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Studies on fingerprinting and identification of main species of Herba Epimedii

淫羊藿属主要资源种类的HPLC指纹图谱特征和种类鉴定



全 文 :·研究论文·
淫羊藿属主要资源种类的 HPLC指纹图谱
特征和种类鉴定
裴利宽,郭宝林,黄文华
(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100094)
[摘要] 目的:淫羊藿的物种鉴定一直是中药材研究和应用中比较困难的问题,本实验旨在尝试建立一种淫
羊藿药材物种鉴定方法。方法:对淫羊藿Epimediumbrevicornu、箭叶淫羊藿E.sagitatum、柔毛淫羊藿E.pubescens、
朝鲜淫羊藿E.koreanum、巫山淫羊藿E.wushanense、粗毛淫羊藿E.acuminatum、天平山淫羊藿E.myrianthum和黔
岭淫羊藿E.leptorhizum等8个淫羊藿药材主要来源物种,以及淫羊藿属的其他24个物种中黄酮类成分的 HPLC
指纹图谱进行了研究,提取可用于种类鉴定的特征。结果与结论:朝鲜淫羊藿具有的 HPLC指纹特征,可以区别于
其他物种,心叶淫羊藿、粗毛淫羊藿、天平山淫羊藿的大部分样品也具有可资鉴别的指纹特征,而柔毛淫羊藿和黔
岭淫羊藿种内图谱模式相对稳定,但是难以与其他物种区别,箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿则种内图谱变化十分复杂。
本研究也展示出淫羊藿药材质量极其不稳定。
[关键词] 淫羊藿药材;鉴定;HPLC指纹图谱;黄酮类成分
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)14166207
[收稿日期] 20070530
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30270101)
[通讯作者] 郭宝林,Tel:(010)62895049,Email:guobaolin
010@yahoo.com.cn
  《中国药典》规定中药淫羊藿来源于淫羊藿
EpimediumbrevicornuMaxim.(为避免名称使用混
乱,下文称心叶淫羊藿)、箭叶淫羊藿 E.sagitatum
(Sieb.etZucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿 E.pubescens
Maxim.、朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai和巫山淫羊
藿E.wushanenseT.S.Ying等5个种,《贵州省中
药材、民族药材标准》收载了黔产淫羊藿中资源量
较大的粗毛淫羊藿 E.acuminatumFranch.、天平山
淫羊藿E.myrianthumStearn、黔岭淫羊藿E.leptor
rhizumStearn(毡毛淫羊藿E.coactumH.R.Liang&
W.M.Yan被作者并入天平山淫羊藿讨论,光叶淫
羊藿 E.sagitatumvar.glabratumT.S.Ying并入
箭叶淫羊藿讨论 )等,这8个种类构成了中药淫羊
藿使用的主要资源种类。此外我国还分布有近40
个淫羊藿属的其他物种,由于形态鉴别困难,除了茂
汶淫羊藿 E.platypetalum、小叶淫羊藿 E.elachy
phylum、宽萼淫羊藿 E.latisepalum、芦山淫羊藿 E.
