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Antiviral effect of epigallocatechin gallate (EGCG) on influenza A virus

表没食子儿茶素没食子酸酯抗流感病毒作用的研究



全 文 :andbaicaleinindiferentconditions,andthedisposingsamplesmethodswereselectedtostabilizethem.Result:Baicalinandbaica
leininthebuferedaqueoussolutionatpH74wasmorestablethanthatinthemouseplasma.AfteraddingVitCinthebuferedaque
oussolution,thestabilityofbaicalinandbaicaleincouldbeimprovedobviouslyandtheirremainedpercentswere102% and100%.
ThestabilityofbaicalinandbaicaleincouldbeenhanceddistinctlyinthemouseplasmaonlywhenaddingVitCand1mol·L-1HCl,
andfurthermoretheirremainedpercentagewasupto98% and103%.Conclusion:Thestabilityofbaicalinandbaicaleinisrelatedto
theoxidationandenzymedegradationanditcanbeimprovedbyaddingVitCand1mol·L-1HClinthesolution.
[Keywords] HPLCECD;baicalin;baicalein;stabilityinplasma
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20080310
[基金项目] 湖北省科技厅攻关项目(130672)
[通讯作者] 杨占秋,Tel:(027)68759136,Email:yangzhan
qiu@163.com
表没食子儿茶素没食子酸酯抗流感
病毒作用的研究
肖 潇,杨占秋,石丽桥,刘 婧,陈 文
(武汉大学 医学病毒学研究所 病毒学国家重点实验室,湖北 武汉 430071)
[摘要] 目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在体内外抗甲型流感病毒的作用。方法:在体外用
MTT法检测EGCG对狗肾传代MDCK细胞的毒性浓度,用 CPE法观察 EGCG抑制甲型流感病毒的致细胞病变作
用;在体内建立流感病毒感染小鼠模型,通过观察小鼠病死率、生命延长率及肺病变程度指标判定其对小鼠肺炎的
抑制作用和染毒小鼠的死亡保护作用。结果:EGCG在体外能有效抑制甲型流感病毒 CPE的产生;口服 EGCG能
减少流感病毒AH1N1病毒株感染小鼠的病死率,延长存活时间,减轻小鼠肺组织病变程度。结论:EGCG具有很好
的抗甲型流感病毒的作用,呈剂量效应关系。
[关键词] EGCG;流感病毒;抗病毒作用
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22267805
  流感流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引
起的一种急性呼吸道传染病,严重危害人类健康和
生命。每年约有15% ~20%的人群被流感病毒感
染,在美国导致约36万人死亡,在世界范围内导致
至少50万人死亡[1]。自发现人流感病毒至今已有
70余载,在此期间人类流感曾出现3次大流行均在
我国首发。过去的资料表明,新的流感病毒株仍可
能出现在中国[2]。但由于流感病毒容易发生抗原
变异,使疫苗保护作用效果受到一定限制,而使用的
化学药物又有较大的不良反应,因此到目前为止还
没有有效防治流感的方法[3]。为寻找有效的抗流
感病毒中药,作者选用表没食子儿茶素没食子酸酯
(EGCG)抗流感病毒试验,为流感病毒感染的治疗
