全 文 ：大鼠尿样中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的
固相萃取方法
赵电红 t o屈 磊 u o王 璇 t3 o李晓玫 u o许俊羽 t o蔡少青 t
ktq北京大学 药学院 o北京 tsss{v~ uq北京大学 第一医院 肾内科 o北京 tsssvwl
≈摘要   目的 }研究大鼠尿样中多种马兜铃酸类 k„„¶l及马兜铃内酰胺类 k„¶l化合物的固相萃取和富集的
方法 o为定量测定建立前处理方法 ∀方法 }以马兜铃酸 2´ k„„ 2´ l!马兜铃酸 2µ k„„ 2µ l!马兜铃内酰胺 2´ k„2
´ l!马兜铃内酰胺 2µ k„2µ l和其他 ty个 „„¶及 „¶化合物的高效液相色谱峰面积为指标 o比较填料为 ≤t{的
„ª¬¯¨ ±·≤t{ rtss °ªo„¯¯·¨¦« ‹ ≤t{ rtss °ªo„¯¯·¨¦« ≤t{ rtss °ªo„¯¯·¨¦« ≤t{ rvss °ª和填料为苯基 k°«¨ ±¼¯ l的 „ª¬¯¨ ±·
°«¨ ±¼¯ russ °ªx种固相萃取 k≥°∞l小柱对目标成分的萃取保留作用的强弱 ~以 „„ 2´ o„„2µ o„2´ 和 „2µ的萃
取回收率为指标 o比较水和 th醋酸 2s1suh三乙胺水溶液 u种淋洗溶剂 o乙醚 !丙酮 !氯仿 !醋酸乙酯 !二氯甲烷 !甲
醇 !乙腈 z种洗脱溶剂对 „„¶及 „¶化合物的萃取效果的影响 ~采用 w因素 v水平正交试验对影响固相萃取的条
件包括活化体积 !清洗体积 !淋洗体积 !洗脱体积等进行优化 o以 „„ 2´ o„„2µ o„2´ o„2µ和其他 z个分离度好
的 „„¶及 „¶的色谱峰面积为指标 o确定最佳的因素水平 ∀结果 }确定固相萃取的条件为采用 uss °ª的 °«¨ ±¼¯柱
作固相萃取小柱 o用 t1s °甲醇活化和 t1s °水清洗后 o上大鼠尿样 t1s °o以 th醋酸 2s1suh三乙胺水溶液
s1{ °淋洗 ov1s °甲醇洗脱 ∀结论 }建立的尿样固相萃取方法萃取效率高 !选择性好 !简单 !省时 o可作为大鼠尿
样中多种 „„¶及 „¶化合物分析测定的尿样前处理方法 ∀
≈关键词   固相萃取 ~马兜铃酸 ~马兜铃内酰胺 ~大鼠尿液 ~正交试验
≈中图分类号   • u{wqt ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszluw2uytv2sz
≈收稿日期   ussz2sx2s|
≈基金项目   国家自然科学基金项目 kvsvztzw{l~国家教育部
|{x项目
≈通讯作者   3 王璇 oר¯}kstsl{u{sy{t{oƒ¤¬}kstsl{u{sty|vo
∞2°¤¬¯}¦¶´º¬ƒ «¶¦q³®∏q §¨∏q¦±
为探讨马兜铃酸肾病的发病机制 o需建立一些
方法 o包括尿样等生物样品中马兜铃酸类化合物的
检测方法 ∀鉴于除了马兜铃酸 2´ k„„ 2´ l以外 o马
兜铃内酰胺 2´ k„2´ l等亦有肾细胞毒性 ≈tou  o因
而需要同时关注马兜铃酸类 k„„¶l和马兜铃内酰胺
类 k„¶l两类化合物 ∀在建立尿样的定量方法过程
中 o针对尿样中目标成分含量低 !内源性干扰物质
多 !个体差异大的特点 o建立同时选择性富集多种
„„¶和 „¶的尿样前处理方法尤为重要 ∀
刘莎等 ≈v 用乙腈处理尿样后 o‹°≤定量测定
了大鼠尿中 „„ 2´ 和 „2´ o其灵敏度偏低 o无法检
测 ±ª级目标成分 ∀ Ž²³³¤®¤等 ≈w 用氯仿将尿中
„„ 2´ 提取后衍生化成酯 o再测定 o操作复杂 o灵敏
度更低 ∀ Žµ∏°¥¬¨ª¨ 等¯ ≈x 用苯提取大鼠尿液后测定
了 „„ 2´ 和 „„2µ的代谢物的转化百分率 o但未测
到 „„ 2´ o„„2µ o未给出检测限 !定量限等 ∀ • ¤±
≤«¤±等 ≈y 以醋酸乙酯和 • ¤·¨µ¶≤t{ ≥ ³¨2°¤®固相萃
取柱分别对大鼠尿液进行处理 o分别检测到 „„ 2´
和 „„2µ的代谢物 o但均未定量 ∀总之 o文献多是对
