全 文 ：·基础实验研究论著·
甘肃黄芩中提取物黄芩苷元体外抑制假丝酵母菌研究＊
张美玲１，魏莲花２，王宏伟１，张兆芳３，田　洹１
（１．甘肃中医学院附属医院检验科，甘肃兰州７３００２０；２．甘肃省临床检验中心，甘肃兰州７３００００；
３．甘肃中医学院附属医院制剂室，甘肃兰州７３００２０）
　　摘　要：目的　找出甘肃黄芩中提取物黄芩苷元体外抑制假丝酵母菌的抗菌谱。方法　将甘肃黄芩先制成黄芩苷，再用强酸
加热水解，提取其中有效活性成分黄芩苷元，用甲醇溶解，制成黄芩苷元制剂。收集临床分离深部感染假丝酵母菌１３４株，传代
２～３次保持其活力，制成０．５麦氏单位（１×１０６～５×１０６　ＣＦＵ／ｍＬ）菌悬液，将菌悬液接种于沙保弱药物平板上，３５℃培养２４～
４８ｈ，观察被检菌生长情况，找出药物最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。结果　黄芩苷元 ＭＩＣ试验确定，ＭＩＣ分别为：白色假丝酵母菌０．９５６
μｇ／ｍＬ，光滑假丝酵母菌１．０４７μｇ／ｍＬ，热带假丝酵母菌和葡萄牙假丝酵母菌１．１３８μｇ／ｍＬ，克柔假丝酵母菌和丛生丝孢假丝酵
母菌１．４１１μｇ／ｍＬ。结论　黄芩苷元在体外对白色假丝酵母菌抑制效果最好，光滑假丝酵母菌次之，热带假丝酵母菌和葡萄牙假
丝酵母菌较差，克柔假丝酵母菌和丛生丝孢假丝酵母菌最差。
关键词：黄芩苷元；　最低抑菌浓度；　甘肃；　酵母菌
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１３．０７．００８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－４１３０（２０１３）０７－０７８０－０２
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｂａｉｃａｌｅｉｎ　ｉｎ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａｅ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　ｏｎ　ｃａｎｄｉｄａ＊
Ｚｈａｎｇ　Ｍｅｉｌｉｎｇ１，Ｗｅｉ　Ｌｉａｎｈｕａ２，Ｗａｎｇ　Ｈｏｎｇｗｅｉ１，Ｚｈａｎｇ　Ｚｈａｏｆａｎｇ３，Ｔｉａｎ　Ｙｕａｎ１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ，
Ｇａｎｓｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；３．Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｅｅｋ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｂａｉｃａｌｅｉｎ　ｉｎ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａｅ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　ｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ｆｏｒ　Ｃａｎｄｉｄａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｂａｉｃａｌｉｎ　ｉｎ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａｅ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ，ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｓｔｒｏｎｇ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｃｏｎｄｕｃｔ　ｂｙ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｈｙｄｒｏｌ－
ｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｂａｉｃａｌｅｉｎ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａｅ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｂｙ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｔｏ　ｍａｋｅ
ｂａｉｃａｌｅｉｎ　ｒｅａｇｅｎｔ．１３４ｓｔｒａｉｎｓ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｆｒｏｍ　ｄｅｅｐ　ｆｕｎｇａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｃｕｓ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ
ｖｉｔｒｏ　２ｔｏ　３ｔｉｍｅｓ　ｔｏ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｖｉｔａｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｍａｄｅ　ｏｆ　０．５ｗｈｅａｔ′ｓ　ｕｎｉｔ（１×１０６　ｔｏ　５×１０６）ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｐｒｅａｄ　ｏｎ　Ｓａｂｏｕｒａｕｄ　ｄｒｕｇ　ｐｌａｔｅ．Ｕｎｄｅｒ　３５℃，ｔｈｅ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２４ｔｏ　４８ｈｏｕｒｓ，ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｉｔ－
ｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈｅ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）ｏｆ　ｄｒｕｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＭＩＣ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｂａｉｃａｌｅｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ
Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｏｆ　ＭＩＣ　ｗａｓ　０．９５６μｇ／ｍＬ，Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ　ｏｆ　ＭＩＣ　ｗａｓ　１．０４７μｇ／ｍＬ，Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　ａｎｄ　Ｐｏｒｔｕｇａｌ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｏｆ
ＭＩＣ　ｗｅｒｅ　１．１３８μｇ／ｍＬ，Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ　ａｎｄ　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｙｅａｓｔ　ｏｆ　ＭＩＣ　ｗｅｒｅ　１．４１１μｇ／ｍＬ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ｏｆ　ｂａｉｃａｌｅｉｎ　ｏｎ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｗａｓ　ｂｅｓｔ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｗａｓ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ，Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　ａｎｄ　Ｐｏｒｔｕｇａｌ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｗｅｒｅ　ｂａｄ，
Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ　ａｎｄ　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｙｅａｓｔ　ｗｅｒｅ　ｗｏｒｓｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂａｉｃａｌｉｎ；　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；　Ｇａｎｓｕ；　ｙｅａｓｔｓ
　　假丝酵母菌目前已成为临床深部感染真菌中最常见的条
件致病菌之一。黄芩苷元为黄芩苷水解产物，文献报道其具有
抗菌作用。本研究选用了从甘肃黄芩中提取的黄芩苷元进行
体外抑菌实验研究，目的是找出黄芩苷元抗假丝酵母菌的抗菌
谱，为中药治疗临床深部真菌感染提供量化参考标准。
１　材料与方法
１．１　药物来源　甘肃黄芩，本品为唇形科植物、甘肃黄芩的干
燥根和根茎，产自甘肃陇西。
１．２　菌株来源及培养基　１３４株假丝酵母菌是从临床深部真
菌感染患者的标本中分离，由甘肃省临床检验中心微生物实验
室及甘肃中医学院附属医院检验科微生物室提供，２株标准菌
株由甘肃省临床检验中心微生物实验室提供。科玛嘉平板采
