全 文 :andbaicaleinindiferentconditions,andthedisposingsamplesmethodswereselectedtostabilizethem.Result:Baicalinandbaica
leininthebuferedaqueoussolutionatpH74wasmorestablethanthatinthemouseplasma.AfteraddingVitCinthebuferedaque
oussolution,thestabilityofbaicalinandbaicaleincouldbeimprovedobviouslyandtheirremainedpercentswere102% and100%.
ThestabilityofbaicalinandbaicaleincouldbeenhanceddistinctlyinthemouseplasmaonlywhenaddingVitCand1mol·L-1HCl,
andfurthermoretheirremainedpercentagewasupto98% and103%.Conclusion:Thestabilityofbaicalinandbaicaleinisrelatedto
theoxidationandenzymedegradationanditcanbeimprovedbyaddingVitCand1mol·L-1HClinthesolution.
[Keywords] HPLCECD;baicalin;baicalein;stabilityinplasma
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20080310
[基金项目] 湖北省科技厅攻关项目(130672)
[通讯作者] 杨占秋,Tel:(027)68759136,Email:yangzhan
qiu@163.com
表没食子儿茶素没食子酸酯抗流感
病毒作用的研究
肖 潇,杨占秋,石丽桥,刘 婧,陈 文
(武汉大学 医学病毒学研究所 病毒学国家重点实验室,湖北 武汉 430071)
[摘要] 目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在体内外抗甲型流感病毒的作用。方法:在体外用
MTT法检测EGCG对狗肾传代MDCK细胞的毒性浓度,用 CPE法观察 EGCG抑制甲型流感病毒的致细胞病变作
用;在体内建立流感病毒感染小鼠模型,通过观察小鼠病死率、生命延长率及肺病变程度指标判定其对小鼠肺炎的
抑制作用和染毒小鼠的死亡保护作用。结果:EGCG在体外能有效抑制甲型流感病毒 CPE的产生;口服 EGCG能
减少流感病毒AH1N1病毒株感染小鼠的病死率,延长存活时间,减轻小鼠肺组织病变程度。结论:EGCG具有很好
的抗甲型流感病毒的作用,呈剂量效应关系。
[关键词] EGCG;流感病毒;抗病毒作用
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22267805
流感流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引
起的一种急性呼吸道传染病,严重危害人类健康和
生命。每年约有15% ~20%的人群被流感病毒感
染,在美国导致约36万人死亡,在世界范围内导致
至少50万人死亡[1]。自发现人流感病毒至今已有
70余载,在此期间人类流感曾出现3次大流行均在
我国首发。过去的资料表明,新的流感病毒株仍可
能出现在中国[2]。但由于流感病毒容易发生抗原
变异,使疫苗保护作用效果受到一定限制,而使用的
化学药物又有较大的不良反应,因此到目前为止还
没有有效防治流感的方法[3]。为寻找有效的抗流
感病毒中药,作者选用表没食子儿茶素没食子酸酯
(EGCG)抗流感病毒试验,为流感病毒感染的治疗
提供依据。
1 材料
1.1 药物
EGCG,纯度 95%,购自武汉众一生物有限公
司,美国Sigma公司产品(批号E4143)。
1.2 病毒株
流感病毒 A/Yamagata/120/86(H1N1),由日本
福岛医科大学微生物系锡谷达夫教授惠赠。使用前
