全 文 ：枳 子提取物对实验大鼠肝组织中 ׌°2t
与  °2tv表达的影响
刘秀玲t ou o张 洪t 3 o王 飞t ou
kt1 武汉大学 人民医院 药学部 o湖北 武汉 wvssys ~u1 武汉大学 药学院 o湖北 武汉 wvsszul
≈摘要  目的 }探讨枳 子提取物对实验大鼠肝组织基质金属蛋白酶2tvk  °2tvl与金属蛋白酶组织抑制因
子2tk׌°2tl表达的影响 ∀方法 }≥⁄大鼠 w{只 o随机分为 u组 }正常对照组kty只l与模型组kvu只l o用四氯化碳制
备大鼠肝纤维化模型 o共造模 y周 oy周末各组分别处死大鼠 {只 o取肝脏进行 ‹∞染色 ~模型组大鼠随机分为 v组 }
自然恢复组 !对照组和给药组 o于 tu周末处死各组大鼠 o取肝脏 o运用半定量逆转录聚合酶链反应k• ×2°≤• l检测肝
组织中  °2tv °• ‘„与 ׌°2t °• ‘„的表达 ∀结果 } °2tv °• ‘„的表达在各组之间并无显著性差异 o而 ׌°2t
°• ‘„在各组之间有显著性差异 o与正常组相比 o自然恢复组大鼠肝组织 ׌°2t °• ‘„显著升高k Π s1sxl o而与自
然恢复组相比 o对照组和给药组大鼠肝组织 ׌°2t °• ‘„的表达显著降低k Π s1sxl o其中给药组 ׌°2t °• ‘„比
对照组显著降低k Π s1sxl ∀结论 }枳 子提取物逆转肝纤维化的机制可能是减少肝纤维化大鼠肝脏中 ׌°2t
°• ‘„的表达 o逐渐恢复肝脏胶原降解系统 o从而逆转肝纤维化 ∀
≈关键词  枳 子 ~肝纤维化 ~基质金属蛋白酶2tv ~金属蛋白酶组织抑制因子2t
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltv2ts|z2sw
≈收稿日期  ussx2s{2uw
≈基金项目  湖北省科技攻关项目kusu„„vst≤ytl
≈通讯作者  3 张洪 oר¯ }ksuzlyuvx{vz{ o∞2°¤¬¯}½«½¬{{{{ ƒ
tyv1¦²°
肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理基
础 o是肝脏细胞外基质k ¬¨·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ°¤·µ¬¬o∞≤l的
合成与降解失衡 !导致其过度沉积≈t  o在 ∞≤ 的降
解过程中起主要作用的是基质金属蛋白酶k°¤·µ¬¬
°¨ ·¤¯ ²¯³µ²·¨¬±¤¨¶o °¶l o其中间质胶原酶k °2tvl
在降解纤维化肝脏 ∞≤ 的主要成分 ´ o¶型胶原的
过程中起重要作用≈u  ∀而对  °2tv活性起抑制作
用的是金属蛋白酶组织抑制因子2tk·¬¶¶∏¨ ¬±«¬¥¬·²µ²©
°¨ ·¤¯ ²¯³µ²·¨¬±¤¶¨¶o׌°2tl o在肝纤维化过程中׌°2t
通过对  °¶活性的抑制 o抑制了肝脏 ∞≤ 的降
解 o从而导致 ∞≤ 在肝脏内的过度沉积≈v  ∀
枳 子为鼠李科拐枣属植物枳 子 Ηοϖενια
δυλχισ ׫∏±¥的干燥成熟种子 o具有止渴除烦 !解酒
毒 !镇惊 !利尿之功效 ∀前期工作已证实 o枳 子提
取物具有抗早期肝纤维化的作用 o但其抗纤维化机
制仍需继续研究 o本实验选择肝纤维化胶原合成与
降解中 u个关键酶进行研究 o希望进一步探讨枳
子抗肝纤维化的机制 ∀
1 材料
111 动物 w{只健康雄性 ≥⁄大鼠k≥°ƒ级 o实验动
