全 文 :·研究论文·
淫羊藿属主要资源种类的 HPLC指纹图谱
特征和种类鉴定
裴利宽,郭宝林,黄文华
(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100094)
[摘要] 目的:淫羊藿的物种鉴定一直是中药材研究和应用中比较困难的问题,本实验旨在尝试建立一种淫
羊藿药材物种鉴定方法。方法:对淫羊藿Epimediumbrevicornu、箭叶淫羊藿E.sagitatum、柔毛淫羊藿E.pubescens、
朝鲜淫羊藿E.koreanum、巫山淫羊藿E.wushanense、粗毛淫羊藿E.acuminatum、天平山淫羊藿E.myrianthum和黔
岭淫羊藿E.leptorhizum等8个淫羊藿药材主要来源物种,以及淫羊藿属的其他24个物种中黄酮类成分的 HPLC
指纹图谱进行了研究,提取可用于种类鉴定的特征。结果与结论:朝鲜淫羊藿具有的 HPLC指纹特征,可以区别于
其他物种,心叶淫羊藿、粗毛淫羊藿、天平山淫羊藿的大部分样品也具有可资鉴别的指纹特征,而柔毛淫羊藿和黔
岭淫羊藿种内图谱模式相对稳定,但是难以与其他物种区别,箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿则种内图谱变化十分复杂。
本研究也展示出淫羊藿药材质量极其不稳定。
[关键词] 淫羊藿药材;鉴定;HPLC指纹图谱;黄酮类成分
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)14166207
[收稿日期] 20070530
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30270101)
[通讯作者] 郭宝林,Tel:(010)62895049,Email:guobaolin
010@yahoo.com.cn
《中国药典》规定中药淫羊藿来源于淫羊藿
EpimediumbrevicornuMaxim.(为避免名称使用混
乱,下文称心叶淫羊藿)、箭叶淫羊藿 E.sagitatum
(Sieb.etZucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿 E.pubescens
Maxim.、朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai和巫山淫羊
藿E.wushanenseT.S.Ying等5个种,《贵州省中
药材、民族药材标准》收载了黔产淫羊藿中资源量
较大的粗毛淫羊藿 E.acuminatumFranch.、天平山
淫羊藿E.myrianthumStearn、黔岭淫羊藿E.leptor
rhizumStearn(毡毛淫羊藿E.coactumH.R.Liang&
W.M.Yan被作者并入天平山淫羊藿讨论,光叶淫
羊藿 E.sagitatumvar.glabratumT.S.Ying并入
箭叶淫羊藿讨论 )等,这8个种类构成了中药淫羊
藿使用的主要资源种类。此外我国还分布有近40
个淫羊藿属的其他物种,由于形态鉴别困难,除了茂
汶淫羊藿 E.platypetalum、小叶淫羊藿 E.elachy
phylum、宽萼淫羊藿 E.latisepalum、芦山淫羊藿 E.
