全 文 :·研究论文·
铜、锌对栽培丹参的丹参酮类物质
影响机制的研究
汪 斌1,刘德辉1,谈献和2,王康才3,郭亚勤1,代静玉1
(1.南京农业大学 资源与环境科学学院,江苏 南京 210095;
2.南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210046;
3.南京农业大学 园艺学院,江苏 南京 210095)
[摘要] 目的:探究微量元素(铜、锌)对丹参根中3种丹参酮的累积产生影响的机制,为丹参的优质高产提供
理论依据。方法:通过砂培试验研究铜、锌对丹参根中3种丹参酮的累积和丹参体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化
酶(PPO)活性的影响,并且探究了它们与基质中有效态铜、锌含量之间的相关关系。结果:丹参根中3种丹参酮的
含量均随铜、锌浓度的增大而提高,对丹参生长期内3种丹参酮的动态监测表明,铜、锌处理后60d时的3种丹参
酮含量最低,120d时最高,150d时又开始下降。在基质中有效态铜和有效态锌含量、丹参体内氧化酶(POD,PPO)
活性、丹参根中3种丹参酮含量三者之中,任何两者之间均呈现显著(P<005)或极显著(P<001)的正相关关
系。结论:铜、锌对丹参根中丹参酮类物质累积产生影响的机制有可能是适量的铜、锌增强了多酚氧化酶、过氧化
物酶的活性,而他们又有可能促使了丹参体内酚类物质更多的转化成萜类物质,从而使丹参酮的累积量增加。
[关键词] 铜;锌;丹参酮类物质;过氧化物酶;多酚氧化酶
[中图分类号]S567,R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)17208206
[收稿日期] 20070726
[基金项目] 国家科技支撑计划项目(2006BAI09B03)
[通讯作者] 代静玉,Tel:(025)84396208,Email:daijy@
njau.edu.cn
丹参是重要的中药材,为唇形科鼠尾草属植物,
具有活血祛瘀,调经止痛,清热安神等功效[1]。广
泛分布于华北、华东、中南、西北以及西南地区,是许
多中药复方和中成药的主要成分之一,应用丹参药
物及其所含药用成分进行防病、治病日趋增多,野生
资源已远不能满足日益增多的药材用量的需求,栽
培丹参弥补了野生资源的不足。
近年来,为了提高栽培丹参的产量和质量,药农
将施肥作为途径之一,但是施肥普通存在“三重三
轻”(重化肥轻有机肥,重氮肥轻磷、钾肥,重大量元
素肥轻中、微量元素肥)现象,这常使丹参枝叶繁
茂,丹参根产量不高,丹参酮含量偏低[2]。因此,要
改变目前这一状况,十分有必要配施一些其他肥料,
如微量元素肥料。
韩建萍等[3]通过盆栽和大田的试验研究结果
表明,施用铁、锰、锌和铜等微肥有利于丹参酮ⅡA的
累积;而硼肥不利于丹参酮ⅡA的累积。赵海燕
[4]
通过盆栽试验研究表明,施用氨基酸螯合微肥,能显
著提高丹参酮ⅡA含量,但是对丹参酮Ⅰ、隐丹参酮
的影响不显著。虽然这些研究就微量元素对丹参的
有效成分丹参酮的影响做了些探究,但是并未涉及
其机制问题。
铜、锌是2种重要的微量元素,而且又是重金属
元素,因此,在丹参的栽培过程中施用微量元素肥料
时要特别关注。作者通过砂培试验探究铜、锌对丹
参脂溶性成分丹参酮的累积产生影响的机制,旨在
为丹参的优质高产提供理论依据。
1 材料
丹参种苗来自山东临朐县丹参种苗基地;选用
江砂做基质,加入10%的蛭石充分混匀,江砂用自
来水冲洗;高效液相色谱仪(日本岛津公司,LC-
20A泵,SPD-20AT紫外检测器),NucleosilC18色谱
柱(46mm×250mm,5μm);上海精密仪器厂755B
紫外可见分光光度计;VaRiAn-220原子吸收分光
光度计;甲醇、二氯甲烷等试剂均为分析纯。
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2 方法
根据预备试验(水培)结果,当铜、锌达到 15
mg·L-1时就会对丹参产生毒害作用。并结合江苏
省土壤中有效微量元素对作物产生作用的浓度范
围。选用高23cm,直径20cm的塑料盆,每盆装入
55kg基质,于2006年5月11日,选育长势一致的
丹参苗,移栽入盆,每盆1株,共8处理,144盆。先
后用水,1/8,1/6,1/4,1/2,全浓度的 Hoagland营养
液浇灌,驯化3周后,于6月初开始浇灌处理。整个
试验过程共浇灌6次,每月浇灌1次,每次每盆浇灌
1LHoagland营养液,并将微量元素溶于 Hoagland
营养液中浇灌入盆。每次每盆中铜(Cu)的含量分
别为0,02,04,08mg;锌(Zn)的含量分别为0,
05,10,15mg(表 1)。为了保证丹参的正常生
