全 文 :何首乌炮制后新产生成分含量分析
刘振丽1,宋志前1,巢志茂2,吕署一1,王 淳1,李林福1
(1.中国中医科学院 中医基础理论研究所,北京 100700;
2.中国中医科学院 医学实验中心,北京 100700)
[摘要] 目的:分析何首乌炮制后新产生成分2,3二氢3,5二羟基6甲基4氢吡喃4酮(DDMP)和5羟甲
基糠醛(5HMF)的含量随炮制时间的变化以及不同地区市售何首乌生品与炮制品中5HMF含量。方法:采用
HPLC测定,ZorbaxC18色谱柱(39mm×150mm,5μm);流动相甲醇水(10∶90);检测波长280nm;柱温40℃。结
果:在炮制的60h时间内,随炮制时间的延长DDMP的含量逐渐升高,至炮制24h达到最高,随后开始逐渐降低;5
HMF的含量随炮制时间的延长逐渐升高。11个批次制何首乌中5HMF含量为0013% ~0101%,4个批次何首
乌中只有1个批次含有微量5HMF。结论:炮制过程中内部成分处于动态变化,应严格控制和规范何首乌炮制工
艺。
[关键词] 何首乌;炮制;DDMP;5HMF;含量测定
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)20232604
[收稿日期] 20080304
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30472191);国家中医药
管理局项目(04052P64)
[通讯作者] 刘振丽,Tel:(010)640144112503,Email:zhen
li_liu@sina.com.cn
何首乌为蓼科植物何首乌 Polygonummultiflo
rumThunb.的干燥块根,其炮制品为制何首乌。经
炮制后其药性、功用和外形都发生了变化,这种变化
必然与其内在物质基础的变化有关。从何首乌炮制
前后的HPLC图谱分析中,发现炮制后有新的色谱
峰产生[1],经色谱分离和结构鉴定,确定新的色谱
峰显示的2个成分[2]。作者对何首乌炮制过程中产
生的这2种成分的含量随炮制时间的变化进行了研
究,同时对市售的15个批次何首乌生品与炮制品中
5HMF的含量进行了测定,为何首乌质量标准的制
订和工艺规范化提供参考。
1 仪器、材料与试剂
高效液相色谱仪(HP1100,G1322A脱气机,
G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1316A恒温
箱,G1315ADAD检测器,HP化学工作站)。TCQ
-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂);Sartorius
CP225D电子天平;何首乌生品购自广东省德庆县
德城镇药材公司,经北京中医药大学刘春生教授鉴
定。何首乌炮制品为实验室依《中国药典》方法自
制不同炮制时间的豆汁炖品[3]。DDMP对照品、5
HMF对照品为实验室制备,纯度98%以上。甲醇为
色谱纯(美国Fisher公司),水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 ZorbaxC18(39mm×150mm,5
μm)色谱柱,流动相甲醇水(10∶90);流速10mL
·min-1;检测波长280nm;柱温40℃。在此条件
下样品中DDMP和5HMF能达到基线分离。结果
见图1。
A.混合对照品;B.制何首乌;1.DDMP;2.5HMF
图1 制何首乌HPLC图
2.2 对照品溶液的制备和线性关系考察 分别取
DDMP和5HMF对照品,精密称定,加甲醇溶解制
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成每1mL各含02926mg和02008mg的对照品
溶液。
取上述2种对照品溶液等体积混合,得每1mL
分别含DDMP和5HMF各01463mg和01004mg
的混合对照品溶液。对照品溶液低温、避光保存。
分别精密吸取混合对照品溶液1,2,3,4,5μL,
注入液相色谱仪,以测得的峰面积积分值为纵坐标,
进样量为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,
DDMP为Y=-14+710X,r=09999,表明 DDMP
在015~073μg具有良好的线性关系;5HMF为
Y=-75+5910X,r=09999,表明 DDMP在
010~050μg具有良好的线性关系。
2.3 供试品溶液的制备 取何首乌和各制何首乌
饮片粉末(过四号筛)05g,精密称定,置锥形瓶中,
精密加入80%甲醇25mL,称定质量,80℃回流提
取1h,放冷,再称重,用80%甲醇补足减失的质量,
摇匀,滤过。精密吸取续滤液10mL,蒸干,残渣加
水5mL使溶解,摇匀,通过聚酰胺柱(90~120目,
25g,内径15cm,干法装柱),用水25mL洗脱,收
集洗脱液,转移至25mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,
即得。
2.4 精密度试验 精密吸取同一炮制32h的制何
首乌样品溶液重复进样5次,结果 DDMP峰面积积
分值RSD13%,5HMF峰面积积分值RSD20%。
2.5 稳定性试验 取同一炮制32h的制何首乌样
品溶液,分别在制备后0,2,4,6,8,12h进样测定1
次,结果DDMP峰面积积分值RSD23%,5HMF峰
面积积分值RSD16%,表明样品溶液在12h内稳
定性良好。
2.6 重复性试验 精密称取同一炮制32h的制何
首乌样品5份,按供试品溶液制备方法处理,进行含
量测定。结果 DDMP质量分数 RSD24%,5HMF
质量分数RSD28%。
2.7 回收率试验 取含量测定项下已知含量的炮
制32h的制首乌粉末025g6份,精密称定,分别