ogisui等分布极其狭窄的种类外,均在一定范围内
使用和流通[12],淫羊藿物种来源的准确鉴定一直是
中药材研究和应用中比较困难的问题,也是本课题
组一直关注的问题,作者利用IR光谱指纹进行鉴定
取得了有意义的结果[3],本实验报道的是 HPLC指
纹图谱在鉴定方面的研究。
2003年黄朝瑜等首次报道了淫羊藿药材的指
纹图谱,研究了1个样品,认定淫羊藿药材中7个有
意义的共有峰占总出峰面积的90%[4],2004年郭青
等研究了药典收载的5种淫羊藿,每种各1个样品,
对核心组峰中6个峰的相对保留时间和峰面积进行
了计算,并认为这些参数可以鉴别不同的物种[5],
2005年易中宏等研究了重庆产的巫山淫羊藿不同
部位的指纹图谱,发现根部位的图谱与叶和茎的图
谱差别很大[6],2006年王丽霞等研究了采自陕西秦
岭以南的3种4份药材的指纹图谱,提取了12个色
谱峰,认为其中的9个色谱峰组成的图谱可以作为
秦岭山区淫羊藿药材的色谱指纹图谱特征[7]。本
实验则在研究方法上增加了谱图覆盖的极性范围,
梯度洗脱的流动相中乙腈的浓度最后达到100%,
因此谱图包括了极性更小成分苷元的存在情况,提
供更多的指纹信息;另外增加了研究样品数量,8个
主要资源种类,每种多个样品来源,范围覆盖了它们
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在全国的主要分布区,因而可以有比较好的代表性,
易混淆样品也包括了经准确定名的淫羊藿属大多数
种类,因此便于提取可靠的鉴别特征。
1 材料
仪器和试剂参见文献[8]。
对照品:淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所,
批号110737200312),大花淫羊藿苷,淫羊藿苷 A,
朝藿定A,朝藿定B,朝藿定 C,大花淫羊藿苷 F,大
花淫羊藿苷A,箭藿苷 B,宝藿苷Ⅰ等,均从该属植
物中提取分离,并经光谱鉴定[910]。
样品:共研究了淫羊藿属32个物种。常用的8
个种的样品数量分别为:朝鲜淫羊藿10个,心叶淫
羊藿14个,柔毛淫羊藿9个,箭叶淫羊藿 15个,巫
山淫羊藿14个(包括分布于贵州黔东南拟巫山淫
羊藿[11]4个),粗毛淫羊藿13个,天平山淫羊藿 22
个,黔岭淫羊藿7个。这8个种的样品来源的主要
部分见文献[8],补充部分及其他物种的情况见表
1。全部由郭宝林研究员鉴定,凭证标本存放于中国
医学科学院药用植物研究所(IMD)。每一号样品随
机取10株个体,每株1枚叶片,变色硅胶干燥后用
研钵粉碎,过40目筛,存放于干燥器中大于24h。
2 实验方法[8]
色谱条件:色谱柱为 VenusilASBC18(46
mm×250mm,5μm,美国AGT公司),保护柱为 Se
curityGuard(美国Phenomenex公司);流动相 乙腈
水溶剂系统梯度洗脱,0~24min(乙腈比例25% ~
27%),24~43min(27% ~48%),43~63min
(48%~80%),63~69min(80% ~100%),洗脱
时间70min,流速10mL·min-1,柱温常温,进样
量10μL,检测波长272nm。
供试品溶液制备:分别取约01g淫羊藿叶片
干燥粉末,加入10mL70%乙醇,超声30min,放至
室温,补足失重;过滤,取续滤液 2mL,置蒸发皿
中,80℃水浴挥干;残渣用甲醇溶解,置2mL量瓶
中,定容,摇匀;过微孔滤膜(045μm),即得供试品
溶液。
3 结果和讨论
3.1 图谱波长的选择
淫羊藿中结构类似的不同黄酮类化合物最大吸
收波长稍有差异,从268nm~274nm,本研究选取
中间的272nm作为检测波长。
3.2 图谱特征随季节变化的考察
表1 补充的淫羊藿样品来源
物种名称 No. 采集时间 采集地点
柔毛淫羊藿 0606 20060504 四川什邡
Epimediumpubescens
0616 20060513 四川洪雅
木鱼坪淫羊藿 E.francheti 0433 20040409 湖北建始
0435 20040409 湖北兴山
0436 20040410 湖北神农架
川鄂淫羊藿 E.fargesi 0448 20040414 重庆巫溪
单叶淫羊藿 E.simplicifolium 0343 20030725 贵州绥阳
0345 20030727 贵州赤水
保靖淫羊藿 E.baojingense 0332 20030418 湖南吉首
0414 20040405 贵州万山
竹山淫羊藿 E.zhushanense 0444 20040413 湖北竹山
湖南淫羊藿 E.hunanense 0402 20040328 湖南新宁
0512 20050422 广西龙胜
0513 20050424 广西资源
宝兴淫羊藿 E.davidi 0532 20050507 四川理县
0537 20050512 四川宝兴
四川淫羊藿 E.sutchuenense 0437 20040410 湖北神农架
0438 20040410 湖北房县
薄叶淫羊藿 E.membranaceum 0529 20050506 四川茂县
0536 20050511 四川什邡
偏斜淫羊藿 E.truncatum 0419 20040404 湖北张家界
长蕊淫羊藿 E.dolichostemon 0428 20040408 湖北利川
直距淫羊藿 E.mikinori 0431 20040408 湖北恩施
腺毛淫羊藿 0449 20040414 重庆巫溪
E.glandulosopilosum
时珍淫羊藿 E.lishihcheni 0503 20050331 江西庐山
少花淫羊藿 E.pauciflorum 0531 20050506 四川茂县
无距淫羊藿 E.ecalcaratum 0539 20050513 四川宝兴
恩施淫羊藿 E.enshiense 89013 19890505 湖北恩施
德务淫羊藿 E.dewuense 0339 20030421 贵州德江
天全淫羊藿 E.flavum 0609 20060506 四川天全
茂汶淫羊藿 E.platypetalum 0611 20060507 四川泸定
南郑淫羊藿 E.nanzhengense1) 0458 20040417 四川南江
镇巴淫羊藿 E.zhenbaense1) 0460 20040418 陕西镇巴
青城山淫羊藿 0534 20050509 四川都江堰
E.qingchengshanense2)
贵西淫羊藿 0301 20030320 贵州晴隆
E.myrianthumvar.