长,在铜、锌的各处理中分别施入铁(Fe)、锰(Mn)、
硼(B)、钼(Mo),每次每盆的含量分别为 825,
283,092,021mg(表2)。另外,由于铜处理中缺
少锌,锌处理中缺少铜,会不利于丹参的正常生长,
所以在各铜处理中加入等量的锌,每次每盆锌的含
量为10mg,在各锌处理中则加入等量的铜,每次
每盆铜的含量为04mg(表2)。测得基质中铜、锌
的含量分别为002,004mg·kg-1。试验期间保持
基质水分为田间持水量的65% ~70%。分别于30,
60,90,120,150,180d时破坏性采样(每次每处理采
样3盆),测定生物学性状指标后,采集丹参根部分样
品,用液氮冷冻2h后,放入冷藏柜储存,待测酶活
性,剩下的丹参根样品,置90℃下杀青30min,50℃
烘干,粉碎过05mm筛,用封口袋避光保存。
基质中有效态铜、锌的含量用盐酸浸提,原子吸
收法测定[5]。3种丹参酮(丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐
丹参酮)含量用甲醇二氯甲烷超声萃取,用 HPLC
测定[6]。根部多酚氧化酶(PPO)活性测定参照杨秀
清等的方法[7],过氧化物酶(POD)活性的测定参照
郝再彬等的方法[8]。
表1 试验中施入铜、锌的累积质量分数 mg·kg-1
处理时间
/d
Cu Zn
02 04 08 05 10 15
30 004 007 015 009 018 027
60 007 015 029 018 036 055
90 011 022 044 027 055 082
120 015 029 058 036 073 109
150 018 036 073 046 091 136
180 022 044 087 055 109 164
表2 试验中补充施入的铜、锌、铁、锰、硼、钼
的累积质量分数 mg·kg-1
处理时间/d Cu Zn Fe Mn B Mo
30 007 018 150 233 017 004
60 015 036 300 467 033 008
90 022 055 450 700 050 011
120 029 073 600 933 067 015
150 036 091 750 1167 083 019
180 044 109 900 1400 100 023
3 结果与分析
3.1 铜、锌对丹参根中3种丹参酮含量的影响 各
不同铜、锌处理在6个采样时间中的任何时期,3种
丹参酮的含量均随处理浓度的增大而增大。多重分
析结果表明,在铜、锌处理的最高浓度下,3种丹参
酮的含量均与对照存在显著差异,除处理30d时的
铜处理对隐丹参酮含量影响之外,而在其他浓度下
则差异不明显。另外,与对照比较,从处理30~180
d,铜处理中丹参根中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮
ⅡA的含量增幅分别达到6% ~357%,5% ~84%,
3% ~587%;而锌处理中则分别为 1% ~410%,
9%~76%,4%~430%。这表明栽培基质中含有一
定量的铜、锌能显著提高丹参根中3种丹参酮的含
量,并且其对隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量影响更显
著(表3~5)。
同一处理6个采样时间比较,3种丹参酮的含
量均表现为,处理后60d时3种丹参酮含量最低,
随着时间的推移,3种丹参酮的累积逐渐增大,120
d时达到高峰期,150d时3种丹参酮的累积又开始
下降。这说明3种丹参酮的累积与丹参的生长时期
关系密切。
3.2 铜、锌对丹参体内的过氧化物酶和多酚氧化酶
活性的影响 各不同铜、锌处理在6个采样时间中
的任何一个时期,无论是POD还是PPO的活性均随
着处理浓度的增大而增强。从处理30~180d,铜处
理的丹参体内 POD,PPO活性分别比对照增强了
12~23倍、11~27倍;而锌处理的丹参体内
POD,PPO活性则分别比对照增强了12~25倍、
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表3 铜、锌对丹参根中隐丹参酮含量的影响(珋x±s,n=3) %
处理
含量
/mg/盆
采样时间/d
30 60 90 120 150 180
Cu 00 0151±0021a 0017±0007c 0138±0009b 0305±0027c 0208±0016c 0163±0017b
02 0160±0019a 0026±0005c 0157±0005a 0339±0009b 0241±0018b 0178±0017ab