单独 t种或 u种马兜铃酸 k„„ 2´ o„„2µ l的代谢物
进行定量分析 o限于提取效率低而最低检测限过高 o
未见对 „„ 2´ o„„2µ o„2µ等 w种以上的 „„¶及
„¶同时定量检测的报道 ∀作者初试后发现 o固相
萃取法 k≥²¯¬§ °«¤¶¨ ∞¬·µ¤¦·¬²±o≥°∞l≈z 能选择性萃
取目标成分 o并明显减少干扰物质的影响而提高灵
敏度 ∀
因此本研究用 ≥°∞处理含多种 „„¶及 „¶的
大鼠尿样 o通过选择固相萃取柱 !淋洗溶剂 !洗脱溶
剂和设计正交试验 o旨在建立能选择性萃取尿中
„„ 2´ o„„2µ o„2´ o„2µ及其他多种 „„¶和 „¶
的固相萃取方法以便定量检测 o为马兜铃酸的毒代
动力学研究 !马兜铃酸肾病的临床诊断研究等提供
技术支持 ∀
#vtyu#
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ussz年 tu月
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⁄ ¦¨¨°¥¨ µo ussz
1 材料
1q1 试剂与器材
甲醇 !乙腈 k色谱纯 o美国 ƒ¬¶«¨ µ公司 lo水 k娃
哈哈饮用纯净水 o杭州娃哈哈集团有限公司 lo其他
试剂均为分析纯 k北京化工厂 l~°«¨ ±¼¯柱 russ °ªo
≤t{柱 rtss °ªk美国 „ª¬¯¨ ±·公司 lo‹≤t{柱 rtss °ªo
≤t{柱 rtss °ªo≤t{柱 rvss °ªk美国 „¯¯·¨¦«公司 l~分
析柱 ²µ¥¤¬ ≥…2≤t{色谱柱 kw1y °° ≅ uxs °°ox
Λ°o„ª¬¯¨ ±·× ¦¨«±²¯²ª¬¨¶l~²µ¥¤¬≥…2≤t{保护柱 kw1y
°° ≅ wx °°ox Λ°l~„ª¬¯¨ ±·ttss型高效液相色谱
仪 ~制备液相为 Š¬¯¶²±高效液相色谱仪 ~÷ • p {s„
旋涡混合器 k上海琪特分析仪器有限公司 l~׊p
tyŠ台式高速离心机 k上海安亭分析仪器厂 l∀
1q2 药品
关木通饮片购于药房 kussw年 tu月 tx日 lo产
地辽宁 o经北京大学药学院蔡少青教授鉴定为马兜
铃科植物东北马兜铃 Αριστολοχηια µ ανσηυριενσι󎲰q
的藤茎 k编号 xyuul∀
马兜铃酸 ´ !马兜铃酸 µ购于 ≥¬ª°¤公司 k≥·q
²∏¬¶o  ’o ˜≥„o²·s|uŽtuw|lo其中 „„ 2´ 和 „„2
µ分别各占 wsh oxyh o采用高效液相色谱制备方
法对该混合品进行分离纯化 o得到 „„ 2´ o„„2µ的
单一对照品 ∀以 „„ 2´ o„„2µ的混合品为原料 o按
文献方法进行合成得到 „2´ 和 „2µ的混合
品 ≈{  o采用高效液相色谱制备方法对混合品进行分
离纯化得到 „2´ o„2µ的单一对照品 ∀各对照品
的纯度均大于 |{1sh ∀分别精密称取 „„ 2´ o„„2
µ o„2´ o„2µ对照品 t °ªo加甲醇溶解 o配制成
浓度为 tss Λª# °pt单一成分的储备液 ∀再分别
精密吸取 w种化合物的储备液适量 o采用逐级稀释
的方法 o以甲醇稀释成所需浓度的混合对照品溶液 ∀
1q3 动物
• ¬¶·¤µ大鼠 o雄性 o体重 tyx ∗ usx ªo鼠龄 z ∗ {
周 o购自中国科学院动物所 o合格证号 ≥≤÷ ÷ k京 l
usss2sssy∀
2 方法和结果
2q1 高效液相色谱 k‹°≤l条件
流动相 }„相 2th 醋酸 2s1suh 三乙胺水溶液
k„tl或 s1th 甲酸 2s1suh 三乙胺水溶液 k„ulo…
相 2乙腈 o流速 s1{ °# °¬±pt ∀柱温 ux ε ∀进样量
us ˏ∀梯度 tk采用 „tlk…h l}s ∗ tx °¬±ovyh ∗
v{h ~tx ∗ vs °¬±ov{h ∗ wsh ~vs ∗ vx °¬±owsh ∗
wth ~vx ∗ v| °¬±owth ∗ wvh ~v| ∗ wx °¬±owvh ∗