guizhouense1)
0348 20030731 贵州普定
0349 20031206 贵州紫云
注:1)未发表;2)已发表,见文献[11]
考察了生长于南方的几个常绿物种(粗毛淫羊
藿、巫山淫羊藿等)的当年新叶片和存留的前一年
老叶片的指纹图谱,发现提取的特征类型没有差别。
3.3 淫羊藿药材的总体图谱特征
10个对照品的HPLC图谱中化合物峰1,2,7,8
一般较少出现或色谱峰很小(图1)。
淫羊藿药材的HPLC图谱主要由4组色谱峰构
成(图2)。第1组峰,保留时间 tR<10min,该组峰
特征性不强。第2组峰,15min<tR<25min,以朝
藿定A(3)、朝藿定 B(4)、朝藿定 C(5)、淫羊藿苷
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1.大花淫羊藿苷(IkarisosideC);2.淫羊藿苷A(epimedosideA);3.朝藿定A(epimedinA);4.朝藿定B(epimedinB);5.朝藿定C(epimedinC);
6.淫羊藿苷(icarin);7.大花淫羊藿苷F(ikarisosideF);8.大花淫羊藿苷A(ikarisosideA);9.箭藿苷B(sagitatosideB);10.宝藿苷Ⅰ(baohuosideⅠ)
图1 对照品HPLC图
1.第1组峰;2.第2组峰(ACBI组峰);3.第3组峰(SB组峰);4.第4组峰(K组峰)
图2 淫羊藿HPLC图谱主要构成(粗毛淫羊藿)
(6)为主构成,简称为“ABCI组峰”,一些样品中会
出现未知峰A和D,少量样本中还包括有未知峰 B
和C(图3),其中峰3~6是淫羊藿中所含的最主要
的淫羊藿苷类成分,因此本组峰是最重要的一组峰,
各峰的构成和相对强弱在种内常较稳定,因而具有
特征性。第3组峰,42min<tR<52min,以箭藿苷
B(9号峰)和宝藿苷Ⅰ(10号峰)为主峰,简称“SB
组峰”,一般还包括其他未知峰,如H,I峰等(图3),
这组峰也较普遍存在,但是峰9和峰10的高低在各
物种的种内常有较大变异,也较少有特征性。第4
组峰,tR>60min,一般由1到多个弱峰组成,有些
样品中此处无峰,如有强峰即以未知峰 K峰为主,
简称“K组峰”,这组峰仅在某些种内具有特征性
(表2)。
a.天平山淫羊藿;b.朝鲜淫羊藿;c.粗毛淫羊藿
图3 样品HPLC图谱中有意义的未知峰及定位;各峰编号见表2(图4~8同)
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表2 已知峰和常见未知峰的指定
峰编号 化合物 tR 峰编号 化合物 tR
A 未知 0644 F 未知 1566
3 朝藿定A 0717 G 未知 1704
B 未知 0769 H 未知 0964
4 朝藿定B 0798 9 箭藿苷B 1000
C 未知 0833 I 未知 0936
5 朝藿定C 0873 10 宝藿苷Ⅰ 1064
D 未知 0936 J 未知 1518
6 淫羊藿苷 1000 K 未知 1330
E 未知 1518
注:峰3~6,A~G相对保留时间以峰6为参照;峰 9~10,H~I
相对保留时间以峰9为参照
3.4 8个主要种类的HPLC指纹鉴别特征
3.4.1 朝鲜淫羊藿 所有朝鲜淫羊藿样品均具有
明显的未知峰 E,F,G和 J(个别样品 J峰不明显),
而这4个峰在已研究的淫羊藿属其他种类都没有,
属于朝鲜淫羊藿的独有特征峰,具有重要的鉴别意
义。另外“ABCI组峰”的特点是:峰5最低,峰6最
高,峰3与其他物种相比相对峰高较高(图 3,4)。
这些特征一般不受采集时间和存放时间的影响。
3.4.2 心叶淫羊藿 心叶淫羊藿 14个样品的
HPLC图谱结果显示,“ABCI组峰”中,一般峰4最
高,且显著高于其他色谱峰,峰4较高的情况仅见于
朝鲜淫羊藿,仅山西沁水(A110)和永济(0556)的样
品峰4仅比峰5略高,河南嵩县(0552)样品峰4与
峰6高度相当。然而甘肃武山(0558)和岷县
(0559)样品峰5,6却明显高于峰4,这种例外情况
的是否普遍值得进一步研究。此外所有样品的“K