ogisui等分布极其狭窄的种类外,均在一定范围内
使用和流通[12],淫羊藿物种来源的准确鉴定一直是
中药材研究和应用中比较困难的问题,也是本课题
组一直关注的问题,作者利用IR光谱指纹进行鉴定
取得了有意义的结果[3],本实验报道的是 HPLC指
纹图谱在鉴定方面的研究。
2003年黄朝瑜等首次报道了淫羊藿药材的指
纹图谱,研究了1个样品,认定淫羊藿药材中7个有
意义的共有峰占总出峰面积的90%[4],2004年郭青
等研究了药典收载的5种淫羊藿,每种各1个样品,
对核心组峰中6个峰的相对保留时间和峰面积进行
了计算,并认为这些参数可以鉴别不同的物种[5],
2005年易中宏等研究了重庆产的巫山淫羊藿不同
部位的指纹图谱,发现根部位的图谱与叶和茎的图
谱差别很大[6],2006年王丽霞等研究了采自陕西秦
岭以南的3种4份药材的指纹图谱,提取了12个色
谱峰,认为其中的9个色谱峰组成的图谱可以作为
秦岭山区淫羊藿药材的色谱指纹图谱特征[7]。本
实验则在研究方法上增加了谱图覆盖的极性范围,
梯度洗脱的流动相中乙腈的浓度最后达到100%,
因此谱图包括了极性更小成分苷元的存在情况,提
供更多的指纹信息;另外增加了研究样品数量,8个
主要资源种类,每种多个样品来源,范围覆盖了它们
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在全国的主要分布区,因而可以有比较好的代表性,
易混淆样品也包括了经准确定名的淫羊藿属大多数
种类,因此便于提取可靠的鉴别特征。
1 材料
仪器和试剂参见文献[8]。
对照品:淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所,
批号110737200312),大花淫羊藿苷,淫羊藿苷 A,
朝藿定A,朝藿定B,朝藿定 C,大花淫羊藿苷 F,大
花淫羊藿苷A,箭藿苷 B,宝藿苷Ⅰ等,均从该属植
物中提取分离,并经光谱鉴定[910]。
样品:共研究了淫羊藿属32个物种。常用的8
个种的样品数量分别为:朝鲜淫羊藿10个,心叶淫
羊藿14个,柔毛淫羊藿9个,箭叶淫羊藿 15个,巫
山淫羊藿14个(包括分布于贵州黔东南拟巫山淫
羊藿[11]4个),粗毛淫羊藿13个,天平山淫羊藿 22
个,黔岭淫羊藿7个。这8个种的样品来源的主要
部分见文献[8],补充部分及其他物种的情况见表
1。全部由郭宝林研究员鉴定,凭证标本存放于中国
医学科学院药用植物研究所(IMD)。每一号样品随
机取10株个体,每株1枚叶片,变色硅胶干燥后用
研钵粉碎,过40目筛,存放于干燥器中大于24h。
2 实验方法[8]
色谱条件:色谱柱为 VenusilASBC18(46
mm×250mm,5μm,美国AGT公司),保护柱为 Se
curityGuard(美国Phenomenex公司);流动相 乙腈
水溶剂系统梯度洗脱,0~24min(乙腈比例25% ~
27%),24~43min(27% ~48%),43~63min
(48%~80%),63~69min(80% ~100%),洗脱
时间70min,流速10mL·min-1,柱温常温,进样
量10μL,检测波长272nm。
供试品溶液制备:分别取约01g淫羊藿叶片
干燥粉末,加入10mL70%乙醇,超声30min,放至
室温,补足失重;过滤,取续滤液 2mL,置蒸发皿
中,80℃水浴挥干;残渣用甲醇溶解,置2mL量瓶
中,定容,摇匀;过微孔滤膜(045μm),即得供试品
溶液。
3 结果和讨论
3.1 图谱波长的选择
淫羊藿中结构类似的不同黄酮类化合物最大吸
收波长稍有差异,从268nm~274nm,本研究选取
中间的272nm作为检测波长。
3.2 图谱特征随季节变化的考察
表1 补充的淫羊藿样品来源
物种名称 No. 采集时间 采集地点
 柔毛淫羊藿 0606 20060504 四川什邡
Epimediumpubescens    
  0616 20060513 四川洪雅
木鱼坪淫羊藿 E.francheti 0433 20040409 湖北建始
  0435 20040409 湖北兴山
  0436 20040410 湖北神农架
川鄂淫羊藿 E.fargesi 0448 20040414 重庆巫溪
单叶淫羊藿 E.simplicifolium 0343 20030725 贵州绥阳
  0345 20030727 贵州赤水
保靖淫羊藿 E.baojingense 0332 20030418 湖南吉首
  0414 20040405 贵州万山
竹山淫羊藿 E.zhushanense 0444 20040413 湖北竹山
湖南淫羊藿 E.hunanense 0402 20040328 湖南新宁
  0512 20050422 广西龙胜
  0513 20050424 广西资源
