峰面积（Ｙ）与标准品质量浓度（Ｃ）进行回归处
理，得直线方程：黄芩苷 Ｙ＝００７６９Ｃ－４×１０－１５
（ｒ＝１），线性范围７１７６～００９４９ｍｇ·Ｌ－１；黄芩素
Ｙ＝０３４７４Ｃ－６×１０－１４（ｒ＝１），线性范围为
８７８０～００４４９ｍｇ·Ｌ－１。
２．４．２ 精密度试验 分别取１４３，１４３，０１４３ｍｇ
·Ｌ－１的黄芩苷对照品溶液，７６，０７６，００７６ｍｇ·
Ｌ－１的黄芩素对照品溶液，于日内及日间重复进样分
析，结果见表１，表明方法的精密度良好。
表１ 黄芩苷和黄芩素的精密度（ｎ＝５）
质量浓度／ｍｇ·Ｌ－１
ＢＧ Ｂ
日内／ＲＳＤ／％
ＢＧ Ｂ
日间／ＲＳＤ／％
ＢＧ Ｂ
１４３ ７６ ２３ ２５７ ２５ ２６７
１４３ ０７６ ２６８ ２８９ ２８ ２９７
０１４３ ００７６ ２９ ３０１ ３１ ３２
２．５ 黄芩苷和黄芩素稳定性试验
本部分实验依次考察黄芩苷、黄芩素在 ｐＨ７４
磷酸盐缓冲液及大鼠血浆中的稳定性，并研究了加
入抗氧化剂及盐酸后对二者稳定性的影响［３］。
２．５．１ 黄芩苷和黄芩素在ｐＨ７４缓冲液中的稳定
性 依照《中国药典》２００５年版附录方法配制磷酸
盐缓冲液（ｐＨ７４）。分别精密称取黄芩苷和黄芩
素对照品适量，用磷酸盐缓冲液配成黄芩苷００１１ｇ
·Ｌ－１，黄芩素００１ｇ·Ｌ－１的溶液，置３７℃恒温振
荡器中，分别于配制后０，０５，１，１５，２，２５ｈ取样
１００μＬ依法测定黄芩苷和黄芩素的含量，以药物不
同时间的剩余百分比表示药物的稳定性情况，其中
药物初始浓度设置为１００％。同时补充１００μＬ的
磷酸盐缓冲液至原体系中。
另称取维生素 Ｃ，其余操作同上，配制成含
０２％ 维生素Ｃ的供试品溶液，于不同时间测定，结
果见图２。
Ａ黄芩苷；Ｂ黄芩素
图２ 黄芩苷、黄芩素在ｐＨ７４缓冲液中的稳定性
２．５．２ 黄芩苷、黄芩素在大鼠血浆中的稳定性 精
密称取黄芩苷适量于２５ｍＬ量瓶，用蒸馏水稀释至
刻度，取１００μＬ加入１９ｍＬ血浆中，使黄芩苷质量
浓度为００１ｇ·Ｌ－１，置于３７℃恒温振荡器中，分别
于配制后０，０５，１，１５，２，２５ｈ取样１００μＬ，同时
补充１００μＬ的空白血浆，立即于取出的样品中加入
５００μＬ甲醇沉淀蛋白，４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，
上清液用０２２μｍ微孔滤膜滤过，进样１０μＬ，进行
ＨＰＬＣ分析（见图１，Ｃ），黄芩苷剩余百分数计算方
法同上。
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精密称取黄芩素对照品适量于２５ｍＬ量瓶，加
入２ｍＬ山梨醇甲酯（１０％体积比）［３］，其他操作同
黄芩苷（见图１，Ｄ）。
另分别设两个黄芩苷和黄芩素对照组，同法制
备，一组加入维生素 Ｃ；另一组加入维生素 Ｃ及 １
ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ１９０μＬ，依法操作，测定，结果见图３。
Ａ黄芩苷；Ｂ黄芩素
图３ 黄芩苷、黄芩素在大鼠血浆中的稳定性
２．６ 方法可行性验证
在上述稳定性考察结果的基础上进行绝对回收
率试验，以验证该方法的可行性。取２．３．２项下空
白血浆０５ｍＬ置２ｍＬ量瓶中，精密加入黄芩苷对
照品溶液使成高、中、低３个浓度的样品，加入维生
素Ｃ及１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ５０μＬ，加甲醇定容至刻度，
４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，取上清液过０２２μｍ微
孔滤膜；同时制备高、中、低３个对应浓度的黄芩苷
对照品溶液，分别进样１０μＬ，连续测定５次，计算
绝对回收率。同法取黄芩素对照品溶液制备血浆样
品测定绝对回收率，结果见表２。
表２ 黄芩苷和黄芩素的绝对回收率（ｎ＝５）
ＢＧ
质量浓度
／ｍｇ·Ｌ－１
绝对回收率
／％
ＲＳＤ
／％
Ｂ
质量浓度
／ｍｇ·Ｌ－１
绝对回收率
／％
ＲＳＤ
／％
１６７２ ８９６ ４３ ８３ ８３６ ６６
１６７２ ９１３ ６２ ０８３ ８７８ ４６
０１６７２ ８０３ ７５ ００８３ ７９４ ７１
３ 讨论
在以往研究的基础上，配制磷酸盐缓冲液用于
模拟大鼠血浆的 ｐＨ环境，发现 ＢＧ，Ｂ在 ｐＨ７４的
磷酸缓冲液中不稳定，３ｈ后浓度分别降为初始浓
度的８９％和４７％；当加入抗氧化剂维生素Ｃ后可明
显提高二者的稳定性，３ｈ后的浓度分别为初始浓
度的１０２％和９９％；证实氧化为二者在此条件下不
稳定的主要原因，抗氧化剂可使黄芩苷、黄芩素在该
环境下稳定，此结果与文献报道一致［４］。ＢＧ，Ｂ在
血浆中不稳定，３ｈ后浓度分别降为初始浓度的
８７％，９％；Ｂ降解非常明显，且 ＢＧ与 Ｂ的降解曲线
不同于二者在ｐＨ７４的磷酸缓冲液中呈现缓慢下
降的趋势，而是在半小时之内迅速下降，之后再缓慢
降低，此动力学特征与酶促反应发生时米氏方程的
动力学特征相符，提示血浆中的内源性物质有可能
