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Optimization of extraction procedure of psammosilene tunicoides by uniform design with pharmacodynamic index

均匀设计法结合药效学指标优选金铁锁提取工艺



全 文 :均匀设计法结合药效学指标优选金铁锁提取工艺
黄春青1,林亚平2,靳凤云1,张永萍1
(1.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;
2.贵州省食品药品监督管理局,贵州 贵阳 550004)
[摘要] 目的:针对抗炎、镇痛和急性毒性作用,优选金铁锁药材的最佳提取工艺条件,探讨几种浸出物量与
药效学指标间关系。方法:采用均匀设计法,部分指标取相对水平,以抗炎、镇痛实验结果和LD50作为评价指标,对
金铁锁的提取工艺条件进行优选,同时测定干膏率、水浸出物、醋酸乙酯浸出物、乙醚浸出物。结果:最佳提取工艺
为:8倍量pH6~7的水回流提取2次,每次2h;最佳提取工艺条件验证结果满意;干膏率、水浸出物、醋酸乙酯浸
出物、乙醚浸出物与药效学指标不存在明显相关关系。结论:用均匀设计法结合药效学指标优选金铁锁提取工艺
条件,具有与功能主治密切结合的特点,所得最佳提取工艺条件适合工业生产,且药效学验证结果较为稳定。研究
结果还表明,所测定的几种浸出物均不宜作为与功能主治有关的质量控制指标。
[关键词] 金铁锁;提取工艺;均匀设计;药效学指标;浸出物
[中图分类号]R283 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)15181704
[收稿日期] 20071009
[基金项目] 贵州省跨世纪科技人才工程专项资金项目[黔科
合人专字(2000)9812号]
[通讯作者] 林亚平,Tel:(0851)6828937,Email:lypgz@126.
com
  金铁锁为石竹科 Caryophylaceae植物金铁锁
PsammosilenetunicoidesW.C.WuetC.Y.Wu的干
燥根。金铁锁使用历史悠久,是贵州苗族常用品种,
也是许多伤科要药的重要组成药材之一,功能解毒、
散瘀、止痛、祛风除湿,内服或外用,主要用于跌扑损
伤、风湿痹痛、胃寒痛、创伤出血等[1]。现代药理实
验表明,金铁锁水煎浸膏对实验性类风湿性关节炎
大鼠灌胃后具有显著的镇痛、抗炎、解热作用[2],其
总皂苷对小鼠实验性疼痛有一定的抑制作用,对急
性和慢性炎症均有抑制作用[3]。化学研究表明,金
铁锁根中富含皂苷,经结构鉴定后均为齐墩果酸型
五环三萜化合物,另外还含有环二肽、环八肽类成分
及有机酸[49]。鉴于金铁锁的临床应用及其毒性作
用,考虑将其设计为经皮给药新制剂进行研究。因
目前暂不能获得其皂苷类对照品,故用均匀设计法
结合药效学指标优选金铁锁提取工艺条件,并初步
探讨各种浸出物量与药效学指标间的相关关系。
1 仪器与试药
药材金铁锁购自贵阳市药材市场,经贵阳中医
学院生药教研室刘秡教授鉴定为石竹科植物金铁锁
Ptunicoides的干燥根;乙醇、二甲苯、冰醋酸、乙醚、
醋酸乙酯等均为分析纯;清洁级昆明种小鼠,购自贵
阳医学院实验动物中心[许可证号 SCXY(黔)2002
0001]。
TN型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器
厂);MODELDS-671电子秤(上海寺冈电子有限
公司);AB104-N型电子天平(瑞士梅特公司);RE
52-05型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH
-4型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司);
CX-500型超声波清洗机(北京市医疗设备二厂)。
2 方法与结果
2.1 用多指标均匀设计法对提取工艺进行优选
根据金铁锁药理作用的相关报道,结合本制剂
的功能主治,考虑适应工业生产的要求,选择常用的
水和乙醇作为提取溶媒,确定溶媒含醇量、提取方
法、溶媒用量、提取时间、提取次数和溶媒 pH为考
察因素;所得各提取物的水浸出物、醋酸乙酯浸出
物、乙醚浸出物及其抗炎、镇痛和急性毒性实验结果
为评价指标;用 U8(4
6)均匀表[10]进行优选。相应
的考察因素水平表和实验实施方案见表1,2。
各号实验如下进行:称取300g药材粗粉(测得
药材水分为1204%),加入方案规定的提取溶媒,
浸泡 30min,第1次提取溶媒用量考虑药粉的吸液
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表1 金铁锁提取工艺优选考察因素及水平
水平
X1
溶媒含醇量/%
X2
提取方法
X3
溶媒用量1)
X4
提取时间/h2)
X5
提取次数
X6
溶媒pH
1 0 回流 1 长 1 5
2 30 回流 2 长 2 6
3 60 超声 3 短 3 7
4 90 超声 4 短 4 8
  注:1)溶媒用量设定为依据提取方法的相对水平。对回流法,水平代码1~4分别对应为2~5倍量溶媒;对超声法,水平代码1~4分别对
应5~8倍量溶媒;2)提取时间亦设定为依据提取方法的相对水平。对回流法,长为2h,短为1h;对超声法,长为05h,短为025h
表2 金铁锁提取工艺优选均匀设计实验试验方案
No.