组峰”中,为弱的“小三峰”,而淫羊藿属其他种类均
为“小双峰”,但是因为是弱峰,特征性不甚显著。
心叶淫羊藿的 HPLC指纹图谱具有特征性,但
是不如朝鲜淫羊藿特征性强,仍然基本可资鉴别,种
内图谱有一些变化(图5)。
图4 朝鲜淫羊藿样品89021(a)和EKmj(b)的HPLC图
图5 心叶淫羊藿样品0552(a)和0560(b)的HPLC图
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3.4.3 柔毛淫羊藿 柔毛淫羊藿 9个样品中,
“ABCI组峰”中,峰5和峰6高于其他峰,峰5为
最高峰,但陕西南郑 (0456)和四川成都 (0533)
的峰6与峰5高度几乎相等或者前者略高。柔毛淫
羊藿HPLC图谱属于淫羊藿属物种常见图谱类型
(即 “ABCI组峰”中,峰5高于其他峰),因此与
其他物种相比缺乏特征性,而且种内也存在少许变
异 (图6)。
图6 柔毛淫羊藿样品0456(a)和0457(b)的HPLC图
3.4.4 箭叶淫羊藿 箭叶淫羊藿是淫羊藿属中分
布范围最广的一个种,作者收集了包括其变种光叶
淫羊藿在内的共 17个不同产地的样品,不同样品
HPLC图谱差别很大,类型多样:9个样品(0403,
0515,0516,Safujian,0510,0338,0425)在”ABCI组
峰”和“SB组峰”的位置处仅有极少数强峰,且在峰
的数量、位置和强弱有所不同;4个样品(0502,
0506,0507,0508)在”ABCI组峰”和“SB组峰”的位
置处几乎无明显色谱峰;2个样品(0509,0514)属于
常规类型,即“ABCI组峰”中,峰5高于其他峰。2
个样品(0501,89011)类似于天平山淫羊藿(图7)。
因此箭叶淫羊藿无法提取HPLC图谱鉴别特征。
图7 箭叶淫羊藿样品0514(a),0403(b),safujian(c)和0508(d)的HPLC图谱
3.4.5 巫山淫羊藿 巫山淫羊藿的分布范围较小,
但不同样品间变异仍然很大,无法提取特定的
HPLC图谱鉴别特征(图8)。
3.4.6 天平山淫羊藿 天平山淫羊藿22个不同的
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图8 巫山淫羊藿样品0434(a),89001(b)和0526(c)的HPLC图
样品图谱特征,可以归纳为,“ABCI组峰”中,A,B,
C,D4个未知峰很明显,有时强于临近的3~6号已
知峰,因此此组峰看起来比较复杂,这种情况在淫羊
藿属其他物种中很少存在,仅见于心叶淫羊藿、宝兴
淫羊藿和湖南淫羊藿的个别样品;“ABCI组峰”中,
峰5为最强峰。部分样品峰形简单,全部谱图仅由
1~4个主峰构成,如样品0316,0319,0320,0522;还
有个别样品(0421)谱图类型和淫羊藿属大多数物
种的类型一样。天平山淫羊藿 HPLC图谱以“ABCI
组峰”构成较为复杂为特征(图3,9)。
图9 天平山淫羊藿样品0407(a),0415(b)的HPLC图
3.4.7 粗毛淫羊藿 粗毛淫羊藿13个不同样品以
具有明显的 K峰以及附近多数复杂的小峰为特征
(仅0305和04622个样品的 K组峰不明显),在淫
羊藿属其他样品中,仅在黔岭淫羊藿和天平山淫羊
藿的个别样品中 K峰较为明显。各样品的“ABCI
组峰”也极为相似,所以粗毛淫羊藿的HPLC谱图特
征性较强(图2)。
3.4.8 黔岭淫羊藿 黔岭淫羊藿7个样品HPLC图
谱在”ABCI组峰”和“SB组峰”的位置处均无明显的色
谱峰,但是在淫羊藿属植物中,具有该种类型色谱图的
还有木鱼坪淫羊藿、保靖淫羊藿、竹山淫羊藿、恩施淫
羊藿等多个物种,在箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿等物种中
也有这种类型存在,因此不具有鉴别特征性(图10)。
4 结论
淫羊藿的HPLC指纹图谱在药用种类的种间和
种内呈现比较复杂的变化,本研究基于各物种主要
分布区大量的研究样品,提取出一些物种的鉴别特
征,有助于这些物种的鉴定。
得到的HPLC指纹图谱也显示出淫羊藿药材因
物种来源不同,质量差异很大(有些物种内差异也