xsh ∀梯度 uk采用 „ulk…h l}s ∗ tx °¬±otsh ∗
vsh ~tx ∗ ux °¬±ovsh ∗ vvh ~ux ∗ vs °¬±ovvh ∗
vv1xh ~vs ∗ wx °¬±ovv1xh ∗ vzh ~wx ∗ yx °¬±o
vzh ∗ vz1xh ~yx ∗ zx °¬±ovz1xh ∗ vz1xh ~zx ∗
{s °¬±ovz1xh ∗ v|h ~{s ∗ |s °¬±ov|h ∗ wvh ~|s
∗ |x °¬±owvh ∗ xsh ∀
2q2 关木通水煎液的制备
称取关木通饮片适量 o加入约 ts倍量水浸泡
vs °¬±o武火煮沸后 o文火煮 vs °¬±o纱布过滤 o留待
浓缩 ~残渣再次加入约 ts倍量水 o武火煮沸后 o文火
煮 vs °¬±o纱布过滤 o留待浓缩 ∀合并两次滤液 o于
zs ε 水浴下旋转蒸发浓缩得到浓缩液 o测得其中
„„ 2´ 质量浓度为 u1u °ª# °pt ∀
2q3 样品的收集和处理
取雄性 • ¬¶·¤µ大鼠 tw只 o随机分成空白对照组
和实验组 o每组 z只 ∀空白对照组实验期间正常饮
食水 ∀实验组实验前适应性喂养 u §后 o灌胃给予
us °ª# ®ª pt的关木通水煎液 k按 „„ 2´ 含量 lo每
天 t次 o连续给药 z §∀分别收集给药期间空白对照
组和实验组的大鼠尿样 o{ sss µ# °¬±pt离心 w °¬±o
取上清液 t1s °o加入 x °²¯# pt盐酸 o涡旋混匀 t
°¬±ous ε 水浴中孵化 wx °¬±后 o加于活化处理过的
固相萃取小柱上进行固相萃取 ∀
固相萃取流程 }用一定量的甲醇 !水先后通过
≥°∞柱后加样 ~用一定量的淋洗溶剂淋洗 ~再用一定
量的洗脱溶剂洗脱 o收集全部洗脱液 o置于 ws ε 水
浴中 o氮气挥干 o残渣加 txs ˏ甲醇 k色谱纯 l溶
解 o过 s1wx Λ°有机滤膜 ow ε 保存备用 ∀
2q4 固相萃取柱的选择
采用填料为 ≤t{的 „ª¬¯¨ ±·≤t{ rtss °ªo„¯¯·¨¦«
‹≤t{ rtss °ªo„¯¯·¨¦« ≤t{ rtss °ªo„¯¯·¨¦« ≤t{ rvss
°ª和填料为 °«¨ ±¼¯的 „ª¬¯¨ ±·°«¨ ±¼¯ russ °ª等 x
种固相萃取小柱对大鼠尿样 t1s °进行固相萃取 o
以 u1s °甲醇活化 !u1s °水清洗 !s1y °th醋
酸 2s1suh三乙胺水溶液淋洗 !u1s °甲醇洗脱的
条件处理后 o采用梯度 t进行分析 o给药后大鼠代谢
尿样的高效液相色谱图中出现了 „„ 2´ o„„2µ o
„2´ o„2µ k分别为 t{otxotz和 tw号色谱峰 l和
ty个其他的 „„¶和 „¶化合物的色谱峰 o见图 t∀
经 x种不同的 ≥°∞柱萃取后 o这 us个 „„¶和 „¶
化合物的色谱峰面积见表 t∀
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图 t 给药后大鼠代谢尿样与空白尿样的 ‹ °≤图
¥¯¤±®2空白尿样 ~° ·¨¤¥²¯¬¶°2代谢尿样 ~
数字 2„„¶和 „¶化合物的色谱峰峰号
表 t us个 „„¶和 „¶化合物经 x种 ≥°∞小柱
萃取后的 ‹ °≤峰面积
峰号
„ª¬¯¨ ±·
°«¨ ±¼¯
russ °ª
„ª¬¯¨ ±·
≤t{
rtss °ª
„¯¯·¨¦«
‹≤t{
rtss °ª
„¯¯·¨¦«
≤t{
rtss °ª
„¯¯·¨¦«
≤t{
rvss °ª
t yxy1t wtx1{ wsx1y vys1s w{y1u
u www1y uxv1z uws1| uyt1y vs|1y
v tzv1y ttx1| tuu1s tuz1| twt1|
w u vw|1s t vtt1s t vuv1w t wtt1s t yxw1u
x uvs1| tvz1y twz1s txt1| tzw1s
y v z{v1t u v{{1s u wyv1v u wux1v u |{s1s
z xyu1{ vxs1t vys1u vxz1{ wuv1u