在9~11日龄鸡胚尿囊腔接种传代3~4次,收集尿
囊液,以3000r·min-1离心15min,取上清液进行
血凝实验,将血凝滴度大于1∶320且细菌培养阴性
的病毒液分装。
流感病毒鼠肺适应株(FM1,H1N1),由大理学
院基础医学部微生物学与免疫学教研室申元英教授
惠赠,血凝滴度为1∶640。所有毒种均置 -80℃保
存备用。
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1.3 细胞
狗肾传代细胞(MDCK)为本所保存。细胞生长
液分别为含 10%胎牛血清的 DMEM(dulbecco's
modifiedeaglemedium),常规加入青霉素和链霉素。
细胞维持液除含2%胎牛血清外,其余同细胞生长
液。MDCK细胞维持液加入2g·mL-1胰蛋白酶。
1.4 动物
5~7周龄 BALB/c小鼠,雌雄各半,体重(17±
1)g,购自武汉大学医学院实验动物中心,动物合格
证号SCXK(鄂)20030004。
2 方法
2.1 EGCG体外抗流感病毒实验
2.1.1 药物对 MDCK细胞的毒性作用 在96孔
板上,每孔加入01mL,2×105的 MDCK细胞,24h
待细胞长成单层后,加入不同浓度的含药维持液继
续培养。每天于倒置显微镜下观察细胞变化,72h
后,MTT法[4]检测细胞存活率。每一药物浓度均重
复4孔。同时设正常细胞对照。每次实验重复 3
次。
用统计软件SPSS115进行数据分析并计算药
物的半数细胞毒性浓度(TC50)。
细胞存活率(%)=A实验组/A细胞对照 ×100%
2.1.2 药物体外抗流感病毒的药效学研究 从以
下3种方式检测 EGCG对流感病毒(H1N1)的抑制
作用。Ⅰ组(药物对病毒感染的预防作用):用不同
浓度的药物预先处理单层细胞 24h,磷酸缓冲液
(PBS)洗涤2次后将100TCID50/01mL的病毒每
孔加入01mL,吸附2h,弃病毒液,PBS洗涤2次,
加细胞维持液培养,每天于倒置显微镜下观察细胞
变化。CPE记录方法为:“-”为无 CPE,“+”为
25%细胞出现 CPE,“”为 50%细胞出现 CPE,
“”为75%细胞出现CPE,“”为100%细胞出现
CPE。待病毒对照孔 CPE达80%以上且细胞对照
正常时,用MTT法检测细胞存活率,每一药物浓度
均重复4孔,同时设正常细胞对照和病毒对照。以
Probit回归方法计算药物半数有效浓度(EC50)。Ⅱ
组(药物对病毒的直接杀伤作用):将不同浓度的药
物与100TCID50/01mL的病毒液等量混合作用2
h,再将其感染单层细胞,吸附2h后,弃上清,PBS
洗涤2次,加入细胞维持液同上法继续培养和检查。
Ⅲ组(药物对病毒穿入细胞后的抑制作用):先用
100TCID50/01mL的病毒每孔01mL感染细胞,
吸附2h后,吸去病毒,加入不同浓度的含药维持
液,同上法培养和检查。
病毒抑制率(%)=
A药物处理 -A病毒对照
A细胞对照 -A病毒对照
×100%
采用治疗指数(treatmentindex,TI)作为评价指
标[5],衡量药物对流感病毒的抑制效力。
TI=TC50/EC50
2.2 EGCG体内抗流感病毒实验
2.2.1 流感病毒 FM1株的小鼠半数致死量(LD50)
的测定 将收获的病毒(效价为1∶640)10倍倍比
稀释,得到100,10-1,10-2,10-3,10-45个稀释度,
分别接种5组小鼠,每组8只。雌雄各半。乙醚轻
度麻醉后,每组分别给予上述稀释度的病毒,每只小
鼠滴鼻接种50μL。观察14d的小鼠死亡情况,按
ReedMuench法计算LD50
[6]。
2.2.2 药物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 40只
雌性BALB/c小鼠(16~18g)随机分成5组:正常组,
灌服生理盐水;病毒感染模型组,灌服生理盐水;
EGCG高剂量治疗组(80mg·kg-1·d-1),EGCG中
剂量治疗组(40mg·kg-1·d-1),EGCG低剂量治疗
组(20mg·kg-1·d-1)。小鼠经乙醚麻醉,以 15
LD50病毒液滴鼻感染,每只005mL,正常组用生理盐
水代替病毒液滴鼻感染。感染后2h开始灌胃给药,