精密加入DDMP和5HMF对照品,按供试品溶液处
理,进行含量测定,计算。结果 DDMP回收率
983%,RSD25%,5HMF回收率 1017%,RSD
12%。见表1。
2.8 含量测定 各供试品溶液用045μm微孔滤
膜滤过,取续滤液20μL注入液相色谱仪,测定峰面
积,计算样品中含量,结果见表2,3。
表1 2种成分的加样回收率
成分
取样量
/mg
样品中
含量/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
DDMP1) 025321 03173 06272 969 983 25
025734 03224 06272 952
025014 03134 06405 1022
024869 03116 06228 972
025656 03215 06360 983
024837 03112 06316 1001
5HMF2) 02532 01653 03285 1020 1017 12
02573 01680 03328 1030
02501 01633 03248 1009
02487 01624 03243 1012
02566 01675 03275 1000
02484 01622 03270 1030
注:加入量1)03200mg,2)01600mg
表2 DDMP和5HMF质量分数随炮制的变化(n=3)%
t/h DDMP 5HMF
0 - -
8 0127 00038
16 0140 00136
24 0153 00407
32 0125 00653
40 0113 00973
48 0104 01710
60 00751 01280
表3 市售何首乌、制何首乌中5HMF质量分数(n=2)
%
样品 来源 5HMF RSD
制何首乌 安徽巢湖 00130 11
湖北恩施 01010 23
广西桂林 00231 24
山东荣成 00502 041
福建福田 00187 065
北京同仁堂 00980 19
湖南浏阳 00339 12
辽宁大连 00235 13
江西九江 00921 27
山西太原 00428 30
广东德庆 00667 27
何首乌 北京同仁堂 -
湖北恩施 000142 19
四川成都 -
广东德庆 -
3 讨论与结论
实验结果显示(表 2),随炮制时间的延长
DDMP的含量逐渐升高,至炮制24h达到最高,随
后开始随炮制时间的延长而逐渐降低。而 5HMF
随炮制时间的延长含量逐渐升高,与 DDMP呈现不
同的变化趋势。2种成分含量随炮制时间的不同变
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化与它们的结构有关。这 2种成分为麦拉德反应
(Mailardmailardreaction)产物,即单糖与氨基酸或
蛋白质在一定条件下发生化学反应经结构转化产
生[4],DDMP并非反应的最终产物,在不同的温度和
pH条件下它可以继续转化为其他 50多种化学成
分,如5HMF即是其转化成分之一[5],因此表现为
其含量随炮制时间的延长先升高后降低。
DDMP未见从中药中分离得到的相关报道。原
因可能与该成分在硅胶柱、氧化铝柱不稳定有关,而
这2种填料又是中草药化学成分分离中经常采用
的,并且其对热不稳定,如果不是首先在HPLC图谱
分析中发现该成分的存在,并且在整个分离中一直
以此为前导,选择了适当的填料和实验条件进行分
离纯化,可能难以得到单体成分。5HMF从多味中
药如山茱萸[6]、北五味子[7]等中分离得到,另外中
药地黄经炮制后产生的新成分即为 5HMF[8]。中
药复方生脉散合煎剂中分离得到的新成分也为5
HMF[9]。麦拉德反应理论上应广泛存在于中药炮
制和煎煮等加热提取过程,此前对此反应未引起重
视。5HMF在《英国药典》[10]、《中国药典》的蜂
蜜[11]中都有含量限度规定,虽然其相关研究有一定
程度的积累,但还没有公认的结论,尤其是药理作用
还存在争议。是否需要对中药中5HMF含量制订
限度标准还需深入研究。
11个批次市售制何首乌中5HMF质量分数为
0013%~0101%,约相差10倍,反映了制何首乌
饮片质量存在一定差异。全国各地何首乌炮制时间
从3~40h,因此,成分含量的差异除与产地等因素
有关外,还与炮制时间不统一有关。4个批次市售
何首乌中只有1个批次检出微量的5HMF,可能与
贮藏时间长有关。在研究的基础上,可以将5HMF
作为区别何首乌生品与炮制品的指标性成分。
[参考文献]
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的变化[J].中草药,2005,36(11):1622.
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离和结构鉴定[J].中药材,2007,30(12):1519.
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6methyl4(H)pyran4oneintheMailardreaction[J].JAg
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[6] 徐丽珍,李惠颖,田 磊,等.山茱萸化学成分的研究[J].中
草药,1995,26(2):62.
[7] 戴好富,周 俊,彭再刚,等.北五味子的水溶性化学成分
[J].天然产物研究与开发,2001,13(1):24.
[8] 刘美丽,白 玫,白荣枝,等.地黄的炮制研究 I:熟地黄中5
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[M]London:StationeryOfice,2003:2235
[11] 中国药典.一部[S].2005:250.