{ tz{1y tsy1u tsy1s ts{1{ tvv1s
| uy1| {1y ty1y ts1t uy1{
ts {s1x ws1v w|1x wt1s y{1v
tt uy1w tu1w tv1s tw1x uw1s
tu |{1y vs1v xu1{ w{1s x{1y
tv ttx1v vv1z wv1w xx1| {t1|
twk¤l {{1v ww1s wz1{ xu1s |v1y
txk¥l tzz1s ttw1w ttx1y tvv1u tzs1|
ty v{1v us1z uu1u uv1s vv1{
tzk¦l u{1| ty1y tu1w tw1| tv1{
t{k§l uu1x {1| ts1w tu1u tv1|
t| utw1v tvz1{ twu1s txt1v tyu1v
us yu1x vz1y v{1w vw1x wv1{
¤¥¦§w峰合计 vty1z t{v1| t{y1u utu1v u|u1u
其余的峰合计 | swt1x x v||1z x xwy1v x x{u1y y {st1y
总和 | vx{1u x x{v1y x zvu1x x z|w1| z s|v1{
由表 t可见 ox种 ≥°∞柱对大鼠尿样中 „„¶和
„¶化合物的萃取保留作用强弱为 }„ª¬¯¨ ±·°«¨ ±¼¯ r
uss °ª  „¯¯·¨¦« ≤t{ rvss °ª  „¯¯·¨¦« ≤t{ rtss °ª
k„¯¯·¨¦«‹≤t{ rtss °ªl  „ª¬¯¨ ±·≤t{ rtss °ªo即萃取
效果 „ª¬¯¨ ±·°«¨ ±¼¯ russ °ª最强 o„ª¬¯¨ ±·≤t{ rtss °ª
最弱 ∀比较发现 o除 twk„2µl‹°≤色谱峰面积以
外 o尿样采用美国 „ª¬¯¨ ±·公司 uss °ª的 °«¨ ±¼¯固相
萃取小柱处理后的 t|个 „„¶和 „¶目标成分的峰面
积及总峰面积均是最大的 o综合考虑后选择 „ª¬¯¨ ±·
°«¨ ±¼¯ russ °ª作为本研究的固相萃取小柱 ∀
2q5 淋洗溶剂的选择
在 t1s °大鼠空白尿样中加入各对照品浓度
均为 ts Λª# °pt的 „„ 2´ o„„2µ o„2´ 和 „2µ
的混合对照品溶液 ts ˏo采用 „ª¬¯¨ ±·°«¨ ±¼¯ russ
°ª≥°∞柱 ou1s °甲醇活化 ou1s °水清洗 ot1s
°水或 th 醋酸 2s1suh 三乙胺水溶液淋洗 ou1s
°甲醇洗脱的条件处理后 o对以水和 th 醋酸 2
s1suh三乙胺水溶液分别作为淋洗溶剂时的 w个目
标成分的萃取回收率进行考察 o采用梯度 t进行分
析 o得各洗脱峰的 ‹°≤峰面积 o重复 v次实验 o其
峰面积平均值与对照品溶液的峰面积平均值进行比
较 o计算萃取回收率 o结果见表 u∀
由表 u可知 o上样后分别用水或 th醋酸 2s1suh
三乙胺水溶液 k³‹ u1{l淋洗时 o后者对于 „„ 2´ o„„2µ
的萃取回收率在 zx1sh以上 o而水则在 vsh以下 o后
者是前者的 u倍以上 o说明后者淋洗明显优于水淋
洗 ~采用水淋洗时 o„2´ o„2µ的回收率略高于后者淋
洗 ∀综合考虑的结果 o为兼顾 w种目标成分均能有较
高的回收率 o选择后者即 th醋酸 2s1suh三乙胺水溶
液作为加样后洗去杂质的淋洗溶剂 ∀
2q6 洗脱溶剂的选择
在 t1s °大鼠空白尿样中加入各对照品浓度
均为 ts Λª# °pt的 „„ 2´ o„„2µ o„2´ 和 „2µ
的混合对照品溶液 ts ˏo采用 „ª¬¯¨ ±·°«¨ ±¼¯ russ
°ª≥°∞柱 !u1s °甲醇活化 !u1s °水清洗 !s1y
°th醋酸 2s1suh三乙胺水溶液淋洗的条件 o考察
表 u w种目标成分经 u种淋洗溶剂淋洗后的萃取回收率 kν € vl
对照品
成分 均值
水
t u v 均值 • ≥⁄rh 回收率 rh
th醋酸 2s1suh三乙胺水溶液
t u v 均值 • ≥⁄rh 回收率 rh