每天灌胃给药2次,每次01mL,连续给药5d。最后
1次给药后小鼠禁食8h,称重,摘除眼球放血脱颈椎
处死动物,打开胸腔摘取全肺,生理盐水洗涤2次,称
重,逐个计算肺指数和肺指数抑制率[7]。
肺指数=肺重/体重×100%
肺指数抑制率(%)=(病毒组肺指数 -给药组肺指
数)/病毒组肺指数×100%
2.2.3 药物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株的死
亡保护作用 实验分组如 2.2.2。小鼠经乙醚麻
醉,以20LD50病毒液滴鼻感染,每只005mL,正常
组用生理盐水代替病毒液滴鼻感染。感染后2h开
始灌胃给药,每天灌胃给药2次,每次01mL,连续
给药5d。观察动物感染后的发病症状,连续观察
14d,14d未死者,存活时间以14d计算。记录各
组动物的死亡数和存活天数。
死亡保护率(%)=(病毒组死亡 -实验组死亡)/病毒
组死亡×100%
延长生命率(%)=
实验组平均生存天数-病毒组平均生存天数
病毒组平均生存天数 ×100%
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2.3 统计学处理
所有数据以 SPSS115forWindows软件汇总
并作统计学处理,分别采用线性回归分析、t检验和
χ2检验进行统计分析,P<005有统计学意义。
3 结果
3.1 体外实验
3.1.1 药物对 MDCK细胞的毒性作用 EGCG对
MDCK细胞的毒性作用表现为细胞折光性增加,细
胞变圆,破碎,脱落,吸光度(A)明显下降。且药物
对细胞的毒性作用在一定范围内随着药物浓度的增
加,细胞存活率降低。通过显微镜观察细胞形态和
MTT法测定值A,确定 EGCG的 TC50为8378mg·
L-1。经直线回归分析,药物浓度与细胞存活率之间
存在线性关系(r=0984,P<005)。
3.1.2 药物对细胞感染病毒的预防作用 流感病
毒对MDCK细胞CPE表现为细胞皱缩、变圆、壁厚、
脱落、折光性增强。根据细胞毒性实验的结果,选择
在无毒浓度范围内,将药物以不同的浓度进行实验。
28mg·L-1药物浓度作用孔 MDCK细胞形态明显
偏正常,多数细胞呈正常的上皮形态。结合细胞抑
制率,经统计处理可得其半数有效浓度(EC50)为
665mg·L-1,治疗指数(TI)为126,且预防作用
随浓度变化而变化,呈明显的量效关系,P<005。
同时未见大面积的细胞病变,表明 EGCG对流感病
毒具有良好的预防作用。
3.1.3 药物对病毒的直接杀伤作用 结合细胞抑
制率,经统计处理可得 EC50为118mg·L
-1,TI为
71,且灭活作用随浓度变化而变化,呈明显的量效
关系,P<005。同时未见大面积的细胞病变,表明
EGCG对流感病毒具有较好的直接杀伤作用。
3.1.4 药物对病毒穿入细胞后的抑制作用 结合
细胞抑制率,经统计处理可得 EC50为 692mg·
L-1,TI为121,且抑制作用随浓度变化而变化,呈
明显的量效关系,P<005。同时未见大面积的细
胞病变,表明EGCG对细胞内流感病毒有良好的抑
制作用。
药物3种作用方式体外抗流感病毒的结果见
表1。
表1 不同药物浓度下3种给药方式对流感病毒的作用
药物作用方式
细胞抑制率/%
1mg·L-1 2mg·L-1 35mg·L-1 7mg·L-1 14mg·L-1 28mg·L-1
EC50
/mg·L-1
TI
对细胞感染病毒的预防作用 2338 3035 4378 6269 8408 970 166 5126
对病毒的直接杀伤作用 2193 2347 3380 3709 6432 8404 118 71
对病毒穿入细胞后抑制作用 2746 3172 3495 6183 8333 9839 692 121
3.2 体内实验
3.2.1 流感病毒鼠肺适应株 FM1对 LD50的测定
感染后第4天,前3组均有小鼠出现发病症状,表现
为耸毛、喘息、饮食减少,第5天有小鼠出现活动减
少、走路摇摆等症状,并且开始有小鼠出现死亡。观
察14d的小鼠死亡情况,按 ReedMuench法计算
LD50为10
-233。
3.2.2 药物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 正常
