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Mechanism of copper and zinc on tanshinones of cultivated Salviae miltiorrhizae

铜、锌对栽培丹参的丹参酮类物质影响机制的研究



全 文 :·研究论文·
铜、锌对栽培丹参的丹参酮类物质
影响机制的研究
汪 斌1,刘德辉1,谈献和2,王康才3,郭亚勤1,代静玉1
(1.南京农业大学 资源与环境科学学院,江苏 南京 210095;
2.南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210046;
3.南京农业大学 园艺学院,江苏 南京 210095)
[摘要] 目的:探究微量元素(铜、锌)对丹参根中3种丹参酮的累积产生影响的机制,为丹参的优质高产提供
理论依据。方法:通过砂培试验研究铜、锌对丹参根中3种丹参酮的累积和丹参体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化
酶(PPO)活性的影响,并且探究了它们与基质中有效态铜、锌含量之间的相关关系。结果:丹参根中3种丹参酮的
含量均随铜、锌浓度的增大而提高,对丹参生长期内3种丹参酮的动态监测表明,铜、锌处理后60d时的3种丹参
酮含量最低,120d时最高,150d时又开始下降。在基质中有效态铜和有效态锌含量、丹参体内氧化酶(POD,PPO)
活性、丹参根中3种丹参酮含量三者之中,任何两者之间均呈现显著(P<005)或极显著(P<001)的正相关关
系。结论:铜、锌对丹参根中丹参酮类物质累积产生影响的机制有可能是适量的铜、锌增强了多酚氧化酶、过氧化
物酶的活性,而他们又有可能促使了丹参体内酚类物质更多的转化成萜类物质,从而使丹参酮的累积量增加。
[关键词] 铜;锌;丹参酮类物质;过氧化物酶;多酚氧化酶
[中图分类号]S567,R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)17208206
[收稿日期] 20070726
[基金项目] 国家科技支撑计划项目(2006BAI09B03)
[通讯作者] 代静玉,Tel:(025)84396208,Email:daijy@
njau.edu.cn
  丹参是重要的中药材,为唇形科鼠尾草属植物,
具有活血祛瘀,调经止痛,清热安神等功效[1]。广
泛分布于华北、华东、中南、西北以及西南地区,是许
多中药复方和中成药的主要成分之一,应用丹参药
物及其所含药用成分进行防病、治病日趋增多,野生
资源已远不能满足日益增多的药材用量的需求,栽
培丹参弥补了野生资源的不足。
近年来,为了提高栽培丹参的产量和质量,药农
将施肥作为途径之一,但是施肥普通存在“三重三
轻”(重化肥轻有机肥,重氮肥轻磷、钾肥,重大量元
素肥轻中、微量元素肥)现象,这常使丹参枝叶繁
茂,丹参根产量不高,丹参酮含量偏低[2]。因此,要
改变目前这一状况,十分有必要配施一些其他肥料,
如微量元素肥料。
韩建萍等[3]通过盆栽和大田的试验研究结果
表明,施用铁、锰、锌和铜等微肥有利于丹参酮ⅡA的
累积;而硼肥不利于丹参酮ⅡA的累积。赵海燕
[4]
通过盆栽试验研究表明,施用氨基酸螯合微肥,能显
著提高丹参酮ⅡA含量,但是对丹参酮Ⅰ、隐丹参酮
的影响不显著。虽然这些研究就微量元素对丹参的
有效成分丹参酮的影响做了些探究,但是并未涉及
其机制问题。
铜、锌是2种重要的微量元素,而且又是重金属
元素,因此,在丹参的栽培过程中施用微量元素肥料
时要特别关注。作者通过砂培试验探究铜、锌对丹
参脂溶性成分丹参酮的累积产生影响的机制,旨在
为丹参的优质高产提供理论依据。
1 材料
丹参种苗来自山东临朐县丹参种苗基地;选用
江砂做基质,加入10%的蛭石充分混匀,江砂用自
来水冲洗;高效液相色谱仪(日本岛津公司,LC-
20A泵,SPD-20AT紫外检测器),NucleosilC18色谱
柱(46mm×250mm,5μm);上海精密仪器厂755B
紫外可见分光光度计;VaRiAn-220原子吸收分光
光度计;甲醇、二氯甲烷等试剂均为分析纯。
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
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2 方法
根据预备试验(水培)结果,当铜、锌达到 15
mg·L-1时就会对丹参产生毒害作用。并结合江苏
省土壤中有效微量元素对作物产生作用的浓度范
围。选用高23cm,直径20cm的塑料盆,每盆装入
55kg基质,于2006年5月11日,选育长势一致的
丹参苗,移栽入盆,每盆1株,共8处理,144盆。先
