全 文 :菟丝子水提物对人精子顶体和超微结构的保护作用
杨 欣,丁彩飞,张永华,颜志中,杜 静
(浙江省中西医结合医院,浙江 杭州 310003)
[摘要] 目的:观察菟丝子水提物对活性氧(ROS)所致人精子顶体和超微结构的氧化损伤的保护作用,探讨菟
丝子治疗男性不育弱精子症的作用机制。方法:采用Percol梯度离心法优选具有正常生理功能的精子作为正常精
子模型,将精子悬液分为正常组,模型组,阳性药对照组(维生素 C组)和菟丝子小、中、大剂量组。应用次黄嘌呤
黄嘌呤氧化酶(HXXO)体系产生活性氧,在有氧环境下,ROS、不同含量(0125,025,05g·mL-1)的菟丝子水提物与
精子悬液共同孵育后,计算精子顶体完整率,透射电镜观察精子顶体和超微结构,并与已知的抗氧化剂维生素 C对
照。结果:终含量0125,05g·mL-1的菟丝子水提物对精子顶体和超微结构的保护作用与维生素C(025mg·mL-1)
无明显差别(P均>005),025g·mL-1的菟丝子水提物的作用明显优于维生素C(P<0001)。结论:适宜含量的菟
丝子水提物对ROS造成的精子膜、顶体结构和精子线粒体功能损伤具有明显的保护作用。
[关键词] 菟丝子;活性氧;精子;顶体;超微结构;脂质过氧化作用
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)05042204
[收稿日期] 20050210
[基金项目] 浙江省中医药科研基金项目(2003C070)
[通讯作者] 杨欣,Tel:(0571)81889300,Email:hzxyang@
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世界卫生组织规定把精子顶体反应率,精子膜
功能完整性作为评价精子受精功能的重要指标[1]。
通过特殊染色或电镜确定精子顶体的完整性是判断
精子生育能力很有价值的一种方法[2]。有文献报
道[3],活性氧类(reactiveoxygenspecies,ROS)可致精
子膜、顶体和线粒体的超微结构改变,损害精子功
能。菟丝子功能补阳益阴,固精缩尿,具有抗氧化作
用[4],是治疗男性不育症弱精子症的常用药物。本
实验应用透射电镜观察 ROS对人精子顶体和超微
结构的过氧化损伤及菟丝子水提物的保护作用,为
菟丝子治疗男性不育弱精子症提供实验依据。维生
素C是水溶性的ROS高效清除剂,还具有还原剂的
性质,在细胞内外起着重要的清除氧自由基和抗脂
质过氧化作用。因此本实验以其为对照药。
1 材料和方法
11 仪器与试剂
111 仪器
WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(配有
恒温装置),北京伟力新世纪科技发展有限公司;
MACRO精子计数盘,南京源程科技公司;2K15C11
加热型冷冻高速台式离心机,德国 Sigma公司;FOR
MA-3111水套式二氧化碳细胞培养箱,美国热电公
司;D-SCr420可调硅控温三用水箱,上海锦昱科学
仪器有限公司;AB-204-N电子天平,瑞士;XH-B
型旋涡混匀器,江苏姜堰市康健医疗器具有限公司;
JEM-1200EX透射电镜,日本JEOL公司。
112 试剂及其配制
Percol液,Sigma公司,批号 P7828;10×Earle’s
液,Sigma公司,批号 E7510;1×Earle’s液,Sigma公
司,批号 E7883;次黄嘌呤(hypoxanthine),Sigma公
司,批号 X1882;黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase),
Sigma公司,批号 X1875;维生素 C/抗坏血酸(vita
minC/ascorbicacid),Sigma公司,批号 A7506;瑞姬
(WrightGiemsa’s)氏染液,南京欣迪生物技术有限公
司,批号A1029。
90%和45%Percol液的制备[5]:10×Earle’s液
1mL与 Percol9mL混匀,从中取出 075mL舍去,
再加入 075mL超纯水,即成为渗透浓度为 280
mmol·L-1的 90%Percol液。90%Percol液 5mL与
1×Earle’s液 5mL混匀,即为配制好的 45%Percol
液。
12 正常精子模型制备
25~35岁的健康且有生育能力的自愿供精者
15名,禁欲3~5d,手淫留取精液于无菌容器,经计
算机辅助精子分析(computeraidedspermanalysis,
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CASA)系统常规分析,精子密度 >60×106·mL-1,a