宝兴淫羊藿 E.davidi 0532 20050507 四川理县
  0537 20050512 四川宝兴
四川淫羊藿 E.sutchuenense 0437 20040410 湖北神农架
  0438 20040410 湖北房县
薄叶淫羊藿 E.membranaceum 0529 20050506 四川茂县
  0536 20050511 四川什邡
偏斜淫羊藿 E.truncatum 0419 20040404 湖北张家界
长蕊淫羊藿 E.dolichostemon 0428 20040408 湖北利川
直距淫羊藿 E.mikinori 0431 20040408 湖北恩施
 腺毛淫羊藿 0449 20040414 重庆巫溪
E.glandulosopilosum      
时珍淫羊藿 E.lishihcheni 0503 20050331 江西庐山
少花淫羊藿 E.pauciflorum 0531 20050506 四川茂县
无距淫羊藿 E.ecalcaratum 0539 20050513 四川宝兴
恩施淫羊藿 E.enshiense 89013 19890505 湖北恩施
德务淫羊藿 E.dewuense 0339 20030421 贵州德江
天全淫羊藿 E.flavum 0609 20060506 四川天全
茂汶淫羊藿 E.platypetalum 0611 20060507 四川泸定
南郑淫羊藿 E.nanzhengense1) 0458 20040417 四川南江
镇巴淫羊藿 E.zhenbaense1) 0460 20040418 陕西镇巴
 青城山淫羊藿 0534 20050509 四川都江堰
E.qingchengshanense2)      
 贵西淫羊藿 0301 20030320 贵州晴隆
E.myrianthumvar.      
guizhouense1)      
  0348 20030731 贵州普定
  0349 20031206 贵州紫云
  注:1)未发表;2)已发表,见文献[11]
考察了生长于南方的几个常绿物种(粗毛淫羊
藿、巫山淫羊藿等)的当年新叶片和存留的前一年
老叶片的指纹图谱,发现提取的特征类型没有差别。
3.3 淫羊藿药材的总体图谱特征
10个对照品的HPLC图谱中化合物峰1,2,7,8
一般较少出现或色谱峰很小(图1)。
  淫羊藿药材的HPLC图谱主要由4组色谱峰构
成(图2)。第1组峰,保留时间 tR<10min,该组峰
特征性不强。第2组峰,15min<tR<25min,以朝
藿定A(3)、朝藿定 B(4)、朝藿定 C(5)、淫羊藿苷
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1.大花淫羊藿苷(IkarisosideC);2.淫羊藿苷A(epimedosideA);3.朝藿定A(epimedinA);4.朝藿定B(epimedinB);5.朝藿定C(epimedinC);
6.淫羊藿苷(icarin);7.大花淫羊藿苷F(ikarisosideF);8.大花淫羊藿苷A(ikarisosideA);9.箭藿苷B(sagitatosideB);10.宝藿苷Ⅰ(baohuosideⅠ)
图1 对照品HPLC图
1.第1组峰;2.第2组峰(ACBI组峰);3.第3组峰(SB组峰);4.第4组峰(K组峰)
图2 淫羊藿HPLC图谱主要构成(粗毛淫羊藿)
(6)为主构成,简称为“ABCI组峰”,一些样品中会
出现未知峰A和D,少量样本中还包括有未知峰 B
和C(图3),其中峰3~6是淫羊藿中所含的最主要
的淫羊藿苷类成分,因此本组峰是最重要的一组峰,
各峰的构成和相对强弱在种内常较稳定,因而具有
特征性。第3组峰,42min<tR<52min,以箭藿苷
B(9号峰)和宝藿苷Ⅰ(10号峰)为主峰,简称“SB
组峰”,一般还包括其他未知峰,如H,I峰等(图3),
这组峰也较普遍存在,但是峰9和峰10的高低在各
物种的种内常有较大变异,也较少有特征性。第4
组峰,tR>60min,一般由1到多个弱峰组成,有些
样品中此处无峰,如有强峰即以未知峰 K峰为主,
简称“K组峰”,这组峰仅在某些种内具有特征性
(表2)。
a.天平山淫羊藿;b.朝鲜淫羊藿;c.粗毛淫羊藿
图3 样品HPLC图谱中有意义的未知峰及定位;各峰编号见表2(图4~8同)
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表2 已知峰和常见未知峰的指定
峰编号 化合物 tR 峰编号 化合物 tR
A 未知 0644 F 未知 1566
3 朝藿定A 0717 G 未知 1704
B 未知 0769 H 未知 0964
4 朝藿定B 0798 9 箭藿苷B 1000
C 未知 0833 I 未知 0936