„2µ {z1t zt1v {z1u zt1x zy1z tt {{1s y{1z yy1y zx1v zs1u y1x {s1y
„2´ |t1u yu1w z{1| zt1z zt1s tt zz1| xv1s xv1| yu1s xy1v {1{ yt1z
„„ 2µ |v1y uu1x u|1x ux1y ux1| tv uz1z zv1z zs1w yz1u zs1w w1y zx1u
„„ 2´ zw1w tu1| tz1y tx1{ tx1w tx us1z xz1t xy1z xz1v xz1s s1x zy1y
#xtyu#
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不同洗脱溶剂 v1s °的洗脱效果 o平行制备 w份样
品 o采用梯度 t进行分析 ∀以 w种目标成分的萃取
回收率为考察指标 o分别考察了乙醚 !丙酮 !氯仿 !醋
酸乙酯 !二氯甲烷 !甲醇 !乙腈等 z种不同的溶剂 ∀
以各目标峰的峰面积平均值与对照品溶液的峰面积
平均值进行比较 o计算萃取回收率 o结果见表 vo色
谱图见图 u∀
分析发现 }尿样经乙醚 !丙酮 !氯仿 !醋酸乙酯等
表 v w种目标成分经不同洗脱溶剂洗脱后的萃取回收率 h
洗脱溶剂 „2µ k• ≥⁄rh l „2´ k• ≥⁄rh l „„ 2µ k• ≥⁄rh l „„ 2´ k• ≥⁄rh l 平均值
醋酸乙酯 wz1zkttl v{1ykz1zl ww1sktvl wv1{ktul wv1x
氯仿 yx1wkusl ww1zkuul {z1sktsl z{1sktxl y{1{
丙酮 yx1zkusl zs1vkvyl zv1ukuyl yz1vkuxl y|1t
乙腈 {t1xkz1{l zt1uk|1wl y|1{kutl yz1zktwl zu1y
甲醇 {s1|ktul zv1wkttl {t1tktul {t1tkttl z|1t
二氯甲烷 vx1{kttl ux1yk|1yl wz1skt{l vt1skt|l vw1|
乙醚 {u1yk{1wl {t1tkz1wl {s1zkz1wl {w1tky1|l {u1t
图 u w种目标成分经各种洗脱溶剂洗脱后的 ‹ °≤图
w种洗脱溶剂洗脱后 o均在 „2´ 的前方有内源性干
扰色谱峰 ÷ o二者的分离度 • 在 s1x ∗ t1to不能满
足分析要求 ~而经二氯甲烷 !甲醇 !乙腈等洗脱后 ow
种目标成分附近均无干扰 ∀由表 v中的回收率结果
可以看出 o乙醚对 w种目标成分 k„„ 2´ o„„2µ o„2
´ o„2µ l的萃取回收率最高 o平均为 {u1th o但经
其洗脱后色谱图中有内源性干扰色谱峰 ÷ ~内源性
色谱峰不干扰目标成分的洗脱溶剂中 o二氯甲烷对
w种目标成分 k„„ 2´ o„„2µ o„2´ o„2µ l的萃取
回收率均在 ysh以下 o而甲醇对这 w种成分的萃取
回收率均在 zsh以上 o乙腈洗脱后 „„ 2´ 的回收率
未达到 zsh o而 „„2µ o„2´ o„2µ三者的回收率
与甲醇相近 ∀兼顾 w种目标成分都能具有较高的萃
取回收率 o选择甲醇作为固相萃取的洗脱溶剂 ∀
2q7 固相萃取条件的优化 ) ) ) 正交试验设计
2q7q1 采用正交试验对影响固相萃取效率的主要
因素及其不同水平进行优化选择 o设计了包括活化
体积 Α!清洗体积 Β!淋洗体积 Χ!洗脱体积 ∆等 w种
影响因素在内的 | kvw l正交试验见表 wo对样品固
相萃取条件进行优化 o每个编号的试验平行做 u次 ∀
表 w 固相萃取正交试验 °
‘²1 Α Β Χ ∆
t t1s t1s s1y t1s
u t1s v1s s1{ u1s
v t1s x1s t1s v1s
w v1s t1s s1{ v1s
x v1s v1s t1s t1s
y v1s x1s s1y u1s
z x1s t1s t1s u1s
{ x1s v1s s1y v1s
| x1s x1s s1{ t1s
2q7q2 评价指标的选择 采用梯度 u分析固相萃
取后的样品 o选择大鼠代谢尿样色谱图中 „„ 2´ o