后用水,1/8,1/6,1/4,1/2,全浓度的 Hoagland营养
液浇灌,驯化3周后,于6月初开始浇灌处理。整个
试验过程共浇灌6次,每月浇灌1次,每次每盆浇灌
1LHoagland营养液,并将微量元素溶于 Hoagland
营养液中浇灌入盆。每次每盆中铜(Cu)的含量分
别为0,02,04,08mg;锌(Zn)的含量分别为0,
05,10,15mg(表 1)。为了保证丹参的正常生
长,在铜、锌的各处理中分别施入铁(Fe)、锰(Mn)、
硼(B)、钼(Mo),每次每盆的含量分别为 825,
283,092,021mg(表2)。另外,由于铜处理中缺
少锌,锌处理中缺少铜,会不利于丹参的正常生长,
所以在各铜处理中加入等量的锌,每次每盆锌的含
量为10mg,在各锌处理中则加入等量的铜,每次
每盆铜的含量为04mg(表2)。测得基质中铜、锌
的含量分别为002,004mg·kg-1。试验期间保持
基质水分为田间持水量的65% ~70%。分别于30,
60,90,120,150,180d时破坏性采样(每次每处理采
样3盆),测定生物学性状指标后,采集丹参根部分样
品,用液氮冷冻2h后,放入冷藏柜储存,待测酶活
性,剩下的丹参根样品,置90℃下杀青30min,50℃
烘干,粉碎过05mm筛,用封口袋避光保存。
基质中有效态铜、锌的含量用盐酸浸提,原子吸
收法测定[5]。3种丹参酮(丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐
丹参酮)含量用甲醇二氯甲烷超声萃取,用 HPLC
测定[6]。根部多酚氧化酶(PPO)活性测定参照杨秀
清等的方法[7],过氧化物酶(POD)活性的测定参照
郝再彬等的方法[8]。
表1 试验中施入铜、锌的累积质量分数 mg·kg-1
处理时间
/d
Cu Zn
02 04 08 05 10 15
30 004 007 015 009 018 027
60 007 015 029 018 036 055
90 011 022 044 027 055 082
120 015 029 058 036 073 109
150 018 036 073 046 091 136
180 022 044 087 055 109 164
表2 试验中补充施入的铜、锌、铁、锰、硼、钼
的累积质量分数 mg·kg-1 
处理时间/d Cu Zn Fe Mn B Mo
30 007 018 150 233 017 004
60 015 036 300 467 033 008
90 022 055 450 700 050 011
120 029 073 600 933 067 015
150 036 091 750 1167 083 019
180 044 109 900 1400 100 023
3 结果与分析
3.1 铜、锌对丹参根中3种丹参酮含量的影响 各
不同铜、锌处理在6个采样时间中的任何时期,3种
丹参酮的含量均随处理浓度的增大而增大。多重分
析结果表明,在铜、锌处理的最高浓度下,3种丹参
酮的含量均与对照存在显著差异,除处理30d时的
铜处理对隐丹参酮含量影响之外,而在其他浓度下
则差异不明显。另外,与对照比较,从处理30~180
d,铜处理中丹参根中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮
ⅡA的含量增幅分别达到6% ~357%,5% ~84%,
3% ~587%;而锌处理中则分别为 1% ~410%,
9%~76%,4%~430%。这表明栽培基质中含有一
定量的铜、锌能显著提高丹参根中3种丹参酮的含
量,并且其对隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量影响更显
著(表3~5)。
同一处理6个采样时间比较,3种丹参酮的含
量均表现为,处理后60d时3种丹参酮含量最低,
随着时间的推移,3种丹参酮的累积逐渐增大,120
d时达到高峰期,150d时3种丹参酮的累积又开始
下降。这说明3种丹参酮的累积与丹参的生长时期
关系密切。
3.2 铜、锌对丹参体内的过氧化物酶和多酚氧化酶
活性的影响 各不同铜、锌处理在6个采样时间中
的任何一个时期,无论是POD还是PPO的活性均随
着处理浓度的增大而增强。从处理30~180d,铜处
理的丹参体内 POD,PPO活性分别比对照增强了
12~23倍、11~27倍;而锌处理的丹参体内
POD,PPO活性则分别比对照增强了12~25倍、
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   表3 铜、锌对丹参根中隐丹参酮含量的影响(珋x±s,n=3) % 
处理
含量
/mg/盆
采样时间/d
30 60 90 120 150 180
Cu 00 0151±0021a 0017±0007c 0138±0009b 0305±0027c 0208±0016c 0163±0017b