04 0171±0033a 0047±0011b 0161±0007a 0357±0013b 0267±0009b 0187±0012ab
08 0184±0028a 0078±0006a 0169±0010a 0390±0009a 0303±0016a 0201±0009a
Zn 00 0141±0014b 0016±0004c 0105±0008c 0245±0023d 0185±0010d 0146±0006b
05 0142±0010b 0050±0010b 0128±0004b 0294±0011c 0209±0006c 0160±0021b
10 0169±0010ab 0060±0006b 0149±0007a 0351±0020b 0257±0008b 0171±0018b
15 0197±0025a 0086±0011a 0159±0005a 0387±0017a 0277±0011a 0204±0005a
注:表中同列相同标记的字母表示差异不显著,有不同标记字母的表示差异显著(P<005)(表4,5同)
表4 铜、锌对丹参根中丹参酮Ⅰ含量的影响(珋x±s,n=3) %
处理
含量
/mg/盆
采样时间/d
30 60 90 120 150 180
Cu 00 0025±0001c 0016±0002c 0023±0003b 0048±0003b 0031±0001b 0027±0003b
02 0028±0001bc 0018±0002bc 0026±0002b 0051±0006ab 0033±0001b 0031±0002bc
04 0031±0003b 0021±0002b 0027±0002b 0054±0003ab 0035±0001b 0033±0001b
08 0037±0002a 0030±0002a 0037±0003a 0058±0003a 0041±0004a 0037±0002a
Zn 00 0026±0002c 0017±0001c 0025±0002b 0042±0004c 0033±0002b 0029±0003c
05 0033±0003b 0023±0003b 0029±0001a 0049±0005bc 0036±0003b 0035±0001b
10 0036±0002ab 0024±0002b 0031±0001a 0053±0004b 0041±0003a 0038±0002ab
15 0039±0003a 0029±0002a 0033±0003a 0061±0003a 0044±0002a 0040±0002a
表5 铜、锌对丹参根中丹参酮ⅡA含量的影响(珋x±s,n=3) %
处理
含量
/mg/盆
采样时间/d
30 60 90 120 150 180
Cu 00 0115±0009d 0012±0004c 0099±0010b 0366±0011c 0249±0021c 0208±0027b
02 0135±0009c 0028±0007c 0103±0007b 0385±0030bc 0265±0014bc 0213±0008b
04 0160±0009b 0046±0010b 0118±0008a 0418±0012ab 0304±0032ab 0240±0010ab
08 0181±0012a 0080±0011a 0131±0005a 0442±0021a 0327±0007a 0263±0021a
Zn 00 0124±0009c 0015±0004c 0102±0008c 0331±0015c 0254±0012b 0218±0015b
05 0147±0008b 0031±0008bc 0108±0006bc 0367±0025c 0265±0029b 0228±0025b
10 0168±0014a 0046±0012b 0115±0004ab 0434±0015b 0324±0010a 0245±0012ab
15 0181±0009a 0065±0013a 0126±0006a 0492±0021a 0351±0019a 0272±0018a
12~28倍。这表明一定浓度的铜、锌能不同程度
的提高丹参体内POD,PPO的活性(图1~4)。
同一处理6个采样时间比较,处理30,60d后
和150,180d后,POD和PPO的酶活性较高,而处理
90,120d后活性较低。这可能是由于受外界温度影
响很大,在30,60d采样测定酶时,正好是在7,8月
份,这时外界温度高容易产生热害,而150,180d采
样测定酶时,则是11,12月份,这时外界温度低容易
产生冻害,而植物在逆境环境下会提高其抗氧化酶
的活性,以消除体内的活性氧防止膜脂过氧化,从而
达到保护植物的目的,本试验结果可能是由于此原
因所致。
3.3 基质中有效态铜、锌的含量、丹参体内 POD与