„„2µ o„2´ o„2µ和其他 z个含量较高 !分离良
好的 „„¶和 „¶化合物 k峰号 }tovowozo|otsotvl
共 tt个色谱峰面积作为评价固相萃取优劣的指标 o
实验结果见表 xo极差与方差分析及结果小结见表
yo‹°≤图见图 v∀
由表 y可以看出 oΑ因素对 towotv号峰有显著
影响 oΒ因素对 tv号峰有显著影响 oΧ因素对 ts号
峰有显著影响 o∆因素对 tv号峰有显著影响 ∀由表
#ytyu#
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表 x 固相萃取正交试验中 tt个目标色谱峰的峰面积 kcξ ? σ, ν € ul
‘²1 t v w z | ts
t uvx1w ? s1x xvx ? tz1| zt|1z ? {1w tuu1{ ? s1z v|t1u ? w1u u yw|1u ? vz1y
u usx1{ ? ts1u wx{1{ ? vx1y y|s1y ? wt1t ttz1t ? s1{ wvv1s ? u{1y u {xv1| ? txt1y
v usx1u ? {1u vy|1{ ? s1z zuy1u ? |1s tuy1| ? w1v wzs1y ? tx1z v tuu1s ? w1x
w u|u1u ? v{1x w{z1x ? tx1x zvv1z ? ww1| tvz1w ? z1t wv|1w ? ww1{ u |xw1w ? uyx1|
x uyu1| ? z1| vy|1u ? tz1s zst1s ? ws1s tt|1z ? x1y wsx1w ? u|1| u |uy1y ? twu1|
y utw1| ? ux1u vvy1| ? y1v y{x1v ? xx1w ts{1z ? u1y vzy1z ? tz1s u wyu1s ? |y1x
z usu1u ? {1s vw{1y ? wt1u yvy1u ? tx1| ttu1s ? |1| wut1u ? ut1w u z|z1x ? zw1x
{ us{1u ? w1{ vyu1x ? wy1v y|w1| ? tv1z ts{1t ? y1{ vyv1t ? tz1y u wvv1y ? wx1{
| t{|1v ? {1u ws|1{ ? ts1v yxu1s ? z1t tsz1u ? t1w v{s1| ? uw1y u ywz1| ? tuv1z
‘²1 tv „2µ „„ 2µ „2´ „„ 2´
t y w|z1x ? tz{1s t{u1| ? s1s t|t1v ? v1z yx1s ? u1u wt1x ? t1s
u y tvu1t ? ww1x tz|1t ? {1t t|z1z ? y1{ y{1t ? s1w vu1y ? t1y
v y ut|1v ? tzu1v t|t1v ? s1v t|t1w ? t1u zv1u ? u1x vx1{ ? t1y
w y xsx1u ? vyy1x usu1t ? w1y ust1z ? v1z yz1w ? w1| vw1y ? u1u
x y vtz1z ? tx{1{ t|z1x ? {1w t|y1x ? z1y zy1w ? v1y vw1u ? u1{
y x ytv1| ? u{t1y tx|1{ ? y1v |x1s ? s1t yy1t ? s1v vz1s ? t1t
z x x|w1{ ? tyy1s tzx1v ? tu1u tzu1{ ? u1{ yz1y ? v1u vs1| ? s1{
{ x {{x1u ? xv1v tzx1v ? |1t ty|1{ ? t1x yy1z ? t1| vv1u ? t1w
| x xwu1y ? yy1v tyy1u ? u1{ ty|1y ? s1v zs1u ? u1t vu1x ? u1t
表 y 固相萃取正交试验中 tt个目标色谱峰面积的极差与方差分析结果小结
目标峰
因素
Α Β Χ ∆
影响大小 最佳水平组合
t tl Φ € vy1| Α  Β  ∆  Χ Αu ΒtΧu ∆v