物质量合格证 ssvzxszl o体重 tts ∗ txs ªo购自武汉
大学医学院动物实验中心 ∀
112 试剂与仪器 וŒ½²¯kŒ±·µ²ª¨±公司l o2°∂ 逆
转录酶k°µ²°¨ ª¤公司l o• ±¤¶¬±k≥„…≤ 公司l o⁄≠≠ p
¶ p {…型琼脂糖凝胶电泳仪k北京市六一仪器厂l o
凝胶成像系统仪器 k…¬²2•¤§公司l o°≤• 扩增仪
k…¬²°¨ ·µ¤ ˜‘’‹公司l o引物合成k上海生工生物工
程技术服务有限公司l ∀
113 药物制备 以 s1x h羧甲基纤维素钠k≤≤2
‘¤l溶液将干燥枳 子提取物k以 zx h乙醇为提取
溶剂 o常规渗漉法提取 o干浸膏平均得率为 tv1s h o
黄酮平均含量为 {1w h l≈w 配置为 tx h的混悬液备
用k折合生药为 t1tx ª#°ptl ~对照药物采用秋水仙
碱 o西双版纳制药厂出品 o生产批号 swsxs| o碾成细
粉后以 s1x h ≤≤2‘¤配成 us Λª#°pt混悬液备用 ∀
2 方法
211 大鼠造模方法 w{只雄性 ≥⁄大鼠随机分为 u
组 o即正常组 ty只 o模型组 vu只k已经除去死亡大
鼠l ∀正常组以 s1t °#ªpt体重腹腔注射植物油 o其
余均以 xs h ≤≤¯ w植物油溶液 s1sst °#ªpt体重腹腔
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第 vt卷第 tv期
ussy年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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注射 o每周 u次 o共 y周 ∀造模结束时处死正常组和
模型组大鼠各 {只 o进行 ‹∞染色 ∀
212 实验动物处理方法 ≥⁄大鼠造模 y周后 o将
模型组大鼠随机分为 v组 }自然恢复组k{只l o以
s1st °#ªpt体重口服给予 s1x h ≤≤2‘¤溶液 ~对照
组k{只l o以 s1st °#ªpt体重口服给予 us Λª#°pt
秋水仙碱 p s1x h ≤≤2‘¤混悬液 ~给药组k{只l以
s1st °#ªpt体重口服给予 tx h 枳 子提取物2
s1x h ≤≤2‘¤混悬液 o每天 t次 o至 tu周止 ∀tu周
末处死各组大鼠 o取肝脏 o以 • ×2°≤• 及图像分析系
统检测肝组织中 ׌°2t与  °2tv °• ‘„表达量 ∀
213 组织标本的采集及处理 乙醚麻醉 o心脏取血
致死 o肝脏称重 o将肝脏置于冰生理盐水中充分洗涤
后 o肝脏的左叶固定于 ts h中性甲醛中 o常规取材 o
石蜡包埋 o连续切片 o切片厚 w Λ° o用于 ‹∞染色 o
‹∞结果参照 ≥¦«¨ ∏¨µ≈x 法 ∀滤纸吸干生理盐水 o肝
脏的右叶迅速保存于液氮中待检 ∀
214 • ×2°≤• ≠ • ‘„ 提取 }以 וŒ½²¯ 提取肝组织
细胞总 • ‘„ o纯度 ΑuysrΑu{s在 t1{ ∗ u1s o调整 • ‘„
为 s1w Λª#ˏpt ~ ¦⁄‘„ 合成 }反应体系 t 包括 }
• ‘„ x ˏo’¯¬ª²§×t{ t ˏo无核酶水 y ˏo总反应体
积为 tu ˏo于 zs ε 孵育 x °¬±o置于冰上 x °¬±~反
应体系 u }体系 t 产物 tu ˏo无核酶水 x1ux ˏo
§‘×°¬¬kts °°²¯#ptl t1ux ˏo2∂ x ≅ …∏©©¨µx