图1 铜对丹参体内POD活性的影响
PPO的活性与丹参根中3种丹参酮含量之间的相关
关系 综合分析了基质中有效态铜、锌的含量,丹参
体内2种氧化酶(POD,PPO)的活性与丹参根中3
种丹参酮含量的关系可以看出,基质中有效态铜、锌
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图2 锌对丹参体内POD活性的影响
图3 铜对丹参体内PPO活性的影响
图4 锌对丹参体内PPO活性的影响
的含量与丹参体内 POD,PPO活性之间存在显著
(P<005)或者极显著(P<001)的正相关关系,
除在处理30d后的基质中有效态铜的含量与丹参
体内POD,PPO的活性没有显著相关性之外(表6)。
基质中有效态铜、锌的含量与丹参根中3种丹参酮
的含量之间也存在显著(P<005)或者极显著(P<
001)的正相关关系,但是处理30d后的基质中有
效态铜的含量与丹参根中3种丹参酮的含量没有显
著相关性(表7)。各处理所对应的丹参体内 POD,
PPO的活性与丹参根中3种丹参酮的含量之间则存
在显著(P<005)或者极显著(P<001)的正相关
关系,除铜处理所对应的处理 30d后的丹参体内
PPO的活性与丹参根中隐丹参酮的含量没有显著相
关性之外(表8)。这说明外源铜、锌的含量、POD,
PPO的活性、丹参酮的含量之间有显著(P<005)
或者极显著(P<001)的正相关关系,由此可揭示
铜、锌对丹参的脂溶性有效成分丹参酮的累积产生
影响的过程中,POD,PPO起到了良好作用。
表6 基质中有效态铜、锌的含量与丹参体内
POD,PPO活性的相关关系(n=12)
采样时间
/d
Cu
POD PPO
Zn
POD PPO
30 03558 05331 080422) 074802)
60 074062) 083002) 091482) 086572)
90 086212) 093622) 086762) 092352)
120 084682) 088702) 097052) 097982)
150 097182) 092542) 096202) 089862)
180 090512) 094822) 097692) 092032)
注:1)表示P<005,2)表示P<001(表7,8同)
表7 基质中有效态铜、锌的含量与丹参根中3种
丹参酮含量的相关关系(n=12)
处理 采样时间/d 隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
Cu 30 04626 03618 05553
60 086982) 073872) 089772)
90 085552) 082552) 076242)
120 083592) 068951) 088192)
150 094362) 080942) 084762)
180 075232) 092162) 078542)
Zn 30 066021) 071462) 064631)
60 092732) 091392) 088892)
90 091672) 081032) 088872)
120 094842) 087982) 095332)
150 093882) 091102) 091582)
180 079202) 087302) 080802)
4 讨论
本试验结论表明3种丹参酮的含量呈现先增后
降的趋势,处理120d后达到高峰期,150d后开始
下降,这可能是与根直径的大小有关。有研究表明,
根直径的大小与丹参酮ⅡA的含量呈负相关
[9]。在
丹参酮ⅡA累积高峰期,丹参根系尚未膨大,单位质
量的根表皮面积相对较大,所以丹参酮ⅡA的含量
高。随着根径长粗,丹参酮ⅡA的累积量逐渐降低。
铜、锌是植物正常生命活动所必需的微量矿质
元素,广泛参与各种生命活动。铜、锌离子也是多种
氧化酶的重要组成部分,对它们的活性会产生影响。
如杨云龙等[18]研究表明,铜、锌对华北落叶松幼苗
各器官(叶、枝、干、主根、侧根)PPO的活性均会产
生影响。铜对PPO活性的增强作用达显著水平,锌
对主根PPO活性的提高也有较明显影响,对其他器
官PPO活性有不同程度的抑制作用。刘文彰[19]研
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表8 丹参体内POD,PPO的活性与丹参根中3种丹参酮含量的相关关系(n=12)
处理
采样时间
/d
POD
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
PPO
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
Cu 30 069561) 079202) 086072) 03712 073382) 082662)