02 0160±0019a 0026±0005c 0157±0005a 0339±0009b 0241±0018b 0178±0017ab
04 0171±0033a 0047±0011b 0161±0007a 0357±0013b 0267±0009b 0187±0012ab
08 0184±0028a 0078±0006a 0169±0010a 0390±0009a 0303±0016a 0201±0009a
Zn 00 0141±0014b 0016±0004c 0105±0008c 0245±0023d 0185±0010d 0146±0006b
05 0142±0010b 0050±0010b 0128±0004b 0294±0011c 0209±0006c 0160±0021b
10 0169±0010ab 0060±0006b 0149±0007a 0351±0020b 0257±0008b 0171±0018b
15 0197±0025a 0086±0011a 0159±0005a 0387±0017a 0277±0011a 0204±0005a
  注:表中同列相同标记的字母表示差异不显著,有不同标记字母的表示差异显著(P<005)(表4,5同)
表4 铜、锌对丹参根中丹参酮Ⅰ含量的影响(珋x±s,n=3) % 
处理
含量
/mg/盆
采样时间/d
30 60 90 120 150 180
Cu 00 0025±0001c 0016±0002c 0023±0003b 0048±0003b 0031±0001b 0027±0003b
02 0028±0001bc 0018±0002bc 0026±0002b 0051±0006ab 0033±0001b 0031±0002bc
04 0031±0003b 0021±0002b 0027±0002b 0054±0003ab 0035±0001b 0033±0001b
08 0037±0002a 0030±0002a 0037±0003a 0058±0003a 0041±0004a 0037±0002a
Zn 00 0026±0002c 0017±0001c 0025±0002b 0042±0004c 0033±0002b 0029±0003c
05 0033±0003b 0023±0003b 0029±0001a 0049±0005bc 0036±0003b 0035±0001b
10 0036±0002ab 0024±0002b 0031±0001a 0053±0004b 0041±0003a 0038±0002ab
15 0039±0003a 0029±0002a 0033±0003a 0061±0003a 0044±0002a 0040±0002a
表5 铜、锌对丹参根中丹参酮ⅡA含量的影响(珋x±s,n=3) % 
处理
含量
/mg/盆
采样时间/d
30 60 90 120 150 180
Cu 00 0115±0009d 0012±0004c 0099±0010b 0366±0011c 0249±0021c 0208±0027b
02 0135±0009c 0028±0007c 0103±0007b 0385±0030bc 0265±0014bc 0213±0008b
04 0160±0009b 0046±0010b 0118±0008a 0418±0012ab 0304±0032ab 0240±0010ab
08 0181±0012a 0080±0011a 0131±0005a 0442±0021a 0327±0007a 0263±0021a
Zn 00 0124±0009c 0015±0004c 0102±0008c 0331±0015c 0254±0012b 0218±0015b
05 0147±0008b 0031±0008bc 0108±0006bc 0367±0025c 0265±0029b 0228±0025b
10 0168±0014a 0046±0012b 0115±0004ab 0434±0015b 0324±0010a 0245±0012ab
15 0181±0009a 0065±0013a 0126±0006a 0492±0021a 0351±0019a 0272±0018a
12~28倍。这表明一定浓度的铜、锌能不同程度
的提高丹参体内POD,PPO的活性(图1~4)。
同一处理6个采样时间比较,处理30,60d后
和150,180d后,POD和PPO的酶活性较高,而处理
90,120d后活性较低。这可能是由于受外界温度影
响很大,在30,60d采样测定酶时,正好是在7,8月
份,这时外界温度高容易产生热害,而150,180d采
样测定酶时,则是11,12月份,这时外界温度低容易
产生冻害,而植物在逆境环境下会提高其抗氧化酶