ˏo• ±¤¶¬± s1x ˏo2∂ • × t ˏo总反应体积为 ux
ˏo于 wu ε 孵育 |s °¬±~≈ °≤• 反应 }包括¦⁄‘„ t1x
ˏoפ´ ts ≅ …∏©©¨µu1x ˏo引物k上下游引物混合lt
ˏo§‘×° ¬¬kts °°²¯#ptl s1x ˏoפ´ ⁄‘„聚合酶
kx ˜#ˏptls1x ˏo无核酶水 t| ˏo总反应体积 ux
ˏo同时以不加模板 • ‘„ 的反应体系进行 °≤• 扩
增作为空白对照 ∀ °≤• 反应参数为 }|w ε 预变性 u
°¬±~|w ε 变性 wx ¶o按照表 t退火温度退火 w ¶ozu
ε 延伸 t °¬±o循环次数见表 t o完成 °≤• 扩增 ~zu ε
最终延伸 z °¬±~w ε 保存待检 ~引物序列及扩增长
度见表 t ~…°≤• 产物琼脂糖凝胶电泳 }°≤• 产物在
t h琼脂糖凝胶上进行电泳 o以凝胶成像系统进行半
定量分析 o以 k׌°2tl  °2tvrŠ„°⁄‹ 比值表示
׌°2t和  °2tv °• ‘„的相对表达量 ∀
215 统计学处理 数据用 cξ ? σ表示 o采用方差分
析判断组间差异 ~经 ≥°≥≥ tu1s统计软件处理完成 o
以 Π s1sx为具有统计学意义 ∀
3 结果
表 t °≤• 引物序列 !扩增参数及引用文献
引物序列
扩增长度
r¥³
退火温度
r ε
循环
次数
Š„°⁄‹≈y  xχ2×≤≤≤×≤„„Š„×׊×≤„Š≤„„2vχ vsy xx vv
xχ2„Š„×≤≤„≤„„≤ŠŠ„ׄ≤„×× 2vχ
 °2tv≈z  xχ2ׄ≤≤ׄ≤„≤׊Š≤„„„„Š≤≤2vχ vxw xy vs
xχ2„׊×≤„ׄ„≤≤„××≤„Š„Š≤≤ 2vχ
׌°2t≈{  xχ2Š≤„„≤×≤≤ŠŠ„≤≤×׊×≤„×≤2vχ vuy xz vu
xχ2„Š≤Š×„ŠŠ×≤×׊Š×Š„„Š≤2vχ
v1t 动物一般情况 造模期间 o模型组共有 tt只
动物死亡k以上数据已经除去死亡大鼠l o恢复期间
无死亡 ∀正常组大鼠生长良好 o体重自然增长 o行走
正常 o活动敏捷 o食欲正常 o毛发整齐 o大便成形 ∀大
鼠注射 ≤≤¯ w后 o烦躁不安 o相互攻击 o弹跳力增强 o约
x °¬±后开始安静 o后腿拖地 o行动出现障碍 o大便溏
稀 ∀停止造模后 o各组大鼠体重开始缓慢增加 o烦躁
不安情绪消除 o安静 o嗜睡 o大便逐渐正常 ∀
312 大鼠肝脏形态 正常组大鼠肝脏 o颜色深红 o
表面光滑 o边缘锐利 o质地较软 ∀y周时 o模型组大
鼠肝脏左叶肿大 o边缘钝 o质地硬 o左叶颜色较浅 o但
边缘尚好 o整个肝脏与周围器官粘连广泛 ∀
313 肝纤维化分级 肝组织 ‹∞染色可见 }正常组
见图 t o大鼠肝组织肝索结构清晰 o肝细胞以中央静
脉为中心呈放射状排列 o肝组织内无脂肪空泡 ~模型
组见图 u o肝细胞变性坏死 o肝小叶结构紊乱 o胶原
纤维增生 o但是并未形成假小叶 o汇管区 !中央静脉
及肝窦有大量炎症细胞浸润 o极少量脂肪样变性 ∀
模型组肝纤维化分级的平均值为 u1y ? s1u o说明肝
纤维化已经形成 ∀
图 t 正常组大鼠肝脏 ‹∞染色k ≅ tssl
314 各组大鼠肝组织中  °2tv2׌°2t °• ‘„ 的
表达 各组大鼠肝组织  °2tv • ×2°≤• 产物琼脂
糖凝胶电泳图见图 v o经凝胶成像系统半定量分析
得可知 o °2tv在各组大鼠肝脏中的表达并无显著
性差异 ~׌°2t • ×2°≤• 产物琼脂糖凝胶电泳图见