60 086582) 091852) 087262) 089762) 093192) 091482)
90 074312) 082932) 073122) 079462) 087982) 079472)
120 074592) 071742) 077312) 085882) 075252) 085022)
150 093172) 076842) 082762) 084642) 085592) 071802)
180 079582) 087562) 075842) 074972) 089152) 077602)
Zn 30 082762) 082262) 088962) 078772) 085122) 083652)
60 090082) 088192) 087892) 090922) 089132) 081682)
90 086942) 071662) 077512) 093632) 085112) 080882)
120 090512) 085772) 088872) 092462) 088142) 092042)
150 093532) 085812) 089052) 087322) 082962) 081462)
180 082962) 086942) 080712) 074822) 091722) 065911)
究表明,高浓度铜能提高 POD的活性,因此可以将
POD的活性作为铜过剩的生理指标。这些研究结
果也就显示了,铜、锌对植物体内氧化酶(POD,
PPO)的影响与植物各组织器官,铜、锌等均有一定
关系。
植物体内酚类物质在多酚氧化酶,过氧化物酶
的作用下,能氧化成醌类物质[2021]。丹参中的脂溶
性成分丹参酮是二萜醌类物质,其合成前体很可能
是酚类物质,其很可能是在多酚氧化酶、过氧化物酶
的作用下而完成的[22]。铜、锌是多种氧化酶的重要
组成部分,对其活性会产生影响,因此可以推断外源
铜、锌很可能会影响多酚氧化酶、过氧化物酶的活
性,从而有可能影响丹参体内酚类物质转化成萜醌
类物质,即影响丹参酮的累积。本试验的结论与此
推断具有一致性。外源铜、锌对丹参酮累积的影响
过程中,氧化酶(POD,PPO)起到一定作用,但是其
起到多大作用,有没有其他氧化酶或者其他专一酶
作用,有待进一步研究。
[参考文献]
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MechanismofcopperandzincontanshinonesofcultivatedSalviaemiltiorrhizae
WANGBin1,LIUDehui1,TANXianhe2,WANGKangcai3,GUOYaqin1,DAIJingyu1
(1.ColegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;
2.ColegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;
3.ColegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicines,Nanjing210046,China)
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第33卷第17期
2008年9月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 17
September,2008
[Abstract] Objective:TostudythemechanismofmicroelementincludingCuandZnontheaccumulationofthreedanshinones
inSalviaemiltiorhizaerootandbuildatheorybasisforitsgoodqualityandhighyield.Method:Sandcultureexperimentswerecon
ductedtostudytheefectofCuandZnontheaccumulationofthreedanshinonesandoxidaseincludingperoxidaseandpolyphenoloxi
daseactivityintheplantroot.ThecorelationbetweenavailableCuandZncontentsinmatrixandoxidaseactivityintheplantroot