v Χ  Β  Α  ∆ Αt ΒtΧu ∆t
w tl Φ € vw1| Α  ∆  Χ  Β Αt ΒtΧt ∆v
z Α  ∆  Β  Χ Αt ΒtΧu ∆t
| Χ  ∆  Α  Β Αt ΒtΧv ∆v
ts tl Φ € wt1| Χ  Α  ∆  Β Αt ΒtΧv ∆v
tv ul Φ € tst1y tl Φ € wx1{ tl Φ € xs1s Α  ∆  Β  Χ Αt ΒtΧu ∆v
ΑΛ2µ ⁄  ≤  …  „ „u …t ≤v ⁄v
ΑΑ2µ ≤  …  ⁄  „ „t …t ≤u ⁄v
ΑΛ2´ ≤  …  ⁄  „ „u …u ≤u ⁄t
ΑΑ2´ „  ≤  ⁄  … „t …t ≤t ⁄t
注 : ƒs1sx(u, u) € t|1ss, ƒs1st(u, u) € ||1ss; t) , u)分别表示 °  s1sx, Π  s1st
图 v 给药后大鼠代谢尿样与空白尿样的 ΗΠΛΧ图
βλανκ2空白尿样 ; µ εταβολισµ 2代谢尿样
y可知 , „因素的最佳水平有 „t , „u两个 ,其中 {个 目标峰 (v, w, z, |, ts, tv, ΑΑ2µ , ΑΑ2´ )的最佳水平
#ztyu#
第 vu卷第 uw期
ussz年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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⁄ ¦¨¨°¥¨ µo ussz
为 Αt , v个目标峰 (t, ΑΛ2µ , ΑΛ2´ )的最佳水平为
Αu ; …因素除 ΑΛ2´ 的最佳水平为 Βu外 ,其余 ts个
目标峰的最佳水平均为 Βt ; ≤因素的最佳水平有 v
个 , y个目标峰 (t, v, z, tv, ΑΑ2µ , ΑΛ2´ )的最佳水
平为 Χu , v个目标峰 (|, ts, ΑΛ2µ )的最佳水平为
Χv , u个目标峰 (w, ΑΑ2´ )的最佳水平为 Χt ; ⁄因素
的最佳水平有 u个 , z个目标峰 (t, w, |, ts, tv, ΑΛ2
µ , ΑΑ2µ )的最佳水平为 ∆v , w个目标峰 (v, z, ΑΛ2
´ , ΑΑ2´ )的最佳水平为 ∆t ∀根据各因素的这些最
佳水平 ,可以针对要分析的目标成分有意识地选择
各因素的最佳水平组合 ∀的目的是尽可能测定多种
ΑΑσ及 ΑΛσ化合物 ,综合考虑后确定因素水平最佳组
合为 : Αt , Βt , Χu , ∆v ,即固相萃取条件优化为 :活化体
积 t1s µ Λ!清洗体积 t1s µ Λ!淋洗体积 s1{ µ Λ!洗脱
体积 v1s µ Λ∀
3 结论与讨论
马兜铃酸类 (ΑΑσ)和马兜铃内酰胺类 (ΑΛσ)化
合物为中等极性或极性较小的化合物 ,且结构中含
有多个苯环 ,而尿样为极性基质 ,故选择反相 ΣΠΕ
对目标化合物进行萃取 ∀以 ΑΑ2´ , ΑΑ2µ , ΑΛ2´ ,
ΑΛ2µ和其他 ty个 ΑΑσ及 ΑΛσ化合物的 ΗΠΛΧ色谱
峰面积为指标 ,比较了填料分别为 Χt{的 ΑγιλεντΧt{ /
tss µ γ , Αλλτεχη ΗΧt{ /tss µ γ , Αλλτεχη Χt{ /tss µ γ , Αλλ2
τεχη Χt{ /vss µ γ和填料为苯基的 Αγιλεντ Πηενψλ/uss
µ γ等不同规格的 x种 ΣΠΕ小柱对目标成分的萃取
保留作用的强弱 ;以 ΑΑ2´ , ΑΑ2µ , ΑΛ2´ 和 ΑΛ2µ的
萃取回收率为指标 ,比较了水或 t%醋酸 2s1su%三
乙胺水溶液分别作为淋洗溶剂时以及乙醚 !丙酮 !氯
仿 !醋酸乙酯 !二氯甲烷 !甲醇 !乙腈等分别作为洗脱
溶剂时对这 w种目标成分萃取效果的影响 ∀从而选
定 uss µ γ的 Αγιλεντ Πηενψλ作为固相萃取小柱 , t%
醋酸 2s1su%三乙胺水溶液作为淋洗溶剂 ,甲醇作为
洗脱溶剂 ∀
在大量的实验研究中 ,作者发现尿样处理过程
中 ΑΑσ和 ΑΛσ化合物受固相萃取小柱的活化程度 !