图 w o经凝胶成像系统半定量分析可知 o与正常组相
比 o自然恢复组大鼠肝脏中 ׌°2t °• ‘„表达显著
升高k Π s1sxl o与自然恢复组相比 o对照组和给药
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组 ׌°2t°• ‘„表达均显著降低k Π s1sxl o且两组
之间比较存在显著性差异 o给药组 ׌°2t°• ‘„ 表
达均降低更显著k Π s1sxl ~ °2tvr׌°2t比值在
组别之间的差异性也存在 o °2tvr׌°2t比值的
差异性与 ׌°2t的差异性相应 ∀
图 u y周模型组大鼠肝脏 ‹∞染色k ≅ tssl
图 v  °2tv • ×2°≤• 产物琼脂糖凝胶电泳
t ∗ w }正常组 !自然恢复组 !对照组与给药组内参 ~x }°¤®¨µ~y ∗ | }
正常组 !自然恢复组 !对照组与给药组目的条带
图 w ׌°2t • ×2°≤• 产物琼脂糖凝胶电泳图
t ∗ w }正常组 !自然恢复组 !对照组与给药组内参 ~x }°¤®¨µ~y ∗ | }
正常组 !自然恢复组 !对照组与给药组目的条带
4 讨论
肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理基
础 o是肝脏细胞外基质k ¬¨·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ°¤·µ¬¬o∞≤l的
合成与降解失衡 !导致胶原纤维过度沉积≈t  o尤其是
´ o¶ o·型胶原过度增生沉积 !降解减少 o具有降解
细胞基质功能的金属蛋白酶k °¶l及其抑制因子
k׌°¶l在纤维化形成过程中发挥重要作用 ∀ ׌°2
t能结合除  °2tw o °2t|以外的所有  °¶而使
其活性降低 ∀  °2tvk胶原酶2vl o属于中性蛋白酶
一族 o专门降解 ´ o¶型胶原 o参与肝纤维化过程中
新形成的 ∞≤ 的降解≈| ots  ∀  °2tv由正常或活化
的肝星状细胞产生 oŽ∏³©©¨µ细胞也可以产生≈tt  ∀在
肝纤维化发展过程 o׌°2t 的表达增强 o °2tvr
׌°2t的比值下降 o基因不平衡表达增加了胶原纤
维的累积并促进肝纤维的发展 o是肝硬化形成的重
要决定因素≈tu  ∀
本实验结果表明 o °2tv °• ‘„ 在各组之间并
无显著性差异 o但是由于 ׌°2t °• ‘„ 表达在各组
之间存在显著性差异 o与正常组相比 o自然恢复组
׌°2t °• ‘„ 表达显著升高k Π s1sxl o׌°2t °•2
‘„升高大大抑制了  °2tv的活性导致胶原降解
减少 o最终形成肝纤维化 o而 ׌°2t °• ‘„ 在给药
组则比自然恢复组表达显著降低k Π s1sxl o即药
物抑制了 ׌°2t °• ‘„的表达 o这可能是药物能够
逆转肝纤维化的机制之一 ~对照组和给药组 ׌°2t
°• ‘„表达与正常组有显著性差异 o可能与治疗时
间有关 o给药时间越长 o药物的作用可能更显著 ∀对
照组和给药组组之间的比较可以得出 o给药组
׌°2t °• ‘„ 表达显著低于对照组 ׌°2t °• ‘„
表达 o显示出枳 子治疗肝纤维化的优势与潜力来 ∀
分析  °2tvr׌°2t 得出 o各组之间的  °2tvr
׌°2t比值也存在差异 o由此可见 o枳 子提取物
抗肝纤维化的机制可能是调整  °2tvr׌°2t比
值 o恢复胶原降解系统 o减轻肝纤维化程度 ∀
≈参考文献 