级精子>25%,a+b级精子>50%,正常形态精子>
60%,WBC<1×106·mL-1。采用 Percol梯度离心法
制备具有正常生理功能的精子作为实验模型。具体
操作如下[5]:在 14mL离心管中先加入 2mL90%
Percol,在其上层轻缓加入2mL45%Percol,然后在
45%Percol的上层轻缓加入 2mL已液化的精液;
300r·min-1离心 20min;吸去精液层和 45%Percol
层,将90%Percol层与4mL的Earle’s液混匀,300r
·min-1离心 10min;弃上清,沉淀用适量 Earle’s混
悬,并调精子密度为20×106·mL-1。
13 药物及其制备
131 来源、鉴定
菟丝子购自浙江医药股份有限公司,经本院杜
静副主任药师鉴定为旋花科植物菟丝子 Cuscuta
chinensisLam的干燥成熟种子,产自山东济南。
132 药物制备
取菟丝子若干克加10倍量双蒸水浸泡30min,
武火煮沸,文火再煮 30min,滤布过滤,滤渣再加 5
倍量水同上法再处理2次,各煮沸30,15min,合并3
次滤液,用聚乙烯微孔滤管在减压下过滤,除去煎出
液中的悬浮粒子,滤液于 70~80℃水浴中浓缩至
05g·mL-1(每1mL药液相当于 05g生药量),冷
藏备用。
133 固体物质含量测定
菟丝子水提取液 20mL,置恒重的称量瓶中,
于120℃电热恒温干燥箱中干燥3h,使溶液缓慢挥
发,直到其中的固体成分完全干燥为止,准确称量。
平行作2次,取平均值,以每毫升水提取液中含提取
固体物克数表示。溶液的固含量可用下式计算:
固含量(%)=干燥后固体的重量/溶液的总重量 ×
100%
14 方法
141 分组
将精子悬液分为 6组:正常组,PBS缓冲液(pH
74);模型组,次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶(HXXO,HX
终浓度为1mmol·L-1,XO终含量为50mU·mL-1);
维生素C(终含量为025mg·mL-1)+HXXO(终含
量同模型组);菟丝子小、中、大剂量组,菟丝子水提
物(终含量分别为0125,025,05mg·mL-1)+HX
XO(终含量同模型组);各组样本置37℃,5%CO2培
养箱中孵育1~2h。
142 观察指标及方法
1421 精子顶体完整率 各组精子悬液孵育2h
后,取样5μL涂片,95%乙醇固定10min,自然干燥;
瑞姬氏染液染色60s;瑞姬氏染液加等量 PBS(pH
69)再染10min;自来水冲洗,染片置于95%乙醇中
浸泡2~5s,脱掉片膜上的浮色,自然干燥,光学树
脂封片,置于油镜下镜检。计数200条精子,求出精
子顶体完整率(即顶体完整精子所占的百分率)。
顶体完整率(%)=顶体完整的精子数/精子总数 ×
100%
1422 精子电镜标本的制备及透射电镜观察[6]
各组精子悬液孵育1h,300r·min-1离心 10min,
轻轻吸去上清;沿管壁缓慢加入25%戊二醛,静置
4℃固定 4h;取出固定的精液凝块,切成 1mm×1
mm×1mm2~4块,用01mol·L-1PBS缓冲液漂洗
4~6次(05~20h/次),再经 1%锇酸后固定(4
℃,15h),按照电镜制样常规脱水、浸透,环氧树脂
Epon812包埋和聚合,超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬
酸铅双重染色,JEM-1200EX透射电镜观察精子的
超微结构。
15 统计方法
结果用珋x±s表示,采用 SPSS120统计软件包
进行方差齐性检验和单因素方差分析,以判断各组
间的显著性。
2 结果
21 菟丝子水提物对精子顶体完整率的影响
经ROS作用后精子膜和顶体结构明显受损,与
正常组相比,模型组、维生素 C组和菟丝子小、中、
大剂量组的精子顶体完整率显著降低(P均 <
0001),终含量 0125,05g·mL-1的菟丝子水提物
对精子顶体的保护作用与维生素 C(终含量025mg
·mL-1)无明显差别(P均 >005),终含量 025g·
mL-1的菟丝子水提物的作用明显优于维生素 C
(P<0001),见表1。
表1 各组精子顶体完整率(珋x±s,n=15)
分 组 剂 量/mg·mL-1 顶体完整率/%
正常组 62.80±5.36
模型组 4.93±1.49
维生素C组 025 32.87±6.421)
菟丝子组 125 33.40±6.141)
250 43.27±5.811,2)
500 31.60±5.341)
注:与模型组比较1)P<0001;与维生素C组比较2)P<0001
22 菟丝子水提物对精子超微结构的影响