影响ＢＧ和Ｂ的稳定性，为了验证这一推测，于血浆
中加入抗氧化剂，３ｈ后浓度分别为９１％和８５％，发
现并没有使二者稳定，于血浆中另外加入１ｍｏｌ·
Ｌ－１ＨＣｌ使蛋白质灭活，用来终止各种酶与ＢＧ，Ｂ的
反应，发现可提高稳定性，抑制降解，３ｈ后的浓度
分别为初始浓度的９７％和１０１％。因此最终确定样
品的稳定条件为每１ｍＬ大鼠血浆中加入抗氧化剂
及１００μＬ１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ，此条件可使样品稳定。
［参考文献］
［１］ 杨 娟，傅军鹏．黄芩活性成分及药效研究近况［Ｊ］．实用医药
杂志，２００４，２１（３）：２７１．
［２］ ＭｉｏｃｉｎｏｖｉｃＲ，ＭｃＣａｂｅＮＰ，ＫｅｃｋＲＷ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ
ｅｆｅｃｔｏｆｂａｉｃａｌｅｉｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ，
２００５，２６：２４１．
［３］ 刘太明，蒋学华．ＨＰＬＣ同时测定肠循环液中黄芩苷、黄芩素和
酚红的浓度［Ｊ］．华西药学杂志，２００５，２０（５）：３９０．
［４］ ＸｉｎｇＪｉｅ，ＣｈｅｎＸｉａｏｙａｎ，ＺｈｏｎｇＤａｆａｎｇ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎｉｎｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌｆｌｕｉｄｓｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄＡｎａｌｙｓｉｓ，２００５，３９：
５９３．
［５］ 姚亚红，张立伟．黄芩素稳定性研究［Ｊ］．光谱实验室，２００６，２３
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ＳｔｕｄｙｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂａｉｃａｌｅｉｎｉｎｍｏｕｓｅｐｌａｓｍａｂｙＨＰＬＣＥＣＤ
ＷＡＮＧＱｉ，ＺＨＡＮＧＹｕｊｉｅ，ＬＩＷｅｉｆｅｎｇ，ＹＡＮＧＪｉｅ，ＪＩＡＮＧＨａｏ，ＳＵＮＷａｎｊｉｎｇ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａｌＭｅｄｉｃａ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂａｉｃａｌｅｉｎｉｎｂｕｆｅｒｅｄａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓａｎｄｍｏｕｓｅｐｌａｓｍａｉｎｏｒ
ｄｅｒｔｏｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｄｉｓｐｏｓｉｎｇｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＨＰＬＣＥＣＤｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｂａｉｃａｌｉｎ
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ａｎｄｂａｉｃａｌｅｉｎｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄｔｈｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇｓａｍｐｌｅｓｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｓｔａｂｉｌｉｚｅｔｈｅｍ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂａｉｃａ
ｌｅｉｎｉｎｔｈｅｂｕｆｅｒｅｄａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｔｐＨ７４ｗａｓｍｏｒｅｓｔａｂｌｅｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｐｌａｓｍａ．ＡｆｔｅｒａｄｄｉｎｇＶｉｔＣｉｎｔｈｅｂｕｆｅｒｅｄａｑｕｅ
ｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂａｉｃａｌｅｉｎｃｏｕｌｄｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｍａｉｎｅｄｐｅｒｃｅｎｔｓｗｅｒｅ１０２％ ａｎｄ１００％．
ＴｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂａｉｃａｌｅｉｎｃｏｕｌｄｂｅｅｎｈａｎｃｅｄｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｐｌａｓｍａｏｎｌｙｗｈｅｎａｄｄｉｎｇＶｉｔＣａｎｄ１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ，
ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅｔｈｅｉｒｒｅｍａｉｎｅｄｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｗａｓｕｐｔｏ９８％ ａｎｄ１０３％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂａｉｃａｌｅｉｎｉｓｒｅｌａｔｅｄｔｏ
ｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｉｔｃａｎｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙａｄｄｉｎｇＶｉｔＣａｎｄ１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌｉｎｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＨＰＬＣＥＣＤ；ｂａｉｃａｌｉｎ；ｂａｉｃａｌｅｉｎ；ｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｐｌａｓｍａ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００８０３１０
［基金项目］ 湖北省科技厅攻关项目（１３０６７２）
［通讯作者］ 杨占秋，Ｔｅｌ：（０２７）６８７５９１３６，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｚｈａｎ
ｑｉｕ＠１６３．ｃｏｍ
表没食子儿茶素没食子酸酯抗流感
病毒作用的研究
肖 潇，杨占秋，石丽桥，刘 婧，陈 文
（武汉大学 医学病毒学研究所 病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 ４３００７１）
［摘要］ 目的：研究表没食子儿茶素没食子酸酯（ＥＧＣＧ）在体内外抗甲型流感病毒的作用。方法：在体外用
ＭＴＴ法检测ＥＧＣＧ对狗肾传代ＭＤＣＫ细胞的毒性浓度，用 ＣＰＥ法观察 ＥＧＣＧ抑制甲型流感病毒的致细胞病变作
用；在体内建立流感病毒感染小鼠模型，通过观察小鼠病死率、生命延长率及肺病变程度指标判定其对小鼠肺炎的
抑制作用和染毒小鼠的死亡保护作用。结果：ＥＧＣＧ在体外能有效抑制甲型流感病毒 ＣＰＥ的产生；口服 ＥＧＣＧ能
减少流感病毒ＡＨ１Ｎ１病毒株感染小鼠的病死率，延长存活时间，减轻小鼠肺组织病变程度。结论：ＥＧＣＧ具有很好
的抗甲型流感病毒的作用，呈剂量效应关系。
［关键词］ ＥＧＣＧ；流感病毒；抗病毒作用
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２２２６７８０５
流感流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引
起的一种急性呼吸道传染病，严重危害人类健康和
生命。每年约有１５％ ～２０％的人群被流感病毒感
染，在美国导致约３６万人死亡，在世界范围内导致
至少５０万人死亡［１］。自发现人流感病毒至今已有
７０余载，在此期间人类流感曾出现３次大流行均在
我国首发。过去的资料表明，新的流感病毒株仍可
能出现在中国［２］。但由于流感病毒容易发生抗原
变异，使疫苗保护作用效果受到一定限制，而使用的
化学药物又有较大的不良反应，因此到目前为止还
没有有效防治流感的方法［３］。为寻找有效的抗流
感病毒中药，作者选用表没食子儿茶素没食子酸酯
（ＥＧＣＧ）抗流感病毒试验，为流感病毒感染的治疗
提供依据。
１ 材料
１．１ 药物
ＥＧＣＧ，纯度 ９５％，购自武汉众一生物有限公
司，美国Ｓｉｇｍａ公司产品（批号Ｅ４１４３）。
１．２ 病毒株
流感病毒 Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６（Ｈ１Ｎ１），由日本
福岛医科大学微生物系锡谷达夫教授惠赠。使用前
在９～１１日龄鸡胚尿囊腔接种传代３～４次，收集尿
囊液，以３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取上清液进行
血凝实验，将血凝滴度大于１∶３２０且细菌培养阴性
的病毒液分装。
流感病毒鼠肺适应株（ＦＭ１，Ｈ１Ｎ１），由大理学
院基础医学部微生物学与免疫学教研室申元英教授
惠赠，血凝滴度为１∶６４０。所有毒种均置 －８０℃保
存备用。
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第３３卷第２２期
２００８年１１月
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