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≈u  ⁄²± ≤ q •²¦®¨ ¼ q各细胞成分在肝纤维化中的作用 q见 }王宝
恩 q肝病学新进展 ) ) ) 基础与临床 1 北京 }北京出版社 ot||y }
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≈w  张 洪 o刘秀玲 o文 为 q优化枳 子得提取工艺 1 华西药
学杂志 oussx ouskul }tut q
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⁄Œ¶²½¼° ¶¨  §¨¬¤·¨ ∞³¬ª¤¯ ¬¯¦¤·¨¦«¬± Š¤¯ ¤¯·¨2¬±§∏¦¨§≤¼¦¯²²¬¼ª¨ ±¤¶¨2
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≈z  王 宇 o高 毅 o杨继震 q实验性肝纤维化过程中间质胶原
酶表达的研究 q世界华人消化杂志 ot||| ozkttl }tssw q
≈{  …µ∏¦® • o Š¨ ±¬±¤ ’ o „¨¨§ ‹ o ·¨¤¯ q ‹¤¯²©∏ª¬±²±¨ ·² ³µ¨√¨ ±·¤±§
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·¬¤¯ ¦²¯ ¤¯ª¨ ±¤¶¨ ¬± ¥²·«³µ²ªµ¨¶¶¬√¨ ¤±§µ¨¦²√¨ µ¼ ³«¤¶¨ ²©µ¤·¯¬√¨ µ©¬2
¥µ²¶¬¶¬±§∏¦¨§¥¼ ¦¤µ¥²± ·¨·µ¤¦«¯²µ¬§¨ q ‹ ³¨¤·²¯ ousss ovv }uuw q
≈ts  …¨ ±±¨ · • Š o Ž«¤µ¥¤±§¤ ŽŽo×∏°¤ ⁄ qŒ±«¬¥¬·¬²± ²© °¤µ®¨µ¶²©
«¨ ³¤·¬¦¶·¨¯ ¤¯·¨ ¦¨¯¯ ¤¦·¬√¤·¬²± ¥¼·«¨ «²µ°²±¨ µ¨ ¤¯¬¬±q…¬²¦«¨ ° °«¤µ2
°¤¦²¯ oussv oyy }{yz q
≈tt  ‹¬µ²±¤®¤ Žo≥¤®¤¬§¤Œo ¤·¶∏°∏µ¤ ≠ o ·¨¤¯ q ∞±«¤±¦¨§¬±·¨µ¶·¬·¬¤¯
¦²¯ ¤¯ª¨ ±¤¶¨ k°¤·µ¬¬ ° ·¨¤¯ ²¯³µ²·¨¬±¤¶¨2tvl ³µ²§∏¦·¬²± ²© ®∏³©©¨µ¦¨¯¯
¥¼ ª¤§²¯¬±¬∏° ¦«¯²µ¬§¨ ³µ¨√ ±¨·¶³¬ª¶¨µ∏° ¬±§∏¦¨§µ¤·¯¬√ µ¨©¬¥µ²¶¬¶q
…¬²¦«¨ ° …¬²³«¼¶• ¶¨≤²°°∏±ousss ouyz }u|s1
≈tu  黄宇琦 o高 毅 o陈泽洪 o等 q间质胶原酶及其抑制因子2t
不平衡表达与肝纤维化的关系 q第一军医大学学报 ot||| ot| }
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Εφφεχτ οφ Ηοϖενια δυλχισ εξτραχτ ον εξπρεσσιον οφ
ΜΜΠ2tv ανδ ΤΙΜΠ2t ιν ηεπατιχ τισσυε
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(t1 ∆επαρτµεντ οφ Πηαρµαχψ, Ρενµιν Ηοσπιταλ, Ωυηαν Υνιϖερχιτψ, Ωυηαν wvssys , Χηινα ;