提供依据。
1 材料
1.1 药物
EGCG,纯度 95%,购自武汉众一生物有限公
司,美国Sigma公司产品(批号E4143)。
1.2 病毒株
流感病毒 A/Yamagata/120/86(H1N1),由日本
福岛医科大学微生物系锡谷达夫教授惠赠。使用前
在9~11日龄鸡胚尿囊腔接种传代3~4次,收集尿
囊液,以3000r·min-1离心15min,取上清液进行
血凝实验,将血凝滴度大于1∶320且细菌培养阴性
的病毒液分装。
流感病毒鼠肺适应株(FM1,H1N1),由大理学
院基础医学部微生物学与免疫学教研室申元英教授
惠赠,血凝滴度为1∶640。所有毒种均置 -80℃保
存备用。
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1.3 细胞
狗肾传代细胞(MDCK)为本所保存。细胞生长
液分别为含 10%胎牛血清的 DMEM(dulbecco's
modifiedeaglemedium),常规加入青霉素和链霉素。
细胞维持液除含2%胎牛血清外,其余同细胞生长
液。MDCK细胞维持液加入2g·mL-1胰蛋白酶。
1.4 动物
5~7周龄 BALB/c小鼠,雌雄各半,体重(17±
1)g,购自武汉大学医学院实验动物中心,动物合格
证号SCXK(鄂)20030004。
2 方法
2.1 EGCG体外抗流感病毒实验
2.1.1 药物对 MDCK细胞的毒性作用 在96孔
板上,每孔加入01mL,2×105的 MDCK细胞,24h
待细胞长成单层后,加入不同浓度的含药维持液继
续培养。每天于倒置显微镜下观察细胞变化,72h
后,MTT法[4]检测细胞存活率。每一药物浓度均重
复4孔。同时设正常细胞对照。每次实验重复 3
次。
用统计软件SPSS115进行数据分析并计算药
物的半数细胞毒性浓度(TC50)。
细胞存活率(%)=A实验组/A细胞对照 ×100%
2.1.2 药物体外抗流感病毒的药效学研究  从以
下3种方式检测 EGCG对流感病毒(H1N1)的抑制
作用。Ⅰ组(药物对病毒感染的预防作用):用不同
浓度的药物预先处理单层细胞 24h,磷酸缓冲液
(PBS)洗涤2次后将100TCID50/01mL的病毒每
孔加入01mL,吸附2h,弃病毒液,PBS洗涤2次,
加细胞维持液培养,每天于倒置显微镜下观察细胞
变化。CPE记录方法为:“-”为无 CPE,“+”为
25%细胞出现 CPE,“”为 50%细胞出现 CPE,
“”为75%细胞出现CPE,“”为100%细胞出现
CPE。待病毒对照孔 CPE达80%以上且细胞对照
正常时,用MTT法检测细胞存活率,每一药物浓度
均重复4孔,同时设正常细胞对照和病毒对照。以
Probit回归方法计算药物半数有效浓度(EC50)。Ⅱ
组(药物对病毒的直接杀伤作用):将不同浓度的药
物与100TCID50/01mL的病毒液等量混合作用2
h,再将其感染单层细胞,吸附2h后,弃上清,PBS
洗涤2次,加入细胞维持液同上法继续培养和检查。
Ⅲ组(药物对病毒穿入细胞后的抑制作用):先用
100TCID50/01mL的病毒每孔01mL感染细胞,
吸附2h后,吸去病毒,加入不同浓度的含药维持
液,同上法培养和检查。
病毒抑制率(%)=
A药物处理 -A病毒对照
A细胞对照 -A病毒对照
×100%
  采用治疗指数(treatmentindex,TI)作为评价指
标[5],衡量药物对流感病毒的抑制效力。
TI=TC50/EC50
2.2 EGCG体内抗流感病毒实验
2.2.1 流感病毒 FM1株的小鼠半数致死量(LD50)
的测定 将收获的病毒(效价为1∶640)10倍倍比
稀释,得到100,10-1,10-2,10-3,10-45个稀释度,
分别接种5组小鼠,每组8只。雌雄各半。乙醚轻
度麻醉后,每组分别给予上述稀释度的病毒,每只小
鼠滴鼻接种50μL。观察14d的小鼠死亡情况,按
ReedMuench法计算LD50
[6]。
2.2.2 药物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 40只
雌性BALB/c小鼠(16~18g)随机分成5组:正常组,
灌服生理盐水;病毒感染模型组,灌服生理盐水;
EGCG高剂量治疗组(80mg·kg-1·d-1),EGCG中