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透射电镜观察,正常组精子形态正常,顶体和超
微结构完整。模型组精子头部发生不同程度的损
伤,超微结构异常,主要表现在精子膜结构、顶体和
线粒体部位异常。精子膜与顶体结构完整性发生改
变,膜破损,顶体呈节段性断裂,形成串珠状小泡;线
粒体排列紊乱、缺失,线粒体空泡变性明显,线粒体
嵴模糊不清或碎解。维生素 C组和菟丝子小、中、
大剂量组精子膜结构、顶体和线粒体超微结构异常
程度与模型组相比明显减轻,以菟丝子中剂量组最
明显,并可见到头部结构完整的精子,但结构完整程
度明显少于正常组。
3 讨论
研究表明[7],精子顶体完整率与精子顶体酶活
性有一定的相关性。精子顶体异常通常伴随顶体酶
质和量的改变,故精子顶体完整性与精子功能相关,
也是精子的功能指标之一。在受精过程中,精卵融
合前精子必须发生顶体反应,顶体完整性则是正常
顶体反应的基础[8]。
目前认为,精浆中的抗氧化防御机制保护精子
免受ROS的过氧化损伤。ROS的产生增加可导致
抗氧化活性下降或抑制。ROS的脂质过氧化作用可
引起精子膜结构与功能改变,精子线粒体和 DNA损
伤[9]。本实验结果表明,精子悬液与 ROS共同孵育
后精子的顶体完整率显著下降(P均<0001),说明
ROS对精子膜和顶体结构造成了损伤。在精子悬液
中分别加入维生素 C和不同含量的菟丝子水提物
后精子顶体完整率得以改善,这说明维生素 C和菟
丝子水提物都能对精子膜和顶体结构起到保护作
用,避免 ROS的攻击作用。菟丝子水提物 0125,
05g·mL-1的作用与维生素 C(025mg·mL-1)无明
显差别(P均>005),但终含量025g·mL-1的菟丝
子水提物的作用明显优于维生素C(P<0001)。透
射电镜观察结果表明,ROS介导的过氧化反应对精
子超微结构的损伤,主要表现在精子膜结构、顶体和
线粒体部位异常,这与文献报道一致[3]。与模型组
相比,维生素C组和菟丝子大、中、小剂量组的精子
膜结构、顶体和线粒体超微结构异常程度相对减轻,
以菟丝子中剂量组损伤程度最轻,这一结果与精子
顶体完整率的改变相一致。
精子的运动依赖于精子尾部线粒体提供能量和
微管结构的正常形态[10]。弱精子症患者存在精子
超微结构异常,这可能是弱精症病人精子丧失活力
的重要原因之一[11]。本实验结果提示,ROS可能导
致精子线粒体结构和功能损伤,当精子线粒体发生
异常后,其能量合成发生障碍,同时伴有线粒体活性
变化,导致了精子能量不足活动能力减弱。
可以认为,适宜含量(025g·mL-1)的菟丝子水
提物通过其有效的抗氧化作用,拮抗 ROS的过氧化
损伤作用,对精子膜、顶体结构和精子线粒体功能具
有明显的保护作用。
[致谢] 本课题还得到杭州市科技发展计划项目
(2004433Q15)的资助。
[参考文献]
[1] 世界卫生组织 人类精液及精子宫颈黏液相互作用实验室
检验手册 第4版 北京:北京科学出版社,200117
[2] 苏 昀,周性明,陈甸英,等.人精子顶体完整率的测定及其
临床意义.江苏医药,1999,25(2):103.
[3] 商学军,黄宇烽,熊承良,等.正常精子体外与活性氧作用后
超微结构观察.中华男科学,2002,8(2):106.
[4] BaoX,WangZ,FangJ,etal.Structuralfeaturesofanimmunos
timulatingandantioxidantacidicpolysaccharidefromtheseedsof
Cuscutachinensis.PlantaMed,2002,68(3):237.
[5] 商学军,黄宇烽,徐建平,等.Percol梯度离心与精子运动轨
迹图像分析.男科学报,1998,4(3):178.
[6] 孙桂勤,印洪林,周晓军.人类精液标本的电镜制备与染色
技术.中华男科学,2002,8(6):461.
[7] 高晓勤,杨 薇,许爱萍,等.精子顶体完整率与顶体酶活性
的关系.贵阳医学院学报,1995,20(1):18.
[8] LiuDY,BakerHW.Testsofhumanspermfunctionandfertilization
invitro.FertilSteril,1992,58(3):465.
[9] MarchetiC,ObertG,DefosezA,etal.Studyofmitochondrial
membranepotential,reactiveoxygenspecies,DNAfragmentationand
celviabilitybyflowcytometryinhumansperm.HumReprod,2002,
17(5):1257.