X1
溶媒含醇量(%)
X2
提取方法
X3
溶媒用量(倍)
X4
提取时间(h)
X5
提取次数
X6
溶媒(pH)
1 1(0) 1(回流) 3(4) 3(1) 1(1) 2(6)
2 1(0) 4(超声) 2(6) 3(1/4) 4(4) 3(7)
3 2(30) 2(回流) 1(2) 3(2) 3(3) 1(5)
4 2(30) 3(超声) 4(8) 3(1/2) 2(2) 4(8)
5 3(60) 2(回流) 1(2) 3(1) 2(2) 4(8)
6 3(60) 3(超声) 4(8) 3(1/4) 3(3) 1(5)
7 4(90) 1(回流) 3(4) 3(2) 4(4) 3(7)
8 4(90) 4(超声) 2(6) 3(1/2) 1(1) 2(6)
  注:括号外为均匀表的水平代码,括号内为实验取值
率,各提取溶媒吸液率分别为:水(451%),30%乙
醇(411%),60%乙醇(334%),90%乙醇(230%),
按表2所示的其他各相应条件进行实验,减压浓缩
得浸膏。
测定浸膏得率及其水浸出物、醋酸乙酯浸出物、
乙醚浸出物的量(2005年版药典一部附录Ⅹ浸出物
测定法),并取各号浸膏如下分别进行抗炎实验、镇
痛实验和急性毒性实验。
抗炎实验:取昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±
2)g,随机分成高剂量组(04g药材/mL)、低剂量组
(02g·mL-1)和对照组(蒸馏水),每组10只。在
小鼠右耳按003mL/只/次分别涂上提取液或蒸馏
水,连续给药2d(2次/d),末次给药30min后,于小
鼠右耳两面涂二甲苯30μL/只,左耳不涂作为正常
耳。20min后将小鼠处死,剪下小鼠左、右两耳,用内
径为6mm的打孔器取下左、右耳片,立即于电子天平
上精密称定,以两耳片重之差(mg)作为肿胀度指标,
统计分析各组间差异。
镇痛实验:取昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±
2)g,随机分成高剂量组(04g·mL-1)、低剂量组
(02g·mL-1)和对照组(蒸馏水),每组10只。每
只小鼠腹部约1cm×2cm去毛,涂上提取液或蒸馏
水,按01mL/只/次连续给药2d(2次/d),末次给药
30min后,各鼠按001mL·g-1腹腔注射06%醋酸
溶液,立即观察并记录各组小鼠镇痛作用的潜伏期、
10min内产生扭体反应的动物数及其扭体次数,统计
分析各组间差异。
急性毒性实验:取昆明种小鼠,雌雄各半,随机
分成5组,每组10只,体重(20±2)g,每只按002
mL·g-1给药,一次灌胃不同剂量的各号实验提取
物,观察记录7d内死亡动物数,并按改进寇氏法计
算各提取物的LD50及SLD50
[11]。
2.2 结果
将均匀设计方案中各次试验各变量的相应取值
及各对应 Y1,Y2,Y3,Y4,Z11,Z12,Z21,Z22,Z3值输入
计算机,用统计软件SPSS进行二次多项式逐步回归
分析,得回归方程如表4。
显然,抗炎作用(Z11,Z12)和镇痛作用(Z21,Z22)
的期望指标值小好而LD50(Z3)的期望指标值大好,
并考虑生产实际,由回归方程直接分析或用优化计算
软件JYSYSJ[12]计算,初步确定最佳提取工艺条件为:
用8倍量的水(pH6~7)回流提取2次,每次2h。
按此工艺条件重复制备3批浸膏,按上述方法
分别测定各评价指标,结果见表4。
3 讨论
在实验暂时无法获得化学对照品的情况下,用
镇痛、抗炎和急性毒性实验的药效学指标进行提取
工艺条件的筛选。实验结果表明,本研究范围内,不
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   表3 金铁锁提取工艺均匀设计的实验数据
No
Y1
干膏率/%
浸出物/%
Y2

Y3
醋酸乙酯
Y4
乙醚
药效学指标
Z11
抗炎低剂量
Z12
抗炎高剂量
Z21
镇痛低剂量
Z22
镇痛高剂量
Z3
LD50±SLD50
1 29545 89780 0492 0009 1742) 2492) 295 270 13326±01182
2 39780 92630 0229 0011 2812) 1372) 258 2451) 17441±01375
3 39760 88290 0696 0030 2852) 5392) 230 2201) 11437±01006
4 26295 94300 0512 0016 3452) 2742) 220 2032) 09732±00713
