全 文 :均匀设计法结合药效学指标优选金铁锁提取工艺
黄春青1,林亚平2,靳凤云1,张永萍1
(1.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;
2.贵州省食品药品监督管理局,贵州 贵阳 550004)
[摘要] 目的:针对抗炎、镇痛和急性毒性作用,优选金铁锁药材的最佳提取工艺条件,探讨几种浸出物量与
药效学指标间关系。方法:采用均匀设计法,部分指标取相对水平,以抗炎、镇痛实验结果和LD50作为评价指标,对
金铁锁的提取工艺条件进行优选,同时测定干膏率、水浸出物、醋酸乙酯浸出物、乙醚浸出物。结果:最佳提取工艺
为:8倍量pH6~7的水回流提取2次,每次2h;最佳提取工艺条件验证结果满意;干膏率、水浸出物、醋酸乙酯浸
出物、乙醚浸出物与药效学指标不存在明显相关关系。结论:用均匀设计法结合药效学指标优选金铁锁提取工艺
条件,具有与功能主治密切结合的特点,所得最佳提取工艺条件适合工业生产,且药效学验证结果较为稳定。研究
结果还表明,所测定的几种浸出物均不宜作为与功能主治有关的质量控制指标。
[关键词] 金铁锁;提取工艺;均匀设计;药效学指标;浸出物
[中图分类号]R283 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)15181704
[收稿日期] 20071009
[基金项目] 贵州省跨世纪科技人才工程专项资金项目[黔科
合人专字(2000)9812号]
[通讯作者] 林亚平,Tel:(0851)6828937,Email:lypgz@126.
com
金铁锁为石竹科 Caryophylaceae植物金铁锁
PsammosilenetunicoidesW.C.WuetC.Y.Wu的干
燥根。金铁锁使用历史悠久,是贵州苗族常用品种,
也是许多伤科要药的重要组成药材之一,功能解毒、
散瘀、止痛、祛风除湿,内服或外用,主要用于跌扑损
伤、风湿痹痛、胃寒痛、创伤出血等[1]。现代药理实
验表明,金铁锁水煎浸膏对实验性类风湿性关节炎
大鼠灌胃后具有显著的镇痛、抗炎、解热作用[2],其
总皂苷对小鼠实验性疼痛有一定的抑制作用,对急
性和慢性炎症均有抑制作用[3]。化学研究表明,金
铁锁根中富含皂苷,经结构鉴定后均为齐墩果酸型
五环三萜化合物,另外还含有环二肽、环八肽类成分
及有机酸[49]。鉴于金铁锁的临床应用及其毒性作
用,考虑将其设计为经皮给药新制剂进行研究。因
目前暂不能获得其皂苷类对照品,故用均匀设计法
结合药效学指标优选金铁锁提取工艺条件,并初步
探讨各种浸出物量与药效学指标间的相关关系。
1 仪器与试药
药材金铁锁购自贵阳市药材市场,经贵阳中医
学院生药教研室刘秡教授鉴定为石竹科植物金铁锁
Ptunicoides的干燥根;乙醇、二甲苯、冰醋酸、乙醚、
醋酸乙酯等均为分析纯;清洁级昆明种小鼠,购自贵
阳医学院实验动物中心[许可证号 SCXY(黔)2002
0001]。
TN型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器
厂);MODELDS-671电子秤(上海寺冈电子有限
公司);AB104-N型电子天平(瑞士梅特公司);RE
52-05型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH
-4型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司);
CX-500型超声波清洗机(北京市医疗设备二厂)。
2 方法与结果
2.1 用多指标均匀设计法对提取工艺进行优选
根据金铁锁药理作用的相关报道,结合本制剂
的功能主治,考虑适应工业生产的要求,选择常用的
水和乙醇作为提取溶媒,确定溶媒含醇量、提取方
法、溶媒用量、提取时间、提取次数和溶媒 pH为考
察因素;所得各提取物的水浸出物、醋酸乙酯浸出
物、乙醚浸出物及其抗炎、镇痛和急性毒性实验结果
为评价指标;用 U8(4
6)均匀表[10]进行优选。相应
的考察因素水平表和实验实施方案见表1,2。
各号实验如下进行:称取300g药材粗粉(测得
药材水分为1204%),加入方案规定的提取溶媒,
浸泡 30min,第1次提取溶媒用量考虑药粉的吸液
·7181·
第33卷第15期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 15
August,2008
表1 金铁锁提取工艺优选考察因素及水平
水平
X1
溶媒含醇量/%
X2
提取方法
X3
溶媒用量1)
X4
提取时间/h2)
X5
提取次数
X6
溶媒pH
1 0 回流 1 长 1 5
2 30 回流 2 长 2 6
3 60 超声 3 短 3 7
4 90 超声 4 短 4 8
注:1)溶媒用量设定为依据提取方法的相对水平。对回流法,水平代码1~4分别对应为2~5倍量溶媒;对超声法,水平代码1~4分别对
应5~8倍量溶媒;2)提取时间亦设定为依据提取方法的相对水平。对回流法,长为2h,短为1h;对超声法,长为05h,短为025h
表2 金铁锁提取工艺优选均匀设计实验试验方案
No.