[10] GopalkrishnanK,PadwalV,D’SouzaS,etal.Severeastheno
zoospermia:astructuralandfunctionalstudy.IntJAndrol,1995,
18(Suppl1):67.
[11] 印洪林,周晓军,盛春宁,等.弱精症病人精子线粒体的电镜
观察.电子显微学报,2001,20(6):753.
ProtectionofextractfromCuscutajaponicaonhuman
spermacrosomeandultrastructure
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YANGXin,DINGCaifei,ZHANGYonghua,YANZhizhong,DUJing
(ZhejiangProvinceIntegrationofChineseandWesternMedicineHospital,Hangzhou310003,China)
[Abstract] Objective:Tostudytheoxidationdamageofactiveoxygen(ROS)tohumanspermacrosomeandultrastructure,andstudy
thefunctionmechanismaboutcuscutajaponicatreatingmale’sinfertilityandasthenoospermia.Method:ByusingthePercolgradientcentrifu
gation,thespermwithnormalphysiologicalfunctionwereselectedforthenormalspermmodel,andthespermsuspensionweredividedintothe
normalgroup,themodelgroup,thepositivecontrolgroup(VitaminCgroup),andthelugh,themedianandthelowdosegvoupsofC.
japonica.TheROSmadefromhypoxanthinexanzinexanzine(HXXO)anddiferentcontent(0125,025,05g·mL-1)ofextractwerein
cubatedwithspermintheoxygenenvironment.Theacrosomicintegrityratewerecalculatedandthespermacrosomeandultrastructurewereob
served.Result:Thecontent(0125,05g·mL-1)ofextracthadnoobviousdiferenceascomparedwithVitaminC(025mg·mL-1)inpro
tectingtheacrosomeandultrastructure,butthecontent(025mg·mL-1)ofextractwassignificantlybeterthanVitC(P<0001).Conclu
sion:ThesuitablecontentofextractfromC.japonicacansignificantlyprotectthespermmembrane,theacosomicstructureandthemitochon
drionfunctionfromthedamagecausedbyROS.
[Keywords] Cuscutajaponica;activeoxygen;sperm;acrosome;ultrastructure;lipinperoxidationfunction
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20050120
[通讯作者] 周瑾,Tel:(010)66937010
肾衰合剂对急性肾衰竭大鼠的保护作用及其
调节细胞因子分泌的实验研究
周 瑾1,涂晋文2,邵朝弟2
(1解放军总医院,北京 100853;2湖北中医学院,湖北 武汉 430064)
[摘要] 目的:观察中药复方肾衰合剂对急性肾功能衰竭(ARF)大鼠的防治作用,揭示该方药的作用机制。方
法:除正常对照组外,3组均予肌注甘油制备动物模型。分正常组、模型组、西药维拉帕米组、中药肾衰合剂(225g·
kg-1)4组灌胃,观察造模24h大鼠肾脏超微结构、血一氧化碳(NO),内皮素(ET),肿瘤坏死因子(TNFα)的变化。
结果:肾衰合剂及维拉帕米均能显著改善ARF大鼠的肾功能,一定程度上保护初发期急性肾小管坏死(ATN)时肾
小管上皮细胞等超微结构;同时肾衰合剂可显著降低ET、升高NO的含量,减少TNFα的产生,其作用部分优于维拉
帕米。结论:肾衰合剂通过调节血管活性因子及炎症因子的释放达到改善肾功能、减轻肾组织病变、防治 ATN的作
用。
[关键词] 肾衰合剂;急性肾功能衰竭;NO;ET;TNFα;超微病理
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)05042504
急性肾功能衰竭(ARF)是内科较为常见的急危
重症,由于致病原因的复杂性,重症 ARF比例逐年
增加,使其病死率高达 50%~70%[1]。究其主要原
因,此时多伴严重感染或者是合并多脏器功能障碍
综合征,机体内众多细胞因子被激活,包括各种血管
活性介质、炎症介质等,其作用呈网络状扩散。因此
积极探索中西医结合的方法救治重症 ARF,辨证运
用中医药,发挥中药复方的“多靶效应”,以降低其死
亡率、减少透析次数及并发症极有意义。
肾衰合剂是经长期临床应用有效的经验复方,
前期研究发现,其大剂量(225g·kg-1)能改善初发
期急性肾衰竭大鼠的肾功能、降低死亡率[2]。本试
验进一步通过该药对初发期急性肾小管坏死(ATN)
大鼠组织超微结构、分泌血管活性因子、炎症因子等
的观察,揭示该方药发挥疗效的部分作用机制。
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