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HPLC determination of chemical constituents produced in Radix
Polygoni Multiflori after processing

何首乌炮制后新产生成分含量分析



全 文 :何首乌炮制后新产生成分含量分析
刘振丽1,宋志前1,巢志茂2,吕署一1,王 淳1,李林福1
(1.中国中医科学院 中医基础理论研究所,北京 100700;
2.中国中医科学院 医学实验中心,北京 100700)
[摘要] 目的:分析何首乌炮制后新产生成分2,3二氢3,5二羟基6甲基4氢吡喃4酮(DDMP)和5羟甲
基糠醛(5HMF)的含量随炮制时间的变化以及不同地区市售何首乌生品与炮制品中5HMF含量。方法:采用
HPLC测定,ZorbaxC18色谱柱(39mm×150mm,5μm);流动相甲醇水(10∶90);检测波长280nm;柱温40℃。结
果:在炮制的60h时间内,随炮制时间的延长DDMP的含量逐渐升高,至炮制24h达到最高,随后开始逐渐降低;5
HMF的含量随炮制时间的延长逐渐升高。11个批次制何首乌中5HMF含量为0013% ~0101%,4个批次何首
乌中只有1个批次含有微量5HMF。结论:炮制过程中内部成分处于动态变化,应严格控制和规范何首乌炮制工
艺。
[关键词] 何首乌;炮制;DDMP;5HMF;含量测定
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)20232604
[收稿日期] 20080304
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30472191);国家中医药
管理局项目(04052P64)
[通讯作者] 刘振丽,Tel:(010)640144112503,Email:zhen
li_liu@sina.com.cn
  何首乌为蓼科植物何首乌 Polygonummultiflo
rumThunb.的干燥块根,其炮制品为制何首乌。经
炮制后其药性、功用和外形都发生了变化,这种变化
必然与其内在物质基础的变化有关。从何首乌炮制
前后的HPLC图谱分析中,发现炮制后有新的色谱
峰产生[1],经色谱分离和结构鉴定,确定新的色谱
峰显示的2个成分[2]。作者对何首乌炮制过程中产
生的这2种成分的含量随炮制时间的变化进行了研
究,同时对市售的15个批次何首乌生品与炮制品中
5HMF的含量进行了测定,为何首乌质量标准的制
订和工艺规范化提供参考。
1 仪器、材料与试剂
高效液相色谱仪(HP1100,G1322A脱气机,
G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1316A恒温
箱,G1315ADAD检测器,HP化学工作站)。TCQ
-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂);Sartorius
CP225D电子天平;何首乌生品购自广东省德庆县
德城镇药材公司,经北京中医药大学刘春生教授鉴
定。何首乌炮制品为实验室依《中国药典》方法自
制不同炮制时间的豆汁炖品[3]。DDMP对照品、5
HMF对照品为实验室制备,纯度98%以上。甲醇为
色谱纯(美国Fisher公司),水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 ZorbaxC18(39mm×150mm,5
μm)色谱柱,流动相甲醇水(10∶90);流速10mL
·min-1;检测波长280nm;柱温40℃。在此条件
下样品中DDMP和5HMF能达到基线分离。结果
见图1。
A.混合对照品;B.制何首乌;1.DDMP;2.5HMF
图1 制何首乌HPLC图
2.2 对照品溶液的制备和线性关系考察 分别取
DDMP和5HMF对照品,精密称定,加甲醇溶解制
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成每1mL各含02926mg和02008mg的对照品
溶液。
取上述2种对照品溶液等体积混合,得每1mL
分别含DDMP和5HMF各01463mg和01004mg
的混合对照品溶液。对照品溶液低温、避光保存。
分别精密吸取混合对照品溶液1,2,3,4,5μL,
注入液相色谱仪,以测得的峰面积积分值为纵坐标,
进样量为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,
DDMP为Y=-14+710X,r=09999,表明 DDMP
在015~073μg具有良好的线性关系;5HMF为
Y=-75+5910X,r=09999,表明 DDMP在
010~050μg具有良好的线性关系。
2.3 供试品溶液的制备 取何首乌和各制何首乌
饮片粉末(过四号筛)05g,精密称定,置锥形瓶中,
精密加入80%甲醇25mL,称定质量,80℃回流提
取1h,放冷,再称重,用80%甲醇补足减失的质量,
摇匀,滤过。精密吸取续滤液10mL,蒸干,残渣加
水5mL使溶解,摇匀,通过聚酰胺柱(90~120目,
25g,内径15cm,干法装柱),用水25mL洗脱,收
集洗脱液,转移至25mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,
即得。
2.4 精密度试验 精密吸取同一炮制32h的制何
首乌样品溶液重复进样5次,结果 DDMP峰面积积