X1
溶媒含醇量(%)
X2
提取方法
X3
溶媒用量(倍)
X4
提取时间(h)
X5
提取次数
X6
溶媒(pH)
1 1(0) 1(回流) 3(4) 3(1) 1(1) 2(6)
2 1(0) 4(超声) 2(6) 3(1/4) 4(4) 3(7)
3 2(30) 2(回流) 1(2) 3(2) 3(3) 1(5)
4 2(30) 3(超声) 4(8) 3(1/2) 2(2) 4(8)
5 3(60) 2(回流) 1(2) 3(1) 2(2) 4(8)
6 3(60) 3(超声) 4(8) 3(1/4) 3(3) 1(5)
7 4(90) 1(回流) 3(4) 3(2) 4(4) 3(7)
8 4(90) 4(超声) 2(6) 3(1/2) 1(1) 2(6)
注:括号外为均匀表的水平代码,括号内为实验取值
率,各提取溶媒吸液率分别为:水(451%),30%乙
醇(411%),60%乙醇(334%),90%乙醇(230%),
按表2所示的其他各相应条件进行实验,减压浓缩
得浸膏。
测定浸膏得率及其水浸出物、醋酸乙酯浸出物、
乙醚浸出物的量(2005年版药典一部附录Ⅹ浸出物
测定法),并取各号浸膏如下分别进行抗炎实验、镇
痛实验和急性毒性实验。
抗炎实验:取昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±
2)g,随机分成高剂量组(04g药材/mL)、低剂量组
(02g·mL-1)和对照组(蒸馏水),每组10只。在
小鼠右耳按003mL/只/次分别涂上提取液或蒸馏
水,连续给药2d(2次/d),末次给药30min后,于小
鼠右耳两面涂二甲苯30μL/只,左耳不涂作为正常
耳。20min后将小鼠处死,剪下小鼠左、右两耳,用内
径为6mm的打孔器取下左、右耳片,立即于电子天平
上精密称定,以两耳片重之差(mg)作为肿胀度指标,
统计分析各组间差异。
镇痛实验:取昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±
2)g,随机分成高剂量组(04g·mL-1)、低剂量组
(02g·mL-1)和对照组(蒸馏水),每组10只。每
只小鼠腹部约1cm×2cm去毛,涂上提取液或蒸馏
水,按01mL/只/次连续给药2d(2次/d),末次给药
30min后,各鼠按001mL·g-1腹腔注射06%醋酸
溶液,立即观察并记录各组小鼠镇痛作用的潜伏期、
10min内产生扭体反应的动物数及其扭体次数,统计
分析各组间差异。
急性毒性实验:取昆明种小鼠,雌雄各半,随机
分成5组,每组10只,体重(20±2)g,每只按002
mL·g-1给药,一次灌胃不同剂量的各号实验提取
物,观察记录7d内死亡动物数,并按改进寇氏法计
算各提取物的LD50及SLD50
[11]。
2.2 结果
将均匀设计方案中各次试验各变量的相应取值
及各对应 Y1,Y2,Y3,Y4,Z11,Z12,Z21,Z22,Z3值输入
计算机,用统计软件SPSS进行二次多项式逐步回归
分析,得回归方程如表4。
显然,抗炎作用(Z11,Z12)和镇痛作用(Z21,Z22)
的期望指标值小好而LD50(Z3)的期望指标值大好,
并考虑生产实际,由回归方程直接分析或用优化计算
软件JYSYSJ[12]计算,初步确定最佳提取工艺条件为:
用8倍量的水(pH6~7)回流提取2次,每次2h。
按此工艺条件重复制备3批浸膏,按上述方法
分别测定各评价指标,结果见表4。
3 讨论
在实验暂时无法获得化学对照品的情况下,用
镇痛、抗炎和急性毒性实验的药效学指标进行提取
工艺条件的筛选。实验结果表明,本研究范围内,不
·8181·
第33卷第15期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 15
August,2008
表3 金铁锁提取工艺均匀设计的实验数据
No
Y1
干膏率/%
浸出物/%
Y2
水
Y3
醋酸乙酯
Y4
乙醚
药效学指标
Z11
抗炎低剂量
Z12
抗炎高剂量
Z21
镇痛低剂量
Z22
镇痛高剂量
Z3
LD50±SLD50
1 29545 89780 0492 0009 1742) 2492) 295 270 13326±01182
2 39780 92630 0229 0011 2812) 1372) 258 2451) 17441±01375
3 39760 88290 0696 0030 2852) 5392) 230 2201) 11437±01006
4 26295 94300 0512 0016 3452) 2742) 220 2032) 09732±00713