的活性,以消除体内的活性氧防止膜脂过氧化,从而
达到保护植物的目的,本试验结果可能是由于此原
因所致。
3.3 基质中有效态铜、锌的含量、丹参体内 POD与
  
图1 铜对丹参体内POD活性的影响
PPO的活性与丹参根中3种丹参酮含量之间的相关
关系 综合分析了基质中有效态铜、锌的含量,丹参
体内2种氧化酶(POD,PPO)的活性与丹参根中3
种丹参酮含量的关系可以看出,基质中有效态铜、锌
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图2 锌对丹参体内POD活性的影响
图3 铜对丹参体内PPO活性的影响
图4 锌对丹参体内PPO活性的影响
的含量与丹参体内 POD,PPO活性之间存在显著
(P<005)或者极显著(P<001)的正相关关系,
除在处理30d后的基质中有效态铜的含量与丹参
体内POD,PPO的活性没有显著相关性之外(表6)。
基质中有效态铜、锌的含量与丹参根中3种丹参酮
的含量之间也存在显著(P<005)或者极显著(P<
001)的正相关关系,但是处理30d后的基质中有
效态铜的含量与丹参根中3种丹参酮的含量没有显
著相关性(表7)。各处理所对应的丹参体内 POD,
PPO的活性与丹参根中3种丹参酮的含量之间则存
在显著(P<005)或者极显著(P<001)的正相关
关系,除铜处理所对应的处理 30d后的丹参体内
PPO的活性与丹参根中隐丹参酮的含量没有显著相
关性之外(表8)。这说明外源铜、锌的含量、POD,
PPO的活性、丹参酮的含量之间有显著(P<005)
或者极显著(P<001)的正相关关系,由此可揭示
铜、锌对丹参的脂溶性有效成分丹参酮的累积产生
影响的过程中,POD,PPO起到了良好作用。
表6 基质中有效态铜、锌的含量与丹参体内
POD,PPO活性的相关关系(n=12)
采样时间
/d
Cu
POD PPO
Zn
POD PPO
30 03558 05331 080422) 074802)
60 074062) 083002) 091482) 086572)
90 086212) 093622) 086762) 092352)
120 084682) 088702) 097052) 097982)
150 097182) 092542) 096202) 089862)
180 090512) 094822) 097692) 092032)
  注:1)表示P<005,2)表示P<001(表7,8同)
表7 基质中有效态铜、锌的含量与丹参根中3种
丹参酮含量的相关关系(n=12)
处理 采样时间/d 隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
Cu 30 04626 03618 05553
  60 086982) 073872) 089772)
  90 085552) 082552) 076242)
  120 083592) 068951) 088192)
  150 094362) 080942) 084762)
  180 075232) 092162) 078542)
Zn 30 066021) 071462) 064631)
  60 092732) 091392) 088892)
  90 091672) 081032) 088872)
  120 094842) 087982) 095332)
  150 093882) 091102) 091582)
  180 079202) 087302) 080802)
4 讨论
本试验结论表明3种丹参酮的含量呈现先增后
降的趋势,处理120d后达到高峰期,150d后开始
下降,这可能是与根直径的大小有关。有研究表明,
根直径的大小与丹参酮ⅡA的含量呈负相关
[9]。在
丹参酮ⅡA累积高峰期,丹参根系尚未膨大,单位质
量的根表皮面积相对较大,所以丹参酮ⅡA的含量
高。随着根径长粗,丹参酮ⅡA的累积量逐渐降低。
铜、锌是植物正常生命活动所必需的微量矿质
元素,广泛参与各种生命活动。铜、锌离子也是多种
氧化酶的重要组成部分,对它们的活性会产生影响。
如杨云龙等[18]研究表明,铜、锌对华北落叶松幼苗
各器官(叶、枝、干、主根、侧根)PPO的活性均会产
生影响。铜对PPO活性的增强作用达显著水平,锌
对主根PPO活性的提高也有较明显影响,对其他器
官PPO活性有不同程度的抑制作用。刘文彰[19]研
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   表8 丹参体内POD,PPO的活性与丹参根中3种丹参酮含量的相关关系(n=12)
处理
采样时间
/d
POD
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
PPO