剂量治疗组(40mg·kg-1·d-1),EGCG低剂量治疗
组(20mg·kg-1·d-1)。小鼠经乙醚麻醉,以 15
LD50病毒液滴鼻感染,每只005mL,正常组用生理盐
水代替病毒液滴鼻感染。感染后2h开始灌胃给药,
每天灌胃给药2次,每次01mL,连续给药5d。最后
1次给药后小鼠禁食8h,称重,摘除眼球放血脱颈椎
处死动物,打开胸腔摘取全肺,生理盐水洗涤2次,称
重,逐个计算肺指数和肺指数抑制率[7]。
肺指数=肺重/体重×100%
肺指数抑制率(%)=(病毒组肺指数 -给药组肺指
数)/病毒组肺指数×100%
2.2.3 药物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株的死
亡保护作用 实验分组如 2.2.2。小鼠经乙醚麻
醉,以20LD50病毒液滴鼻感染,每只005mL,正常
组用生理盐水代替病毒液滴鼻感染。感染后2h开
始灌胃给药,每天灌胃给药2次,每次01mL,连续
给药5d。观察动物感染后的发病症状,连续观察
14d,14d未死者,存活时间以14d计算。记录各
组动物的死亡数和存活天数。
死亡保护率(%)=(病毒组死亡 -实验组死亡)/病毒
组死亡×100%
延长生命率(%)=
实验组平均生存天数-病毒组平均生存天数
病毒组平均生存天数 ×100%
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2.3 统计学处理
所有数据以 SPSS115forWindows软件汇总
并作统计学处理,分别采用线性回归分析、t检验和
χ2检验进行统计分析,P<005有统计学意义。
3 结果
3.1 体外实验
3.1.1 药物对 MDCK细胞的毒性作用 EGCG对
MDCK细胞的毒性作用表现为细胞折光性增加,细
胞变圆,破碎,脱落,吸光度(A)明显下降。且药物
对细胞的毒性作用在一定范围内随着药物浓度的增
加,细胞存活率降低。通过显微镜观察细胞形态和
MTT法测定值A,确定 EGCG的 TC50为8378mg·
L-1。经直线回归分析,药物浓度与细胞存活率之间
存在线性关系(r=0984,P<005)。
3.1.2 药物对细胞感染病毒的预防作用 流感病
毒对MDCK细胞CPE表现为细胞皱缩、变圆、壁厚、
脱落、折光性增强。根据细胞毒性实验的结果,选择
在无毒浓度范围内,将药物以不同的浓度进行实验。
28mg·L-1药物浓度作用孔 MDCK细胞形态明显
  
偏正常,多数细胞呈正常的上皮形态。结合细胞抑
制率,经统计处理可得其半数有效浓度(EC50)为
665mg·L-1,治疗指数(TI)为126,且预防作用
随浓度变化而变化,呈明显的量效关系,P<005。
同时未见大面积的细胞病变,表明 EGCG对流感病
毒具有良好的预防作用。
3.1.3 药物对病毒的直接杀伤作用 结合细胞抑
制率,经统计处理可得 EC50为118mg·L
-1,TI为
71,且灭活作用随浓度变化而变化,呈明显的量效
关系,P<005。同时未见大面积的细胞病变,表明
EGCG对流感病毒具有较好的直接杀伤作用。
3.1.4 药物对病毒穿入细胞后的抑制作用 结合
细胞抑制率,经统计处理可得 EC50为 692mg·
L-1,TI为121,且抑制作用随浓度变化而变化,呈
明显的量效关系,P<005。同时未见大面积的细
胞病变,表明EGCG对细胞内流感病毒有良好的抑
制作用。
药物3种作用方式体外抗流感病毒的结果见
表1。
表1 不同药物浓度下3种给药方式对流感病毒的作用
药物作用方式
细胞抑制率/%
1mg·L-1 2mg·L-1 35mg·L-1 7mg·L-1 14mg·L-1 28mg·L-1
EC50
/mg·L-1
TI
对细胞感染病毒的预防作用 2338 3035 4378 6269 8408 970 166 5126
对病毒的直接杀伤作用   2193 2347 3380 3709 6432 8404 118 71
对病毒穿入细胞后抑制作用 2746 3172 3495 6183 8333 9839 692 121
3.2 体内实验
3.2.1 流感病毒鼠肺适应株 FM1对 LD50的测定 
感染后第4天,前3组均有小鼠出现发病症状,表现
为耸毛、喘息、饮食减少,第5天有小鼠出现活动减
少、走路摇摆等症状,并且开始有小鼠出现死亡。观