and,thecorelationbetweenavailableCuandZncontentsinmatrixandcontentsoftanshinonesintherootwerediscussed.Result:
ContentsofdanshinonesintherootincreasedwiththeincreasingofCuandZnconcentration.Dynamicmonitoringoncontentsofdan
shinonesoftheplantrootsgrowinginthepotswithdiferentCuandZnconcentrationinthewholegrowingseasonshowedthatthecon
tentsofdanshinonesfor60dayswerethelowest,for120daysthehighestandthendroppedfor150days.Inaddition,amongavailable
CuandZncontentsofmatrix,oxidaseincludingperoxidaseandpolyphenoloxidaseactivityandcontentsoftanshinonesintheroot,the
corelationbetweentwofactorsweresignificantdiference(P<0.05orP<0.01).Conclusion:ThemechanismofCuandZnonthe
accumulationofdanshinonesmaybethatCuandZnimprovetheactivityofperoxidaseandpolyphenoloxidase,whichpromotetransfor
mationofphenoliccompoundstoterpenesandthereforetoincreasecontentsofdanshinones.
[Keywords] Cu;Zn;sandculture;tanshinones;peroxidase;polyphenoloxidase
[责任编辑 吕冬梅]
[收稿日期] 20071115
[基金项目] 浙江省自然科学基金项目(200302411)
[通讯作者] 斯金平,Tel:13868004019,Email:lssjp@163.
com
厚朴贮存年限与厚朴酚类含量关系的研究
吕 达1,斯金平1,童再康1,郭宝林2,蒋燕峰1,朱玉球1
(1.浙江林学院 天然药物研发中心,浙江 临安 311300;
2.中国医学科学院 药用植物研究所,北京 100094)
[摘要] 目的:揭示厚朴贮存年限与厚朴酚类含量的关系,为指导厚朴采收、经营、贮藏、加工提供依据。方
法:以全国厚朴主产区的15个正品厚朴样品为研究对象,针对采样当年、贮存3年与贮存10年3个不同贮藏时间,
采用相同HPLC分别测定其厚朴酚、和厚朴酚含量。结果:在一定的贮藏年限内,厚朴中的酚类成分含量有明显增
加的趋势,厚朴酚的含量0~3年呈增长趋势,3年后随着贮藏年限增加而有略下降,但贮存10年后仍然高于采收
当年;和厚朴酚的含量贮存10年仍然呈增长趋势。结论:厚朴酚类物质在厚朴药材中具有很好的稳定性,厚朴药
材可贮存至10年甚至更长。
[关键词] 厚朴;厚朴酚;和厚朴酚;贮藏年限
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)17208703
贮藏年限对药材质量的影响,不仅关系到药材
的使用,而且影响药材的生产、经营。一种商品如
果耐贮藏性好,其生产、经营、使用的风险就小。
厚朴Magnoliaoficinalis是我国特有的珍贵中药,
具有燥湿消痰、下气除满等功效[1],主要活性成
分厚朴酚与和厚朴酚具有抗菌、抗溃疡及防龋等作
用,《中国药典》将其作为厚朴质量的主要控制标
准。研究贮藏时间与厚朴酚类含量的关系,对于厚
朴的采收、经营、加工和临床应用有重要的指导意
义。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料于1997年6月5日~25日采
自浙江、福建、湖南、湖北、四川等地,共15个样品。
全部样品自然阴干后,1997年9月第1次用高效液
相色谱法测定厚朴酚与和厚朴酚的含量,2000年8
月和2007年8月分别对常温、干燥贮藏3年和10
年后的样品用相同方法第2次、第3次测定厚朴酚
与和厚朴酚的含量。
1.2 方法 采用HPLC方法测定[2]。
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第33卷第17期
2008年9月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 17
September,2008