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
Cu 30 069561) 079202) 086072) 03712 073382) 082662)
  60 086582) 091852) 087262) 089762) 093192) 091482)
  90 074312) 082932) 073122) 079462) 087982) 079472)
  120 074592) 071742) 077312) 085882) 075252) 085022)
  150 093172) 076842) 082762) 084642) 085592) 071802)
  180 079582) 087562) 075842) 074972) 089152) 077602)
Zn 30 082762) 082262) 088962) 078772) 085122) 083652)
  60 090082) 088192) 087892) 090922) 089132) 081682)
  90 086942) 071662) 077512) 093632) 085112) 080882)
  120 090512) 085772) 088872) 092462) 088142) 092042)
  150 093532) 085812) 089052) 087322) 082962) 081462)
  180 082962) 086942) 080712) 074822) 091722) 065911)
究表明,高浓度铜能提高 POD的活性,因此可以将
POD的活性作为铜过剩的生理指标。这些研究结
果也就显示了,铜、锌对植物体内氧化酶(POD,
PPO)的影响与植物各组织器官,铜、锌等均有一定
关系。
植物体内酚类物质在多酚氧化酶,过氧化物酶
的作用下,能氧化成醌类物质[2021]。丹参中的脂溶
性成分丹参酮是二萜醌类物质,其合成前体很可能
是酚类物质,其很可能是在多酚氧化酶、过氧化物酶
的作用下而完成的[22]。铜、锌是多种氧化酶的重要
组成部分,对其活性会产生影响,因此可以推断外源
铜、锌很可能会影响多酚氧化酶、过氧化物酶的活
性,从而有可能影响丹参体内酚类物质转化成萜醌
类物质,即影响丹参酮的累积。本试验的结论与此
推断具有一致性。外源铜、锌对丹参酮累积的影响
过程中,氧化酶(POD,PPO)起到一定作用,但是其
起到多大作用,有没有其他氧化酶或者其他专一酶
作用,有待进一步研究。
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MechanismofcopperandzincontanshinonesofcultivatedSalviaemiltiorrhizae
WANGBin1,LIUDehui1,TANXianhe2,WANGKangcai3,GUOYaqin1,DAIJingyu1
(1.ColegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;
2.ColegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;
3.ColegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicines,Nanjing210046,China)
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第33卷第17期
2008年9月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 17
September,2008
[Abstract] Objective:TostudythemechanismofmicroelementincludingCuandZnontheaccumulationofthreedanshinones
inSalviaemiltiorhizaerootandbuildatheorybasisforitsgoodqualityandhighyield.Method:Sandcultureexperimentswerecon
ductedtostudytheefectofCuandZnontheaccumulationofthreedanshinonesandoxidaseincludingperoxidaseandpolyphenoloxi
daseactivityintheplantroot.ThecorelationbetweenavailableCuandZncontentsinmatrixandoxidaseactivityintheplantroot