察14d的小鼠死亡情况,按 ReedMuench法计算
LD50为10
-233。
3.2.2 药物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 正常
组小鼠皮毛光泽,尾静脉淡红,正常觅食,食量无明
显变化,体重持续增长。病毒模型组小鼠体毛脱落,
失去光泽,尾静脉呈黑紫色,聚成一堆,较其他各组
小鼠活动减少,食量减少,逐渐消瘦。药物治疗组小
鼠体重下降较少(与病毒组相比 P<005),与正常
组相比无明显差异,结果见表2。
表2 EGCG对流感病毒感染小鼠体重的影响(珋x±s,n=8) g 
分组 剂量/mg·kg-1 1d 2d 3d 4d 5d
正常 - 1830±110 1800±115 1813±117 1868±127 1865±115
病毒 - 1800±095 1790±110 1768±088 1762±0931) 1740±0951)
EGCG 80 1786±109 1789±124 1793±108 1802±1122) 1815±1331)
  40 1767±080 1751±084 1751±062 1760±0742) 1749±1072)
  20 1744±093 1742±102 1737±109 1727±1112) 1711±1012)
  注:与正常组比1)P<005;与模型组比2)P<005
正常小鼠肺指数在一定范围内,小鼠感染流感病毒
后引发小鼠肺炎,肺重增加,肺指数相应增加,因而
肺指数可作为评价药物是否具有抗流感病毒作用的
指标。EGCG对流感病毒所致小鼠肺炎的影响的结
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果见表3。各组肺指数之间差异具有统计学意义(P
<005)。模型组的肺指数较正常对照组的肺指数
有明显升高(P<005)。
表3 EGCG对流感病毒感染小鼠肺指数的影响
(珋x±s,n=7)
组别 剂量/mg·kg-1 肺指数 抑制率/%
病毒 - 1235±03731) -
正常 - 0706±0053 -
EGCG 80 0757±00671) 3869
  40 0875±01231) 2912
  20 0897±01211) 2731
  注:与正常组比1)P<005
3.2.3 药物对流感病毒感染小鼠死亡的保护作
  
用 小鼠感染流感病毒后,病毒组于感染后第4天
开始出现症状,表现为厌食、消瘦、食量差、行动迟
缓,寒颤、耸毛、毛无光泽、蜷缩、呼吸异常直至死亡,
第8天出现死亡高峰。部分给药组小鼠能逐渐恢复
正常,部分不能,但较病毒组发病及死亡时间有推
迟。记录各组动物死亡数及存活天数,连续观察14
d后,与病毒组相比较,除EGCG低剂量组(20mg·
kg-1·d-1)外,高剂量与中剂量组均能降低小鼠病
毒性肺炎的死亡率(P<005),并延长存活时间
(P<005)。EGCG对小鼠死亡率和存活时间的影
响,结果见表4。
4 讨论
表4 EGCG对流感病毒感染小鼠死亡的保护作用(珋x±s,n=12)
组别 剂量/mg·kg-1 死亡数/只 死亡率/% 保护率/% 存活天数 生命延长率/%
病毒 - 10 833 - 908±194 -
正常 - 0 0 0 140±000 -
EGCG 80 4 3331) 600 120±267 3211)
  40 6 501) 399 110±300 2111)
  20 9 75 99 983±233 83
  注:与病毒组比1)P<005
  EGCG是儿茶素类化合物之一,在茶叶中含量
较高,占茶多酚制品的40% ~50%,它是2连苯酚
基苯骈吡喃与没食子酸形成的酯,同时因其结构中
有6个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素类化合物
的许多性质[8]。现代科学研究表明 EGCG具有显
著的抗突变、抗氧化作用,能增强机体免疫力,抑制
肿瘤细胞生长,降低肝脂和胆固醇,对痢疾、伤寒、金
黄色葡萄球菌的生长也有很强的抑制作用。EGCG
的抗肿瘤作用已经得到了各国研究人员的认可,现
已被列为潜在的抗癌新药在中美等国进行研究[9]。
因此,EGCG是一种很有开发价值的药物。
本实验主要通过体外细胞培养法和体内建立病