5 朝藿定C 0873 10 宝藿苷Ⅰ 1064
D 未知 0936 J 未知 1518
6 淫羊藿苷 1000 K 未知 1330
E 未知 1518      
  注:峰3~6,A~G相对保留时间以峰6为参照;峰 9~10,H~I
相对保留时间以峰9为参照
3.4 8个主要种类的HPLC指纹鉴别特征
3.4.1 朝鲜淫羊藿 所有朝鲜淫羊藿样品均具有
明显的未知峰 E,F,G和 J(个别样品 J峰不明显),
而这4个峰在已研究的淫羊藿属其他种类都没有,
属于朝鲜淫羊藿的独有特征峰,具有重要的鉴别意
义。另外“ABCI组峰”的特点是:峰5最低,峰6最
高,峰3与其他物种相比相对峰高较高(图 3,4)。
这些特征一般不受采集时间和存放时间的影响。
3.4.2 心叶淫羊藿 心叶淫羊藿 14个样品的
HPLC图谱结果显示,“ABCI组峰”中,一般峰4最
高,且显著高于其他色谱峰,峰4较高的情况仅见于
朝鲜淫羊藿,仅山西沁水(A110)和永济(0556)的样
品峰4仅比峰5略高,河南嵩县(0552)样品峰4与
峰6高度相当。然而甘肃武山(0558)和岷县
(0559)样品峰5,6却明显高于峰4,这种例外情况
的是否普遍值得进一步研究。此外所有样品的“K
组峰”中,为弱的“小三峰”,而淫羊藿属其他种类均
为“小双峰”,但是因为是弱峰,特征性不甚显著。
心叶淫羊藿的 HPLC指纹图谱具有特征性,但
是不如朝鲜淫羊藿特征性强,仍然基本可资鉴别,种
内图谱有一些变化(图5)。
图4 朝鲜淫羊藿样品89021(a)和EKmj(b)的HPLC图
图5 心叶淫羊藿样品0552(a)和0560(b)的HPLC图
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3.4.3 柔毛淫羊藿 柔毛淫羊藿 9个样品中,
“ABCI组峰”中,峰5和峰6高于其他峰,峰5为
最高峰,但陕西南郑 (0456)和四川成都 (0533)
的峰6与峰5高度几乎相等或者前者略高。柔毛淫
羊藿HPLC图谱属于淫羊藿属物种常见图谱类型
(即 “ABCI组峰”中,峰5高于其他峰),因此与
其他物种相比缺乏特征性,而且种内也存在少许变
异 (图6)。
图6 柔毛淫羊藿样品0456(a)和0457(b)的HPLC图
3.4.4 箭叶淫羊藿 箭叶淫羊藿是淫羊藿属中分
布范围最广的一个种,作者收集了包括其变种光叶
淫羊藿在内的共 17个不同产地的样品,不同样品
HPLC图谱差别很大,类型多样:9个样品(0403,
0515,0516,Safujian,0510,0338,0425)在”ABCI组
峰”和“SB组峰”的位置处仅有极少数强峰,且在峰
的数量、位置和强弱有所不同;4个样品(0502,
0506,0507,0508)在”ABCI组峰”和“SB组峰”的位
置处几乎无明显色谱峰;2个样品(0509,0514)属于
常规类型,即“ABCI组峰”中,峰5高于其他峰。2
个样品(0501,89011)类似于天平山淫羊藿(图7)。
因此箭叶淫羊藿无法提取HPLC图谱鉴别特征。
图7 箭叶淫羊藿样品0514(a),0403(b),safujian(c)和0508(d)的HPLC图谱
3.4.5 巫山淫羊藿 巫山淫羊藿的分布范围较小,
但不同样品间变异仍然很大,无法提取特定的
HPLC图谱鉴别特征(图8)。
3.4.6 天平山淫羊藿 天平山淫羊藿22个不同的
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图8 巫山淫羊藿样品0434(a),89001(b)和0526(c)的HPLC图
样品图谱特征,可以归纳为,“ABCI组峰”中,A,B,
C,D4个未知峰很明显,有时强于临近的3~6号已
知峰,因此此组峰看起来比较复杂,这种情况在淫羊
藿属其他物种中很少存在,仅见于心叶淫羊藿、宝兴
淫羊藿和湖南淫羊藿的个别样品;“ABCI组峰”中,
峰5为最强峰。部分样品峰形简单,全部谱图仅由
1~4个主峰构成,如样品0316,0319,0320,0522;还
有个别样品(0421)谱图类型和淫羊藿属大多数物
种的类型一样。天平山淫羊藿 HPLC图谱以“ABCI
组峰”构成较为复杂为特征(图3,9)。
图9 天平山淫羊藿样品0407(a),0415(b)的HPLC图
3.4.7 粗毛淫羊藿 粗毛淫羊藿13个不同样品以
具有明显的 K峰以及附近多数复杂的小峰为特征
(仅0305和04622个样品的 K组峰不明显),在淫
羊藿属其他样品中,仅在黔岭淫羊藿和天平山淫羊
藿的个别样品中 K峰较为明显。各样品的“ABCI
组峰”也极为相似,所以粗毛淫羊藿的HPLC谱图特
征性较强(图2)。
3.4.8 黔岭淫羊藿 黔岭淫羊藿7个样品HPLC图
谱在”ABCI组峰”和“SB组峰”的位置处均无明显的色