5 30420 100070 1044 0290 3712) 4852) 375 1582) 10675±00658
6 37350 94170 0911 0838 2902) 3072) 267 252 10028±00778
7 23260 92760 4370 2414 2122) 1922) 375 2202) 10418±00751
8 2375 92490 7974 3017 3242) 3322) 248 2361) 13339±00696
  注:与空白组比1)P<005;2)P<001;空白组数据:抗炎892±2079,镇痛324±608
表4 金铁锁提取工艺的逐步回归方程
回归方程 r P
Y1=2365-0126X1X2+28467X5-4858X25 0930 0032
Y2=88611+0165X26-1509X3X4+0024X2X5 0961 0011
Y3=0217+0001X21-0014X1X5 0968 0001
Y4=0041+0001X21-0004X1X6 0990 0000
Z11=2204+0006X1X6+0651X22-0300X3 0983 0015
Z12=3998+0388X3X5-1646X3X4+4905X2X4-1745X2X5+0073X5X6 0999 0003
Z21=53382+0118X1X4-13336X2X4-10388X2 0995 0000
Z22=-47796-2022X26+24226X6-0021X1X2+0074X23 0987 0010
Z3=1938-0002X1X5+0158X25-0689X5 0961 0011
表5 金铁锁最佳提取工艺验证结果
No
Y1
干膏率/%
浸出物/%
Y2

Y3
醋酸乙酯
Y4
乙醚
药效学指标
Z11
抗炎低剂量
Z12
抗炎高剂量
Z21
镇痛低剂量
Z22
镇痛高剂量
Z3
LD50±SLD50
 1 44510 93431 0384 0070 432 321 264 171 16163±01180
 2 43498 94350 0382 0072 329 357 223 160 16368±01392
 3 44053 91969 0419 0063 495 246 199 208 15163±01191
RSD(%) 115 129 531 692 2002 1839 1437 1412  
  注:空白组数据:抗炎642±2658;镇痛270±531
同提取工艺条件所得金铁锁提取物均具有极显著的
抗炎作用,且各实验组间抗炎作用、镇痛作用和急性
毒性存在明显差异。验证实验表明,所得最佳提取
工艺条件结果较满意,重现性良好且适合工业生产。
反映了本研究的设计方法和技术路线是科学、合理、
必要和可行的。
采用了水平重复的U8(4
6)均匀表进行设计,同
时将其中的溶媒用量、提取时间取为相对水平,旨在
将不同提取方法安排在同一张均匀表中,有效减少
实验次数,获得对各因素间交互作用的统一认识。
验证结果表明,这种设计方法是科学、合理、可行的。
试图通过对提取物的水、醋酸乙酯和乙醚浸出
物与药效学指标的相关分析,奠定以浸出物对提取
物内在质量进行初步控制的基础。这种综合药效学
和浸出物指标对药材提取工艺条件进行优选的方
法,尚未见有报道。测定浸出物时,选择水、醋酸乙
酯和乙醚作为浸出溶剂,旨在发现和分析不同极性
溶剂的浸出物与毒性、药效之间的相关性,但实验结
果表明,这几种浸出物均不宜作为与功能主治有关
的质量控制指标,有待进一步深入研究。
急性毒性实验中发现,金铁锁各提取物灌胃对
小鼠胃肠道毒性较大,几乎所有死亡小鼠的胃肠道
都有不同程度的出血或充血现象,且高剂量组小鼠
死亡较快,而经皮给药的药效学实验中,肉眼均未观
察到小鼠胃肠道及其他器官的明显变化。提示金铁
锁应慎重选择给药途径和剂量,同时奠定了金铁锁
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提取物经皮给药系统的安全性基础。
实验发现,除了动物个体差异的影响,包括时间
在内的药理实验条件的差异对实验结果的影响也很
大。工艺优选及其验证的实验过程一般较长,因此,
在物质群基本稳定的情况下,应先制备样品,再统一
并同步安排包括空白对照组在内的药效学实验,以
减少实验数据误差,提高数据分析质量。
[参考文献]
[1]  贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准
[S].贵阳:贵州科技出版社,2003:247.