u1 ∆επαρτµεντ οφ Πηαρµαχψ, Ωυηαν Υνιϖερχιτψ, Ωυηαν wvsszu , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ©¨©¨¦·¶²© Ηοϖενια δυλχισ ¬¨·µ¤¦·²± °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©  °2tv ¤±§×Œ°2t °• ‘„¬± «¨ ³2
¤·¬¦·¬¶¶∏¨ ¬± ¬¨³¨µ¬° ±¨·¤¯ µ¤·¶q Μετηοδ : w{ °¤¯¨ ≥³µ¤ª∏¨2⁄¤º¯ ¼¨ µ¤·¶º µ¨¨ µ¤±§²°¯ ¼ §¬√¬§¨§¬±·² u ªµ²∏³¶}±²µ°¤¯ ªµ²∏³ktyl ¤±§ °²§¨¯
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²©×Œ°2t °• ‘„ º µ¨¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ ¬±¦µ¨¤¶¨§¬± ¦²±·µ²¯ ªµ²∏³¤±§ ° §¨¬¦¤·¬²± ¤§°¬±¬¶·µ¤·¬²± ªµ²∏³¦²°³¤µ¨§oº¬·«·«²¶¨ ¬±·«¨ °²§¨¯ ªµ²∏³
k Π s1sxl o¤±§µ¨√ µ¨¶¨ ©¨©¨¦·¶²© ° §¨¬¦¤·¬²± ¤§°¬±¬¶·µ¤·¬²± ªµ²∏³¶º µ¨¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ «¬ª«·«¤±·«²¶¨ ²©¦²±·µ²¯ ªµ²∏³k Π s1sxl qΧονχλυ2
σιον : Œ±«¬¥¬·¬²± ²©·«¨ °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©×Œ°2t °¤¼ ¥¨ ·«¨ ° ¦¨«¤±¬¶° ²©µ¨√ µ¨¶¬±ª«¨ ³¤·¬¦©¬¥µ²¶¬¶ Η . δυλχισo©²µ·«∏¶¦²¯ ²¯ª¨ ± §¨ªµ¤§¤2
·¬²±¶¼¶·¨° º¤¶µ¨¦²√ µ¨¬¨§ªµ¤§∏¤¯ ¼¯ q
[ Κεψ ωορδσ] Ηοϖενια δυλχισ~«¨ ³¤·¬¦©¬¥µ²¶¬¶~°¤·µ¬¬ ° ·¨¤¯ ²¯³µ²·¨¬±¤¨2tvk °2tvl ~·¬¶¶∏¨ ¬±«¬¥¬·²µ²© ° ·¨¤¯ ²¯³µ²·¨¬±¤¶¨2tk׌°2tl
≈责任编辑 刘  
≈收稿日期  ussy2st2us
≈通讯作者  3黄成 oר¯ }ksuxl{vx|vv{|
沙棘籽油和果油对小鼠实验性肝损伤的
保护作用及对比研究
刘 超 o徐 婧 o叶存奇 o黄 成 3
k南京大学 生命科学学院 o江苏 南京 utss|vl
≈摘要  目的 }对比沙棘籽油和果汁油对肝损伤小鼠的影响 ∀方法 }采用四氯化碳致小鼠肝损伤模型 o分别喂
以不同浓度的沙棘籽油和果油 owx §后检测小鼠血清中谷丙转氨酶k„×l和肝脏中超氧化物歧化酶k≥’⁄l的活力变
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第 vt卷第 tv期
ussy年 z月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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