and,thecorelationbetweenavailableCuandZncontentsinmatrixandcontentsoftanshinonesintherootwerediscussed.Result:
ContentsofdanshinonesintherootincreasedwiththeincreasingofCuandZnconcentration.Dynamicmonitoringoncontentsofdan
shinonesoftheplantrootsgrowinginthepotswithdiferentCuandZnconcentrationinthewholegrowingseasonshowedthatthecon
tentsofdanshinonesfor60dayswerethelowest,for120daysthehighestandthendroppedfor150days.Inaddition,amongavailable
CuandZncontentsofmatrix,oxidaseincludingperoxidaseandpolyphenoloxidaseactivityandcontentsoftanshinonesintheroot,the
corelationbetweentwofactorsweresignificantdiference(P<0.05orP<0.01).Conclusion:ThemechanismofCuandZnonthe
accumulationofdanshinonesmaybethatCuandZnimprovetheactivityofperoxidaseandpolyphenoloxidase,whichpromotetransfor
mationofphenoliccompoundstoterpenesandthereforetoincreasecontentsofdanshinones.
[Keywords] Cu;Zn;sandculture;tanshinones;peroxidase;polyphenoloxidase
[责任编辑 吕冬梅]
[收稿日期] 20071115
[基金项目]  浙江省自然科学基金项目(200302411)
[通讯作者] 斯金平,Tel:13868004019,Email:lssjp@163.
com
厚朴贮存年限与厚朴酚类含量关系的研究
吕 达1,斯金平1,童再康1,郭宝林2,蒋燕峰1,朱玉球1
(1.浙江林学院 天然药物研发中心,浙江 临安 311300;
2.中国医学科学院 药用植物研究所,北京 100094)
[摘要] 目的:揭示厚朴贮存年限与厚朴酚类含量的关系,为指导厚朴采收、经营、贮藏、加工提供依据。方
法:以全国厚朴主产区的15个正品厚朴样品为研究对象,针对采样当年、贮存3年与贮存10年3个不同贮藏时间,
采用相同HPLC分别测定其厚朴酚、和厚朴酚含量。结果:在一定的贮藏年限内,厚朴中的酚类成分含量有明显增
加的趋势,厚朴酚的含量0~3年呈增长趋势,3年后随着贮藏年限增加而有略下降,但贮存10年后仍然高于采收
当年;和厚朴酚的含量贮存10年仍然呈增长趋势。结论:厚朴酚类物质在厚朴药材中具有很好的稳定性,厚朴药
材可贮存至10年甚至更长。
[关键词] 厚朴;厚朴酚;和厚朴酚;贮藏年限
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)17208703
  贮藏年限对药材质量的影响,不仅关系到药材
的使用,而且影响药材的生产、经营。一种商品如
果耐贮藏性好,其生产、经营、使用的风险就小。
厚朴Magnoliaoficinalis是我国特有的珍贵中药,
具有燥湿消痰、下气除满等功效[1],主要活性成
分厚朴酚与和厚朴酚具有抗菌、抗溃疡及防龋等作
用,《中国药典》将其作为厚朴质量的主要控制标
准。研究贮藏时间与厚朴酚类含量的关系,对于厚
朴的采收、经营、加工和临床应用有重要的指导意
义。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料于1997年6月5日~25日采
自浙江、福建、湖南、湖北、四川等地,共15个样品。
全部样品自然阴干后,1997年9月第1次用高效液
相色谱法测定厚朴酚与和厚朴酚的含量,2000年8
月和2007年8月分别对常温、干燥贮藏3年和10
年后的样品用相同方法第2次、第3次测定厚朴酚
与和厚朴酚的含量。
1.2 方法 采用HPLC方法测定[2]。
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第33卷第17期
2008年9月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 17
September,2008