组小鼠皮毛光泽,尾静脉淡红,正常觅食,食量无明
显变化,体重持续增长。病毒模型组小鼠体毛脱落,
失去光泽,尾静脉呈黑紫色,聚成一堆,较其他各组
小鼠活动减少,食量减少,逐渐消瘦。药物治疗组小
鼠体重下降较少(与病毒组相比 P<005),与正常
组相比无明显差异,结果见表2。
表2 EGCG对流感病毒感染小鼠体重的影响(珋x±s,n=8) g
分组 剂量/mg·kg-1 1d 2d 3d 4d 5d
正常 - 1830±110 1800±115 1813±117 1868±127 1865±115
病毒 - 1800±095 1790±110 1768±088 1762±0931) 1740±0951)
EGCG 80 1786±109 1789±124 1793±108 1802±1122) 1815±1331)
40 1767±080 1751±084 1751±062 1760±0742) 1749±1072)
20 1744±093 1742±102 1737±109 1727±1112) 1711±1012)
注:与正常组比1)P<005;与模型组比2)P<005
正常小鼠肺指数在一定范围内,小鼠感染流感病毒
后引发小鼠肺炎,肺重增加,肺指数相应增加,因而
肺指数可作为评价药物是否具有抗流感病毒作用的
指标。EGCG对流感病毒所致小鼠肺炎的影响的结
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果见表3。各组肺指数之间差异具有统计学意义(P
<005)。模型组的肺指数较正常对照组的肺指数
有明显升高(P<005)。
表3 EGCG对流感病毒感染小鼠肺指数的影响
(珋x±s,n=7)
组别 剂量/mg·kg-1 肺指数 抑制率/%
病毒 - 1235±03731) -
正常 - 0706±0053 -
EGCG 80 0757±00671) 3869
40 0875±01231) 2912
20 0897±01211) 2731
注:与正常组比1)P<005
3.2.3 药物对流感病毒感染小鼠死亡的保护作
用 小鼠感染流感病毒后,病毒组于感染后第4天
开始出现症状,表现为厌食、消瘦、食量差、行动迟
缓,寒颤、耸毛、毛无光泽、蜷缩、呼吸异常直至死亡,
第8天出现死亡高峰。部分给药组小鼠能逐渐恢复
正常,部分不能,但较病毒组发病及死亡时间有推
迟。记录各组动物死亡数及存活天数,连续观察14
d后,与病毒组相比较,除EGCG低剂量组(20mg·
kg-1·d-1)外,高剂量与中剂量组均能降低小鼠病
毒性肺炎的死亡率(P<005),并延长存活时间
(P<005)。EGCG对小鼠死亡率和存活时间的影
响,结果见表4。
4 讨论
表4 EGCG对流感病毒感染小鼠死亡的保护作用(珋x±s,n=12)
组别 剂量/mg·kg-1 死亡数/只 死亡率/% 保护率/% 存活天数 生命延长率/%
病毒 - 10 833 - 908±194 -
正常 - 0 0 0 140±000 -
EGCG 80 4 3331) 600 120±267 3211)
40 6 501) 399 110±300 2111)
20 9 75 99 983±233 83
注:与病毒组比1)P<005
EGCG是儿茶素类化合物之一,在茶叶中含量
较高,占茶多酚制品的40% ~50%,它是2连苯酚
基苯骈吡喃与没食子酸形成的酯,同时因其结构中
有6个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素类化合物
的许多性质[8]。现代科学研究表明 EGCG具有显
著的抗突变、抗氧化作用,能增强机体免疫力,抑制
肿瘤细胞生长,降低肝脂和胆固醇,对痢疾、伤寒、金
黄色葡萄球菌的生长也有很强的抑制作用。EGCG
的抗肿瘤作用已经得到了各国研究人员的认可,现
已被列为潜在的抗癌新药在中美等国进行研究[9]。
因此,EGCG是一种很有开发价值的药物。
本实验主要通过体外细胞培养法和体内建立病
毒感染模型考察了EGCG的抗流感病毒效果。通过
对不同浓度的EGCG以3种给药方式体外抗流感病
毒研究发现:药物在阻断流感病毒侵入、直接杀伤病