谱峰,但是在淫羊藿属植物中,具有该种类型色谱图的
还有木鱼坪淫羊藿、保靖淫羊藿、竹山淫羊藿、恩施淫
羊藿等多个物种,在箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿等物种中
也有这种类型存在,因此不具有鉴别特征性(图10)。
4 结论
淫羊藿的HPLC指纹图谱在药用种类的种间和
种内呈现比较复杂的变化,本研究基于各物种主要
分布区大量的研究样品,提取出一些物种的鉴别特
征,有助于这些物种的鉴定。
得到的HPLC指纹图谱也显示出淫羊藿药材因
物种来源不同,质量差异很大(有些物种内差异也
很大,如箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿),作者曾经尝试
用推荐使用的指纹图谱相似软件进行一致度分析,
大多数物种种内一致度很低,因此实现淫羊藿药材
的质量控制将有很长的路要走。
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图10 黔岭淫羊藿样品0411(a),0420(b)的HPLC图谱
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Studiesonfingerprintingandidentificationofmainspeciesof
HerbaEpimedi
PEILikuan,GUOBaolin,HUANGWenhua
(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege,
Beijing100094,China)
[Abstract] Objective:ToestablishanefectivemethodfortheidentificationofHerbaEpimedi.Method:TheHPLCfinger
printsof8oficinalspeciesincluding5speciesrecordedin‘ChinesePharmacopoeia’,whichareEpimediumbrevicornu,E.sagita
tum,E.pubescens,E.koreanumandE.wushanense,andtheother3species,E.acuminatum,E.myrianthumandE.leptorhizum,
recordedin‘GuizhouQualityCriteriaforTraditionalChineseMedicalMaterialandNationalityMedicalMaterial’,andofother24spe
ciesingenusEpimediuminChinaaswelhadbeenanalyzedandsomefingerprintingfeaturesfortheidentificationhadbeenpointed
out.ResultandConclusion:ThefingerprintingfeaturesofE.koreanumareratherdiferentfromothersandcanbeusedforthespe
ciesidentification.TherearesomecommonfingerprintingfeaturesinthemostsamplesofE.brevicornu,E.acuminatumandE.myri
anthum,respectively,andthesefeaturesareseldomfoundinthesamplesofotherspecies.TheHPLCfingerprintsofE.pubescensand
E.leptorhizumappearsteadilyamongalsamplesofthespeciesrespectively,butitisdificulttodistinguishthespceciesfromother
specieswiththeHPLCfingerprintsonly.TheHPLCfingerprintsofE.sagitatumandE.wushanensevarygreatlywithinthespecies.It
isalsoshowedthatthequalityofHerbaEpimedivariedsignificantlyaccordingtotheHPLCfeatures.
[Keywords] HerbaEpimedi;identification;HPLCfingerprinting;flavonoids
[责任编辑 吕冬梅]
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