HPLCdeterminationofchemicalconstituentsproducedinRadix
PolygoniMultifloriafterprocessing
LIUZhenli1,SONGZhiqian1,CHAOZhimao2,LVShuyi1,WANGChun1,LILinfu1
(1.InstituteofChineseMedicineBasicTheory,Beijing100700,China;
2.ExperimentalResearchCenter,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:Toanalysisthechangesoftwochemicalconstituents,namely2,3dihydro3,5dihydroxy6methyl
4Hpyran4one(DDMP)and5hydryoxymethylfurfural(5HMF)producedinRadixPolygoniMultifloriafterprocessing,withpro
cessingtime,andtodeterminethecontentsof5HMFinsamplesofRadixPolygoniMultifloriandRadixPolygoniMultifloripreparata.
Method:AnHPLCmethodwasappliedwithaZobaxSBC18(39mm×150mm,5μm)columnbyaelutionusingmethanolwater
(10∶90)asthemobilephase.ThedetectionwassetatUV280nm.Result:ThecontentsofDDMPwereincreasingwiththeprocess
ingtimeuntil24hour,folowedbyadecreaseuntil60hourprocess.Thecontentsof5HMFwereincreasinggradualythroughoutthe
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60hoursteamingprocess.Thecontentsof5HMFin11samplesofRadixPolygoniMultifloripreparatawerefrom0013% to0101%,
andonlyonein4samplesofRadixPolygoniMultifloricontainingtraceamountof5HMF.Conclusion:Thechemicalcomponentsin
RadixPolygoniMultifloriwerechangedduringtheprocessingprocedures.Therefore,theprocessingofRadixPolygoniMultiflorishould
becontroledandstandardized.
[Keywords] RadixPolygoniMultiflori;precessing;DDMP;5HMF;content
[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20080327
[基金项目] 2005年第二批教育部“春晖计划”科研合作项目
(0052110016)
[通讯作者] 郭兴杰,Tel:(024)23986285,Email:gxjhyz@
yahoo.com.cn
反相 HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中
4种组分含量
张洪飞1,张华燕1,李 燕2,郭兴杰1
(1.沈阳药科大学 药学院,辽宁 沈阳 110016;2.日本国立遗传研究所,静冈县411-8540,日本)
[摘要] 目的:建立反相HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中3,4二羟基苯甲酸甲酯 (Ⅰ)、对香豆酸(Ⅱ)、
阿魏酸(Ⅲ)和反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯(Ⅳ)的含量。方法:采用 DiamonsilTM C18柱(46mm×250mm,5
μm);流动相A乙腈,B甲醇水冰醋酸(5∶95∶025),梯度洗脱:0~20min,1%~16%A;20~42min,16%A;42~46
min,16%~20%A;46~65min,20%A。检测波长265nm;流速10mL·min-1。结果:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ与Ⅳ分别在21~
105(r=09998),35~175(r=09998),172~86(r=09999),40~200mg·L-1(r=10000)线性关系良好,
方法平均回收率分别为999%,979%,986%,981%。结论:方法简便快速、准确度高,可用于白花蛇舌草口服
液中4种组分的同时测定。
[关键词] HPLC;白花蛇舌草;3,4二羟基苯甲酸甲酯;对香豆酸;阿魏酸;反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)20232903
白花蛇舌草 HedyotisdifusaWild.为茜草科植
物白花蛇舌草的干燥全草,广泛分布于亚热带地区,
日本,我国云南、广东、广西、福建、浙江、江苏、安徽
等地均有生长[13]。其味苦、甘,性寒,具有清热解
毒、活血化瘀、消炎止痛之功效。民间常用此药治疗
咽喉肿痛、小便不利等,也可用于癌症的辅助治疗。
成分3,4二羟基苯甲酸甲酯(Ⅰ)为本实验室从白
花蛇舌草中首分,对香豆酸(Ⅱ),阿魏酸(Ⅲ)和反
式6O对香豆酰鸡尿藤苷甲酯(Ⅳ)[46]已有文献报
道。对白花蛇舌草中Ⅱ和Ⅳ2种成分同时进行含量
测定已有文献报道[7],但对白花蛇舌草中Ⅰ和Ⅲ的
含量测定还未见报道。Ⅲ有提高人体的免疫功能及
补血活血的功效[8],Ⅰ具有抗菌活性[9],均为白花
蛇舌草中的活性成分。本研究建立了反相HPLC同
时测定白花蛇舌草口服液中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ的含量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(PU-2080二元梯度泵),MD
-2010二极管阵列检测器(Jasco,日本分光公司);
LC-NETⅡ/ADC色谱工作站(Jasco,日本分光公
司);As3120B超声波振荡器(天津 Autoscience公
司);甲醇、乙腈(色谱纯,天津市康科德科技有限公
司),冰醋酸(分析纯,天津市百世化工有限公司),
重蒸水(自制),对照品Ⅰ(纯度≥991%),Ⅱ(纯
度≥995%)与Ⅳ(纯度≥986%)均由本实验室自
制,Ⅲ(中国药品生物制品检定所,批号 0773
9910)。白花蛇舌草购自市售中药材,由沈阳药科
大学药用植物教研室孙启时教授鉴定,白花蛇舌草
口服液(批号20071105,20071110,20071116)自制。
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