[2]  许建阳,王发强,郑维发,等.金铁锁水煎浸膏对实验性类风
湿关节痛镇痛作用的研究[J].武警医学,2003,14(10):589.
[3]  宋烈昌.金铁锁总皂苷的药理研究[J].云南植物研究,1981,
3(3):289.
[4]  浦湘渝,周 俊.金铁锁的一个新三萜成分[J].云南植物研
究,1987,9(3):369.
[5]  浦湘渝,周 俊.金铁锁皂甙的研究[J].云南植物研究,
1989,11(2):198.
[6]  钟惠民,倪 伟,华 燕,等.金铁锁的新三萜皂苷[J].云南
植物研究,2002,24(6):781.
[7]  钟惠民,华 燕,倪 伟,等.金铁锁的两个新三萜皂苷[J].
云南植物研究,2003,25(3):361.
[8]  丁中涛,汪有初,周 俊.金铁锁根中的环肽成分[J].云南植
物研究,2000,22(3):331.
[9]  丁中涛,周 俊,谭宁华.金铁锁中的四个环二肽[J].中草
药,2000,31(11):803.
[10] 方开泰,马长兴.正交与均匀实验设计[M].北京:科学出版
社,2001:247.
[11] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,
1993:112.
[12] 林亚平.中药制剂均匀试验设计微机软件的研制与应用[J].
中国中药杂志,1995,20(8):473.
Optimizationofextractionprocedureofpsammosilenetunicoidesby
uniformdesignwithpharmacodynamicindex
HUANGChunqing1,LINYaping2,JINFengyun1,ZHANGYongping1
(1.GuiYangColegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China;
2.GuizhouProvincceFoodandDrugAdministration,Guiyang550004,China)
[Abstract] Objective:Forantiinflammation,relievingpainanddecreasingacutetoxicity,thebestconditionforextracting
procedureofPsammosilenetunicoideswaschosen.Andtherelationshipsbetweenseveralsolventextractsandpharmacodynamicindex
werestudied.Method:Uniformdesignwithmultitargetswasusedintheoptimizationprocess,andtheevaluateindexweretheresults
ofantiinflammation,relievingpainandLD50wereemployedastheevaluatingindexes.Atthesametime,thecontentsoftheextracts,
waterextract,aceticesterextractandetherextractweredetermined.Result:Thebestconditionisthatthemedicinalmaterialisopti
mizedwith8timesofwater(pH67)and2hofeachtime.Thebestconditionissatisfactorybytestverification.Andthepharmacody
namicactionsofantiinflammation,relievingpainandLD50werenotobviouslyrelatedtothedryextracts,waterextract,aceticesterex
tractandetherextract.Conclusion:Uniformdesignmethodwithpharmacodynamicindexhasthemeritofbeingrelaatedtothefunction
andsymptomdirectly.Theextractedtwicetechnologyconditionoptimizedisstable,feasibleandsuitableforindustryproduction.And
itisnotsuitabletotakethesolventextractsasqualitycontrolindexrelatedtothefunctionandsymptom.
[Keywords] Psammosilenetunicoides;extracttechnologyprocedure;uniformdesign;pharmacodynamicindex;solventextracts
[责任编辑 鲍 雷
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