淋洗程度以及洗脱程度等因素的影响较大 ,故设计
了包括活化体积 !清洗体积 !淋洗体积 !洗脱体积等
w种影响因素在内的 Λ| (vw )正交试验对固相萃取条
件进行优化 ∀以 ΑΑ2´ , ΑΑ2µ , ΑΛ2´ , ΑΛ2µ和其他
z个分离较好的 ΑΑσ及 ΑΛσ化合物的 ΗΠΛΧ峰面积
为指标 ,选择最佳的因素水平 ∀极差分析和方差分
析结果表明 ,不同的目标峰受这 w个因素的影响大
小有所不同 ,因此作者认为应根据要测定的目标物
的不同来选择最佳的因素水平 ∀本文欲尽可能测定
较多的目标成分 ,经综合考虑后 ,最终确定的尿样
ΣΠΕ条件为 : Πηενψλ ΣΠΕ柱 /uss µ γ ,活化用甲醇
t1s µ Λ,清洗用水 t1s µ Λ,淋洗用 t%醋酸 2s1su%
三乙胺水溶液 s1{ µ Λ,洗脱用甲醇 v1s µ Λ,尿样上
样量为 t1s µ Λ,流速为 t1s µ Λ# µ ιν p t ∀
Ωαν Χηαν等 [ y]采用 xss µ γ的 Ωατερσ Χt{ Σεπ2
Πακ ΣΠΕ柱 ,上样量为 x µ Λ尿样 ,以 v µ Λ水 !u µ Λ
水 2甲醇 (tΒw)淋洗 ,以 v µ Λ甲醇洗脱 ,仅对未水解
的马兜铃内酰胺 2Ια的 ‘2葡糖醛酸苷和 ’ 2葡糖醛酸
苷以及 ΑΛ2µ的 ‘2葡糖醛酸苷等 v个马兜铃内酰胺
的葡糖醛酸苷进行定性分析 ,未发现其他相关化合
物 ∀与其相比 ,本研究建立的固相萃取 (ΣΠΕ)法更
简单 !快速 !经济 ,且能够很好的消除内源性干扰物
质 ,选择性富集大鼠尿样中 ΑΑ2´ , ΑΑ2µ , ΑΛ2´ , ΑΛ2
µ及其他多种 ΑΑσ及 ΑΛσ化合物 ,为尿中马兜铃酸
及马兜铃内酰胺类化合物的定性分析及含量测定提
供了很好的技术手段 ∀
[参考文献 ]
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Στυδιεσ ον σολιδ πηασε εξτραχτιον µ ετηοδ οφ αριστολοχηιχ αχιδσανδ
αριστολολαχταµ σ ιν ρατ υρινε
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(t. Σχηοολοφ Πηαρµ αχευτιχαλΣχιενχεσ, Πεκινγ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsss{v, Χηινα;
u. Ρ εναλ∆ιϖισιον, Φιρστ Ηοσπιταλ, ∆επαρτµ εντ οφΜεδιχινεσ, Πεκινγ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsssvw, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ §¨ √¨¯²³¤∏µ¬±¨³µ¨·µ¨¤·° ±¨·° ·¨«²§²©≥²¯¬§°«¤¶¨ ∞¬·µ¤¦·¬²± k≥°∞l ©²µ·«¨ ∏´¤±·¬·¤·¬√¨§¨ ·¨µ°¬±¤2
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¤µ¬¶·²¯²¯¤¦·¤°¶¬± µ¤·∏µ¬± q¨
[ Κεψ ωορδσ] ¶²¯¬§³«¤¶¨ ¬¨·µ¤¦·¬²±~ ¤µ¬¶¶·²¯²¦«¬¦¤¦¬§¶~ ¤µ¬¶·²¯²¯¤¦·¤°¶~ µ¤·∏µ¬± ~¨ ²µ·«²ª²±¤¯ ·¨¶·
≈责任编辑 王亚君  
≈收稿日期   ussz2sv2st
≈基金项目   新疆维吾尔自治区少数民族科技人才特殊培养专项基金 kussx2yl
≈通讯作者   3 古丽娜 #沙比尔 oר¯}ks||tluyuwztwo∞2°¤¬¯}ª∏¯±¤µ®¶¤¥¬µƒ tyvq¦²°
‹°≤同时测定苦豆子中槐定碱 !氧化槐果碱和
氧化苦参碱的含量
古丽娜 #沙比尔 t3 o阿吉艾克拜尔 #艾萨 u o石明辉 t o贾晓光 t
ktq新疆中药民族药研究所 o新疆 乌鲁木齐 {vsssu~
uq中国科学院 新疆理化技术研究所 o新疆 乌鲁木齐 {vssttl
≈摘要   目的 }建立同时测定苦豆子中槐定碱 !氧化槐果碱及氧化苦参碱含量的 ‹ °≤测定法 ∀方法 }色谱柱
为 °«¨ ±²° ±¨ ¬¨ Š °¨¬±¬≤t{ kw1y °° ≅ uxs °°ox Λ°lo以甲醇 k„l2s1uh磷酸水 k…l为流动相 o检测波长 usx ±°o流
速 t °# °¬±pt o柱温 vs ε ∀结果 }在线性范围内 v个对照品的标准曲线呈良好的线性关系 kρ∴ s1||| zl∀平均回
收率分别为 tss1sh o|z1sh o|z1sh ∀结论 }可通过 ‹ °≤同时测定苦豆子中槐定碱 !氧化槐果碱和氧化苦参碱的
含量 o并可用该方法进行苦豆子药材的质量控制 ∀
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