毒及抑制病毒穿入细胞后增殖皆有不错的效果。故
在小鼠体内进一步进行抗流感病毒实验。以流感病
毒鼠肺适应株 FM1感染小鼠引起病毒性肺炎,用
EGCG治疗小鼠性肺炎实验显示:其对小鼠病毒性
肺炎有明显抑制作用,能降低其肺指数,延缓其体重
下降程度,减轻其肺部炎症病变程度。此外,较高剂
量能明显降低小鼠感染流感病毒肺适应株FM1引起
的死亡率,同时显著延长感染病毒后小鼠的平均存
活天数。
实验证明EGCG具有较好的抗流感病毒作用,
是一种有实用价值,确实有效地预防流感病毒入侵、
直接灭活流感病毒并抑制流感病毒增殖的中药制
剂。在体内治疗流感病毒性肺炎的作用中,高、中剂
量组的表现更加明显,低剂量组效果不佳,说明药物
的抗病毒作用与其浓度关系密切。本研究为其临床
上用于治疗流感病毒感染提供了现代药理学依据。
作者将在今后的工作中,从分子生物学、分子药理学
水平对EGCG抗病毒的作用靶点及有效部位进行深
入的研究。
[参考文献]
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Antiviralefectofepigalocatechingalate(EGCG)oninfluenzaAvirus
XIAOXiao,YANGZhanqiu,SHILiqiao,LIUJing,CHENWen
(StateKeyLaboratoryofMedicalVirology&InstituteofMedicalVirology,SchoolofMedicine,
WuhanUniversity,Wuhan430071,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatetheefectsofepigalocatechingalate(EGCG)againsttheinfluenzaAvirusinvitroand
invivo.Method:ThecelculturetechniquewasusedinMDCKcelstogetcelviabilityatdiferentconcentrationofEGCGbyMTT
assay.Cytopathicefect(CPE)andMTTwereappliedtoobservetheprotectivefunctionofEGCGandit'singredientswereadminis
teredtocelsinthreediferentways(methodⅠ:administrationbeforeinfection,methodⅡ:administrationuponinfection,andmeth
odⅢ:administrationafterinfection)totreattheinfectiousmodelinvitro.TheantiviralactivityinvivowasperformedonBALB/c
mice,whichweredividedtoreceiveEGCG.Themeansurvivaldaysandthepulmonarypathologicallesionsoftheinfectedmicewere
observedtoevaluatethetherapeuticeficacyofEGCG.Result:EGCGefectivelyinhibitedinfluenzaAvirusinvitro.Thedeathrate
andpulmonarypathologicallesionsweredecreased,andthemeansurvivaldayswereprolongedbyoraladministrationofEGCGinthe
miceinfectedbyinfluenzaAvirus.Conclusion:EGCGhasastrongefectagainstinfluenzaAH1N1virusinvitroandinvivo,ina
dosedependentmanner.
[Keywords] EGCG;influenzaAH1N1virus;antiviralefect
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