5 30420 100070 1044 0290 3712) 4852) 375 1582) 10675±00658
6 37350 94170 0911 0838 2902) 3072) 267 252 10028±00778
7 23260 92760 4370 2414 2122) 1922) 375 2202) 10418±00751
8 2375 92490 7974 3017 3242) 3322) 248 2361) 13339±00696
注:与空白组比1)P<005;2)P<001;空白组数据:抗炎892±2079,镇痛324±608
表4 金铁锁提取工艺的逐步回归方程
回归方程 r P
Y1=2365-0126X1X2+28467X5-4858X25 0930 0032
Y2=88611+0165X26-1509X3X4+0024X2X5 0961 0011
Y3=0217+0001X21-0014X1X5 0968 0001
Y4=0041+0001X21-0004X1X6 0990 0000
Z11=2204+0006X1X6+0651X22-0300X3 0983 0015
Z12=3998+0388X3X5-1646X3X4+4905X2X4-1745X2X5+0073X5X6 0999 0003
Z21=53382+0118X1X4-13336X2X4-10388X2 0995 0000
Z22=-47796-2022X26+24226X6-0021X1X2+0074X23 0987 0010
Z3=1938-0002X1X5+0158X25-0689X5 0961 0011
表5 金铁锁最佳提取工艺验证结果
No
Y1
干膏率/%
浸出物/%
Y2
水
Y3
醋酸乙酯
Y4
乙醚
药效学指标
Z11
抗炎低剂量
Z12
抗炎高剂量
Z21
镇痛低剂量
Z22
镇痛高剂量
Z3
LD50±SLD50
1 44510 93431 0384 0070 432 321 264 171 16163±01180
2 43498 94350 0382 0072 329 357 223 160 16368±01392
3 44053 91969 0419 0063 495 246 199 208 15163±01191
RSD(%) 115 129 531 692 2002 1839 1437 1412
注:空白组数据:抗炎642±2658;镇痛270±531
同提取工艺条件所得金铁锁提取物均具有极显著的
抗炎作用,且各实验组间抗炎作用、镇痛作用和急性
毒性存在明显差异。验证实验表明,所得最佳提取
工艺条件结果较满意,重现性良好且适合工业生产。
反映了本研究的设计方法和技术路线是科学、合理、
必要和可行的。
采用了水平重复的U8(4
6)均匀表进行设计,同
时将其中的溶媒用量、提取时间取为相对水平,旨在
将不同提取方法安排在同一张均匀表中,有效减少
实验次数,获得对各因素间交互作用的统一认识。
验证结果表明,这种设计方法是科学、合理、可行的。
试图通过对提取物的水、醋酸乙酯和乙醚浸出
物与药效学指标的相关分析,奠定以浸出物对提取
物内在质量进行初步控制的基础。这种综合药效学
和浸出物指标对药材提取工艺条件进行优选的方
法,尚未见有报道。测定浸出物时,选择水、醋酸乙
酯和乙醚作为浸出溶剂,旨在发现和分析不同极性
溶剂的浸出物与毒性、药效之间的相关性,但实验结
果表明,这几种浸出物均不宜作为与功能主治有关
的质量控制指标,有待进一步深入研究。
急性毒性实验中发现,金铁锁各提取物灌胃对
小鼠胃肠道毒性较大,几乎所有死亡小鼠的胃肠道
都有不同程度的出血或充血现象,且高剂量组小鼠
死亡较快,而经皮给药的药效学实验中,肉眼均未观
察到小鼠胃肠道及其他器官的明显变化。提示金铁
锁应慎重选择给药途径和剂量,同时奠定了金铁锁
·9181·
第33卷第15期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 15
August,2008
提取物经皮给药系统的安全性基础。
实验发现,除了动物个体差异的影响,包括时间
在内的药理实验条件的差异对实验结果的影响也很
大。工艺优选及其验证的实验过程一般较长,因此,
在物质群基本稳定的情况下,应先制备样品,再统一
并同步安排包括空白对照组在内的药效学实验,以
减少实验数据误差,提高数据分析质量。
[参考文献]
[1] 贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准
[S].贵阳:贵州科技出版社,2003:247.