用法国ＣＨＲＯＭａｇａｒ公司干粉（郑州博塞生物技术研究所提
供）配制；沙保弱平板采用杭州天和微生物实验有限公司的干
粉配制。
１．３　方法
１．３．１　检测方法　用无菌棉拭子蘸取配制好的菌液，按３个
方向密涂于含有黄芩苷元药物沙保弱平板上，同时做含有甲醇
的空白对照平板，室温静置１５ｍｉｎ待菌液浸透培养基后，将平
板置于真菌培养箱中，３５℃孵育，分别于２４、４８、７２ｈ后观察
结果。
１．３．２　菌液配制　将标准菌株和收集到的病原菌菌株接种于
沙保弱琼脂斜面上，３５℃生长２４～４８ｈ，经２～３次的传种后，
收集幼龄菌，用无菌生理盐水冲洗斜面，调至０．５个麦氏单位。
１．３．３　药物制备　利用甘肃陇西产的黄芩制成黄芩苷，在强
酸、加热条件下不稳定易水解生成黄芩素和葡萄糖醛酸的性
质，建立了由黄芩制备高纯度黄芩素的方法。
１．３．４　培养基制备及贮存　采用琼脂稀释法［１］，培养基为沙
·０８７· 国际检验医学杂志２０１３年４月第３４卷第７期　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ａｐｒｉｌ　２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．７
＊ 基金项目：甘肃省科技攻关计划项目（２ＧＳ０６４－Ａ４３－０２０－２８）。　作者简介：张美玲，女，副主任检验师，主要从事条件致病菌耐药性研究。
保弱琼脂，按厂家规定进行配置时加水量要减少１／１０，以备留
给补充稀释好的药物用，将融化并冷却至５０～５５℃的定量沙
保弱琼脂培养基与浓度为１８．２μｇ／ｍＬ黄芩苷元药物按比例
配置（药物以０．５ｍＬ开始，每次逐增０．０５ｍＬ至０．９ｍＬ；沙
保弱琼脂以９．５ｍＬ开始，每次递减０．０５ｍＬ至９．１ｍＬ），充
分混匀，倾注成平板，即为含有药物浓度递增的培养基。放在
塑料袋内密封，４～８℃中保存。同时制备含有甲醇的空白对
照平板（甲醇以０．５ｍＬ开始，每次逐增０．０５ｍＬ至０．９ｍＬ；
沙保弱琼脂以９．５ｍＬ开始，每次递减０．０５ｍＬ至９．１ｍＬ）。
１．４　结果判断标准　接种幼龄菌于该培养基上，经培养２４、
４８、７２ｈ后观察被检菌的生长情况，抑制真菌生长的最低药物
浓度为该菌最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。
２　结　　果
２．１　药物用量　在深部感染假丝酵母菌中，黄芩苷元对白色
假丝酵母菌抑菌效果最好，药物用量０．５０～０．５５ｍＬ；光滑假丝
酵母菌次之，药物用量０．５５～０．６０ｍＬ；热带假丝酵母菌和葡萄
牙假丝酵母菌较差，药物用量０．６０～０．６５ｍＬ；克柔假丝酵母
菌和丛生丝孢假丝酵母菌最差，药物用量０．７５～０．８０ｍＬ。
２．２　黄芩苷元 ＭＩＣ检测结果　白色假丝酵母菌０．９５６μｇ／
ｍＬ，光滑假丝酵母菌１．０４７μｇ／ｍＬ，热带假丝酵母菌和葡萄牙
假丝酵母菌１．１３８μｇ／ｍＬ，克柔假丝酵母菌和丛生丝孢假丝酵
母菌１．４１１μｇ／ｍＬ；标准菌株 ＭＩＣ为０．９５６μｇ／ｍＬ。
３　讨　　论
假丝酵母菌在自然界广泛分布［２］。在医院假丝酵母菌菌
血症的病死率高达４０％～８０％，深部白色假丝酵母菌感染病
死率为６８．９％［３－４］。本研究选用了从临床深部感染标本中分
离的１３４株假丝酵母菌，其中白色假丝酵母菌６９株（５１．５％），
克柔假丝酵母菌２０株（１４．９％），光滑假丝酵母菌 １６株
（１１．９％），热带假丝酵母菌１１株（８．２％），丛生丝孢假丝酵母
菌１０株（７．５％），葡萄牙假丝酵母菌８株（６．０％），采用 ＭＩＣ
的实验方法进行了体外抑菌观察，目的是观察单味中药黄芩中
有效成分黄芩苷元对假丝酵母菌的抑制效果。
大量文献报道黄芩中有效活性成分是黄酮类化合物，其中
抗假丝酵母菌的有效活性成分是黄芩苷元，体外抗菌实验已经
证明黄芩苷元对皮肤感染假丝酵母菌有很好的抑制作用，另外
黄芩苷元对人大肠癌细胞 ＷｉＤｒ的增殖有抑制作用，能选择性
诱导人白血病Ｋ５６２细胞凋亡［５－９］；黄芩苷元对大鼠心肌缺血
再灌注损伤、对小鼠四氯化碳肝损伤和对大鼠角叉菜胶所致炎
性反应均有保护作用，且评价了浓度为１μｇ／ｍＬ的黄芩甲醇
提取物以及黄芩苷、黄芩苷元和汉黄芩素无细胞毒性［１０－１２］。
本研究选用了深部感染酵母样病原菌菌株１３４株，用ＭＩＣ
方法对黄芩苷元体外抑菌进行了试验观察，发现黄芩苷元对白
色假丝酵母菌抑菌效果最好，证明黄芩中的黄芩苷元对深部感
染假丝酵母菌在体外有较强的抑制作用，为临床找到无不良反
应的抗真菌药物提供依据及思路。
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·１８７·国际检验医学杂志２０１３年４月第３４卷第７期　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ａｐｒｉｌ　２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．７