毒感染模型考察了EGCG的抗流感病毒效果。通过
对不同浓度的EGCG以3种给药方式体外抗流感病
毒研究发现:药物在阻断流感病毒侵入、直接杀伤病
毒及抑制病毒穿入细胞后增殖皆有不错的效果。故
在小鼠体内进一步进行抗流感病毒实验。以流感病
毒鼠肺适应株 FM1感染小鼠引起病毒性肺炎,用
EGCG治疗小鼠性肺炎实验显示:其对小鼠病毒性
肺炎有明显抑制作用,能降低其肺指数,延缓其体重
下降程度,减轻其肺部炎症病变程度。此外,较高剂
量能明显降低小鼠感染流感病毒肺适应株FM1引起
的死亡率,同时显著延长感染病毒后小鼠的平均存
活天数。
实验证明EGCG具有较好的抗流感病毒作用,
是一种有实用价值,确实有效地预防流感病毒入侵、
直接灭活流感病毒并抑制流感病毒增殖的中药制
剂。在体内治疗流感病毒性肺炎的作用中,高、中剂
量组的表现更加明显,低剂量组效果不佳,说明药物
的抗病毒作用与其浓度关系密切。本研究为其临床
上用于治疗流感病毒感染提供了现代药理学依据。
作者将在今后的工作中,从分子生物学、分子药理学
水平对EGCG抗病毒的作用靶点及有效部位进行深
入的研究。
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XIAOXiao,YANGZhanqiu,SHILiqiao,LIUJing,CHENWen
(StateKeyLaboratoryofMedicalVirology&InstituteofMedicalVirology,SchoolofMedicine,
WuhanUniversity,Wuhan430071,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatetheefectsofepigalocatechingalate(EGCG)againsttheinfluenzaAvirusinvitroand
invivo.Method:ThecelculturetechniquewasusedinMDCKcelstogetcelviabilityatdiferentconcentrationofEGCGbyMTT
assay.Cytopathicefect(CPE)andMTTwereappliedtoobservetheprotectivefunctionofEGCGandit'singredientswereadminis
teredtocelsinthreediferentways(methodⅠ:administrationbeforeinfection,methodⅡ:administrationuponinfection,andmeth
odⅢ:administrationafterinfection)totreattheinfectiousmodelinvitro.TheantiviralactivityinvivowasperformedonBALB/c
mice,whichweredividedtoreceiveEGCG.Themeansurvivaldaysandthepulmonarypathologicallesionsoftheinfectedmicewere
observedtoevaluatethetherapeuticeficacyofEGCG.Result:EGCGefectivelyinhibitedinfluenzaAvirusinvitro.Thedeathrate
andpulmonarypathologicallesionsweredecreased,andthemeansurvivaldayswereprolongedbyoraladministrationofEGCGinthe
miceinfectedbyinfluenzaAvirus.Conclusion:EGCGhasastrongefectagainstinfluenzaAH1N1virusinvitroandinvivo,ina
dosedependentmanner.
[Keywords] EGCG;influenzaAH1N1virus;antiviralefect
[责任编辑 古云侠]
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