[2] 许建阳,王发强,郑维发,等.金铁锁水煎浸膏对实验性类风
湿关节痛镇痛作用的研究[J].武警医学,2003,14(10):589.
[3] 宋烈昌.金铁锁总皂苷的药理研究[J].云南植物研究,1981,
3(3):289.
[4] 浦湘渝,周 俊.金铁锁的一个新三萜成分[J].云南植物研
究,1987,9(3):369.
[5] 浦湘渝,周 俊.金铁锁皂甙的研究[J].云南植物研究,
1989,11(2):198.
[6] 钟惠民,倪 伟,华 燕,等.金铁锁的新三萜皂苷[J].云南
植物研究,2002,24(6):781.
[7] 钟惠民,华 燕,倪 伟,等.金铁锁的两个新三萜皂苷[J].
云南植物研究,2003,25(3):361.
[8] 丁中涛,汪有初,周 俊.金铁锁根中的环肽成分[J].云南植
物研究,2000,22(3):331.
[9] 丁中涛,周 俊,谭宁华.金铁锁中的四个环二肽[J].中草
药,2000,31(11):803.
[10] 方开泰,马长兴.正交与均匀实验设计[M].北京:科学出版
社,2001:247.
[11] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,
1993:112.
[12] 林亚平.中药制剂均匀试验设计微机软件的研制与应用[J].
中国中药杂志,1995,20(8):473.
Optimizationofextractionprocedureofpsammosilenetunicoidesby
uniformdesignwithpharmacodynamicindex
HUANGChunqing1,LINYaping2,JINFengyun1,ZHANGYongping1
(1.GuiYangColegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China;
2.GuizhouProvincceFoodandDrugAdministration,Guiyang550004,China)
[Abstract] Objective:Forantiinflammation,relievingpainanddecreasingacutetoxicity,thebestconditionforextracting
procedureofPsammosilenetunicoideswaschosen.Andtherelationshipsbetweenseveralsolventextractsandpharmacodynamicindex
werestudied.Method:Uniformdesignwithmultitargetswasusedintheoptimizationprocess,andtheevaluateindexweretheresults
ofantiinflammation,relievingpainandLD50wereemployedastheevaluatingindexes.Atthesametime,thecontentsoftheextracts,
waterextract,aceticesterextractandetherextractweredetermined.Result:Thebestconditionisthatthemedicinalmaterialisopti
mizedwith8timesofwater(pH67)and2hofeachtime.Thebestconditionissatisfactorybytestverification.Andthepharmacody
namicactionsofantiinflammation,relievingpainandLD50werenotobviouslyrelatedtothedryextracts,waterextract,aceticesterex
tractandetherextract.Conclusion:Uniformdesignmethodwithpharmacodynamicindexhasthemeritofbeingrelaatedtothefunction
andsymptomdirectly.Theextractedtwicetechnologyconditionoptimizedisstable,feasibleandsuitableforindustryproduction.And
itisnotsuitabletotakethesolventextractsasqualitycontrolindexrelatedtothefunctionandsymptom.
[Keywords] Psammosilenetunicoides;extracttechnologyprocedure;uniformdesign;pharmacodynamicindex;solventextracts
[责任编辑 鲍 雷
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
櫗
櫗
櫗
櫗
櫗
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
櫗
櫗
櫗
櫗
櫗
櫗
毉
毉
毉
毉
]
投稿请登录《中国中药杂志》网站:
www.cjcmm.com.cn;www.中国中药杂志.com
·0281·
第33卷第15期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 15
August,2008