分值RSD13%,5HMF峰面积积分值RSD20%。
2.5 稳定性试验 取同一炮制32h的制何首乌样
品溶液,分别在制备后0,2,4,6,8,12h进样测定1
次,结果DDMP峰面积积分值RSD23%,5HMF峰
面积积分值RSD16%,表明样品溶液在12h内稳
定性良好。
2.6 重复性试验 精密称取同一炮制32h的制何
首乌样品5份,按供试品溶液制备方法处理,进行含
量测定。结果 DDMP质量分数 RSD24%,5HMF
质量分数RSD28%。
2.7 回收率试验 取含量测定项下已知含量的炮
制32h的制首乌粉末025g6份,精密称定,分别
精密加入DDMP和5HMF对照品,按供试品溶液处
理,进行含量测定,计算。结果 DDMP回收率
983%,RSD25%,5HMF回收率 1017%,RSD
12%。见表1。
2.8 含量测定 各供试品溶液用045μm微孔滤
膜滤过,取续滤液20μL注入液相色谱仪,测定峰面
积,计算样品中含量,结果见表2,3。
表1 2种成分的加样回收率
成分
取样量
/mg
样品中
含量/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
DDMP1) 025321 03173 06272 969 983 25
  025734 03224 06272 952    
  025014 03134 06405 1022    
  024869 03116 06228 972    
  025656 03215 06360 983    
  024837 03112 06316 1001    
5HMF2) 02532 01653 03285 1020 1017 12
  02573 01680 03328 1030    
  02501 01633 03248 1009    
  02487 01624 03243 1012    
  02566 01675 03275 1000    
  02484 01622 03270 1030    
  注:加入量1)03200mg,2)01600mg
表2 DDMP和5HMF质量分数随炮制的变化(n=3)%
t/h DDMP 5HMF
0 - -
8 0127 00038
16 0140 00136
24 0153 00407
32 0125 00653
40 0113 00973
48 0104 01710
60 00751 01280
表3 市售何首乌、制何首乌中5HMF质量分数(n=2)
% 
样品 来源 5HMF RSD
制何首乌 安徽巢湖  00130 11
  湖北恩施  01010 23
  广西桂林  00231 24
  山东荣成  00502 041
  福建福田  00187 065
  北京同仁堂 00980 19
  湖南浏阳  00339 12
  辽宁大连  00235 13
  江西九江  00921 27
  山西太原  00428 30
  广东德庆  00667 27
何首乌  北京同仁堂 -  
  湖北恩施  000142 19
  四川成都  -  
  广东德庆  -  
3 讨论与结论
实验结果显示(表 2),随炮制时间的延长
DDMP的含量逐渐升高,至炮制24h达到最高,随
后开始随炮制时间的延长而逐渐降低。而 5HMF
随炮制时间的延长含量逐渐升高,与 DDMP呈现不
同的变化趋势。2种成分含量随炮制时间的不同变
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化与它们的结构有关。这 2种成分为麦拉德反应
(Mailardmailardreaction)产物,即单糖与氨基酸或
蛋白质在一定条件下发生化学反应经结构转化产
生[4],DDMP并非反应的最终产物,在不同的温度和
pH条件下它可以继续转化为其他 50多种化学成
分,如5HMF即是其转化成分之一[5],因此表现为
其含量随炮制时间的延长先升高后降低。
DDMP未见从中药中分离得到的相关报道。原
因可能与该成分在硅胶柱、氧化铝柱不稳定有关,而
这2种填料又是中草药化学成分分离中经常采用
的,并且其对热不稳定,如果不是首先在HPLC图谱
分析中发现该成分的存在,并且在整个分离中一直
以此为前导,选择了适当的填料和实验条件进行分
离纯化,可能难以得到单体成分。5HMF从多味中
药如山茱萸[6]、北五味子[7]等中分离得到,另外中
药地黄经炮制后产生的新成分即为 5HMF[8]。中
药复方生脉散合煎剂中分离得到的新成分也为5
HMF[9]。麦拉德反应理论上应广泛存在于中药炮
制和煎煮等加热提取过程,此前对此反应未引起重
视。5HMF在《英国药典》[10]、《中国药典》的蜂
蜜[11]中都有含量限度规定,虽然其相关研究有一定
程度的积累,但还没有公认的结论,尤其是药理作用
还存在争议。是否需要对中药中5HMF含量制订
限度标准还需深入研究。
11个批次市售制何首乌中5HMF质量分数为
0013%~0101%,约相差10倍,反映了制何首乌
饮片质量存在一定差异。全国各地何首乌炮制时间
从3~40h,因此,成分含量的差异除与产地等因素
有关外,还与炮制时间不统一有关。4个批次市售
何首乌中只有1个批次检出微量的5HMF,可能与
贮藏时间长有关。在研究的基础上,可以将5HMF
作为区别何首乌生品与炮制品的指标性成分。
[参考文献]
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[M]London:StationeryOfice,2003:2235
[11] 中国药典.一部[S].2005:250.