很大,如箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿),作者曾经尝试
用推荐使用的指纹图谱相似软件进行一致度分析,
大多数物种种内一致度很低,因此实现淫羊藿药材
的质量控制将有很长的路要走。
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图10 黔岭淫羊藿样品0411(a),0420(b)的HPLC图谱
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Studiesonfingerprintingandidentificationofmainspeciesof
HerbaEpimedi
PEILikuan,GUOBaolin,HUANGWenhua
(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege,
Beijing100094,China)
[Abstract] Objective:ToestablishanefectivemethodfortheidentificationofHerbaEpimedi.Method:TheHPLCfinger
printsof8oficinalspeciesincluding5speciesrecordedin‘ChinesePharmacopoeia’,whichareEpimediumbrevicornu,E.sagita
tum,E.pubescens,E.koreanumandE.wushanense,andtheother3species,E.acuminatum,E.myrianthumandE.leptorhizum,
recordedin‘GuizhouQualityCriteriaforTraditionalChineseMedicalMaterialandNationalityMedicalMaterial’,andofother24spe
ciesingenusEpimediuminChinaaswelhadbeenanalyzedandsomefingerprintingfeaturesfortheidentificationhadbeenpointed
out.ResultandConclusion:ThefingerprintingfeaturesofE.koreanumareratherdiferentfromothersandcanbeusedforthespe
ciesidentification.TherearesomecommonfingerprintingfeaturesinthemostsamplesofE.brevicornu,E.acuminatumandE.myri
anthum,respectively,andthesefeaturesareseldomfoundinthesamplesofotherspecies.TheHPLCfingerprintsofE.pubescensand
E.leptorhizumappearsteadilyamongalsamplesofthespeciesrespectively,butitisdificulttodistinguishthespceciesfromother
specieswiththeHPLCfingerprintsonly.TheHPLCfingerprintsofE.sagitatumandE.wushanensevarygreatlywithinthespecies.It
isalsoshowedthatthequalityofHerbaEpimedivariedsignificantlyaccordingtotheHPLCfeatures.
[Keywords] HerbaEpimedi;identification;HPLCfingerprinting;flavonoids
[责任编辑 吕冬梅]
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