HPLCdeterminationofchemicalconstituentsproducedinRadix
PolygoniMultifloriafterprocessing
LIUZhenli1,SONGZhiqian1,CHAOZhimao2,LVShuyi1,WANGChun1,LILinfu1
(1.InstituteofChineseMedicineBasicTheory,Beijing100700,China;
2.ExperimentalResearchCenter,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:Toanalysisthechangesoftwochemicalconstituents,namely2,3dihydro3,5dihydroxy6methyl
4Hpyran4one(DDMP)and5hydryoxymethylfurfural(5HMF)producedinRadixPolygoniMultifloriafterprocessing,withpro
cessingtime,andtodeterminethecontentsof5HMFinsamplesofRadixPolygoniMultifloriandRadixPolygoniMultifloripreparata.
Method:AnHPLCmethodwasappliedwithaZobaxSBC18(39mm×150mm,5μm)columnbyaelutionusingmethanolwater
(10∶90)asthemobilephase.ThedetectionwassetatUV280nm.Result:ThecontentsofDDMPwereincreasingwiththeprocess
ingtimeuntil24hour,folowedbyadecreaseuntil60hourprocess.Thecontentsof5HMFwereincreasinggradualythroughoutthe
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60hoursteamingprocess.Thecontentsof5HMFin11samplesofRadixPolygoniMultifloripreparatawerefrom0013% to0101%,
andonlyonein4samplesofRadixPolygoniMultifloricontainingtraceamountof5HMF.Conclusion:Thechemicalcomponentsin
RadixPolygoniMultifloriwerechangedduringtheprocessingprocedures.Therefore,theprocessingofRadixPolygoniMultiflorishould
becontroledandstandardized.
[Keywords] RadixPolygoniMultiflori;precessing;DDMP;5HMF;content
[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20080327
[基金项目] 2005年第二批教育部“春晖计划”科研合作项目
(0052110016)
[通讯作者] 郭兴杰,Tel:(024)23986285,Email:gxjhyz@
yahoo.com.cn
反相 HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中
4种组分含量
张洪飞1,张华燕1,李 燕2,郭兴杰1
(1.沈阳药科大学 药学院,辽宁 沈阳 110016;2.日本国立遗传研究所,静冈县411-8540,日本)
[摘要] 目的:建立反相HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中3,4二羟基苯甲酸甲酯 (Ⅰ)、对香豆酸(Ⅱ)、
阿魏酸(Ⅲ)和反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯(Ⅳ)的含量。方法:采用 DiamonsilTM C18柱(46mm×250mm,5
μm);流动相A乙腈,B甲醇水冰醋酸(5∶95∶025),梯度洗脱:0~20min,1%~16%A;20~42min,16%A;42~46
min,16%~20%A;46~65min,20%A。检测波长265nm;流速10mL·min-1。结果:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ与Ⅳ分别在21~
105(r=09998),35~175(r=09998),172~86(r=09999),40~200mg·L-1(r=10000)线性关系良好,
方法平均回收率分别为999%,979%,986%,981%。结论:方法简便快速、准确度高,可用于白花蛇舌草口服
液中4种组分的同时测定。
[关键词] HPLC;白花蛇舌草;3,4二羟基苯甲酸甲酯;对香豆酸;阿魏酸;反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)20232903
  白花蛇舌草 HedyotisdifusaWild.为茜草科植
物白花蛇舌草的干燥全草,广泛分布于亚热带地区,
日本,我国云南、广东、广西、福建、浙江、江苏、安徽
等地均有生长[13]。其味苦、甘,性寒,具有清热解
毒、活血化瘀、消炎止痛之功效。民间常用此药治疗
咽喉肿痛、小便不利等,也可用于癌症的辅助治疗。
成分3,4二羟基苯甲酸甲酯(Ⅰ)为本实验室从白
花蛇舌草中首分,对香豆酸(Ⅱ),阿魏酸(Ⅲ)和反
式6O对香豆酰鸡尿藤苷甲酯(Ⅳ)[46]已有文献报
道。对白花蛇舌草中Ⅱ和Ⅳ2种成分同时进行含量
测定已有文献报道[7],但对白花蛇舌草中Ⅰ和Ⅲ的
含量测定还未见报道。Ⅲ有提高人体的免疫功能及
补血活血的功效[8],Ⅰ具有抗菌活性[9],均为白花
蛇舌草中的活性成分。本研究建立了反相HPLC同
时测定白花蛇舌草口服液中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ的含量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(PU-2080二元梯度泵),MD
-2010二极管阵列检测器(Jasco,日本分光公司);
LC-NETⅡ/ADC色谱工作站(Jasco,日本分光公
司);As3120B超声波振荡器(天津 Autoscience公
司);甲醇、乙腈(色谱纯,天津市康科德科技有限公
司),冰醋酸(分析纯,天津市百世化工有限公司),
重蒸水(自制),对照品Ⅰ(纯度≥991%),Ⅱ(纯
度≥995%)与Ⅳ(纯度≥986%)均由本实验室自
制,Ⅲ(中国药品生物制品检定所,批号 0773
9910)。白花蛇舌草购自市售中药材,由沈阳药科
大学药用植物教研室孙启时教授鉴定,白花蛇舌草
口服液(批号20071105,20071110,20071116)自制。
2 方法
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